UNIVERSITÉ DE GAFSA

Faculté des Sciences de Gafsa

Département SV

Fascicule de Travaux Dirigés et Pratiques

Protéomique, Métabolomique et
Applications

Section : licence appliquée en biotechnologie

expérimentale (LABE)

BIOTECH 3éme année

Elaboré par :
Dr. HADHRI Samira
Dr. KRIAA Mouna
Sous la direction de
Pr. MAKKI Ali

Année Universitaire : 2021/2022

Fascicules de TD/TP_Protéo-Métabolo & Applications_LABE 3
 SOMMAIRE

Ce fascicule de travaux dirigés et pratiques s’adresse aux étudiants de la troisième année en

licence appliquée en biotechnologie expérimentale (LABE) de la faculté des sciences de
Gafsa.

Programme des TD

- TD1 : Applications sur la détection de modification de profil de migration sur gel 2-D
puis les méthodes utilisées pour identifier une mutation au niveau de la protéine
modifiée.
- TD2 : Recherche de partenaires d’interaction d’une protéine puis identification de
peptides impliqués dans l’interaction et les utiliser pour la conception d’agents
thérapeutiques.

Programme des TP

- TP1 : Suivi par électrophorèse de la production de protéines de microorganismes et

l’effet des conditions du milieu (température) sur l’expression de protéome et la
détection de certaines protéines en particulier.
- TP2 : Visite d’un laboratoire d’analyses médicales.

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 CONSIGNES GÉNÉRALES

A/Sécurité
a- Tenue au laboratoire
- Chaque étudiant doit porter une blouse blanche, propre, faite dans un tissu au coton.
- La blouse doit être fermée par-dessus tous vêtements. Tout étudiant ne satisfaisant pas à
cette condition ne sera pas autorisé à manipuler.
- Par mesure de sécurité, les cheveux flottants sont formellement proscrits dans le
Laboratoire.
- Il est strictement interdit de courir dans le Laboratoire.
- Il est formellement interdit de fumer dans le Laboratoire qui contient toujours des produits
inflammables.
b- Produits dangereux
- Respecter les consignes de sécurité qui vous sont indiquées dans les protocoles
expérimentaux.
- Utiliser une pro pipette pour le prélèvement des produits dangereux (acides forts, bases
fortes, produits cancérigènes…).
- Faire très attention aux produits inflammables qui ne doivent jamais être manipulés au
voisinage d’une flamme mais exclusivement sous une hotte dont le ventilateur est en marche.
Ne jamais verser l’eau dans des acides concentrés. Ne jamais laisser le bec benzène ouvert
après usage.
B/ Manipulation
- Avant de venir aux séances de travaux pratiques, il est indispensable (et pour votre intérêt)
d’avoir bien lu et compris le principe et le protocole expérimental qui se trouvent consignés
dans le présent manuscrit.
- Les dosages biochimiques sont souvent très sensibles et concernent de très petites quantités
de réactifs, aussi il est nécessaire de travailler avec du matériel très propre.
- Ne pipetez pas directement dans les flacons dans lesquels on stocke les solutions.
- Les appareils qui sont mis à votre disposition pour la réalisation des T.P sont coûteux
(spectrophotocolorimètre, bain-marie, balance…), il convient d’en prendre le plus grand soin.
C/Techniques utilisées lors des manipulations
a- Centrifugation
Des particules en suspension ou certaines grosses molécules en solution peuvent être séparées
en fonction de leurs caractéristiques de sédimentation dans un champ gravitationnel. Ce
processus est accéléré par centrifugation.
Principe
Lorsqu’une molécule en suspension dans un liquide est soumise à un champ de forces
gravitationnelles elle se sédimente avec une vitesse V :
V = τ.d2 / µ (φp- φs).k
Avec :
τ : accélération exprimée en multiples de g,
d : diamètre de la particule assimilée à une sphère,
φp: densité de la particule (de 1 à 1.6 pour les particules biologiques)
φs : densité du solvant (1 pour les solvants aqueux)
k : constante de proportionnalité,
La vitesse de sédimentation des particules dans un champ gravitationnel donné permet de
définir pour chaque type de particule, un cœfficient de sédimentation S, qui est proportionnel,
entre autres à sa taille, exemple : ARN 23S, ARN 16S, ARN 5S.

b- Electrophorèse
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L’électrophorèse permet de séparer des molécules chargées électriquement en fonction de leur
charge ou de leur taille, selon leur vitesse de migration dans un champ électrique. Les
molécules chargées en solution sont déposées sur, ou dans un support imprégné d’une solution
saline conductrice.
- Principe
Quand une molécule (assimilée à une sphère) de charge Q et de rayon r est placée dans un
champ électrique d’intensité E, sur un support de viscosité h, elle est souvent mise à deux
forces opposées :
Une force motrice proportionnelle à Q et E
Une force de friction proportionnelle à r et h
Sa vitesse de déplacement sur le support peut donc être définie par la formule suivante :
V= k.E.Q / r.h
k : constante de proportionnalité
Une séparation des molécules en fonction de leur taille (r) peut être effectuée en favorisant, au
contraire, les forces de friction (r.h), la viscosité (h) du support d’électrophorèse est alors
augmentée et les différences de charges entre les molécules sont le plus souvent minimisées.
Dans ces conditions les molécules les plus petites se déplacent le plus rapidement dans le
support parce que les moins freinées.
- Utilisation de l’électrophorèse pour la séparation des protéines
Séparation des protéines en fonction de leur charge
L’ionisation des fonctions amine et carboxyle libres des protéines dépend du pH du tampon
dans lequel elles sont en solution. Le signe et l’intensité de la charge nette des protéines
dépendent donc de leur composition en acides aminés. Mais aussi de la valeur du pH par
rapport à leur point isoélectrique (pi=pH auquel la charge nette de la protéine est nulle).
Les protéines à séparer, en solution dans un tampon de pH déterminé sont déposés sur un
support imbibé de tampon, n’opposant qu’un minimum de résistance à leur déplacement
(papier filtre, acétate de cellulose…). Les différentes molécules se déplacent vers l’un ou
l’autre des pôles du support à des vitesses définies par leur densité de charge, tout en
conservant leur activité biologique puisqu’elles ne sont pas dénaturées.
En fin de migration, les protéines sont localisées sur le support par différents procédés :
coloration, autoradiographie, activité biologique…
Séparation des protéines en fonction de leur taille
Les protéines à séparer sont préalablement traitées avec du Dodécyl sulfate de sodium (SDS)
(petite molécule de détergent chargée négativement). L’association par des liaisons
hydrophobes de nombreuses molécules de SDS aux protéines à deux effets principaux :
Elle détruit leur structure tertiaire ainsi que leur structure quaternaire si celle-ci ne fait pas
intervenir de liaisons covalentes établies par des ponts disulfures.
Elle confère aux différentes protéines une densité de charge à peu prés égale et négative qui
masque la charge propre. Le support doit présenter une viscosité élevée à fin de ralentir la
migration des protéines en fonction de leur taille.

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 Partie I : Travaux dirigés
TDI :
I. Applications sur la détection de modification de profil de migration sur
gel 2-D
Exercice 1 :
Pour analyser des mélanges complexes de protéines, il est nécessaire de les séparer. Selon
quels critères on peut se baser ? Qu’elle est la méthode efficace qu’on peut l’appliquer ?
Quel est le principe de cette méthode ?
Les résultats de séparation de ces protéines sont illustrés dans la figure 1.
Nommer la figure 1
Interpréter les résultats.

Figure 1 :
A quelle étape les protéines doivent-elles être traitées par le SDS ?
Quel est le rôle de SDS ?

Exercice n 2 :
Deux souches de Staphylococcus aureus ont été cultivées, dans les mêmes conditions de
culture mais une en présence d’un antibiotique, la méthicilline, et l’autre en absence de cet
antibiotique.
La figure ci-dessous représente une partie de gel 2D comparant le profil des protéines
cellulaires extraites de souches de Staphylococcus aureus résistante et sensible à la
méthicilline.

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Figure : Une partie de gel 2D comparant le profil des protéines cellulaires extraites de
souches de Staphylococcus aureus résistante et sensible à la méthicilline.
1 : souche résistante
2 : souche sensible
A et B : protéines exprimées spécifiquement dans une des 2 souches ;
C : protéines sur ou sous exprimées selon la souche ;
* : protéines ayant un profil de migration différent entre les deux souches.
Analyser les deux profils électrophorétiques des deux souches de Staphylococcus aureus.

Exercice n 3 :
1- La première dimension de la 2D est l’éléctrofocalisation (IEF). Donner le principe.
2- Pourquoi le SDS est-il à proscrire pour réaliser l’IEF ? Quels sont ses effets sur une
protéine ?
3- Une protéine A, de pHi acide, comporte deux groupements d’acide carboxylique et
un groupement amine. Une protéine B, de pHi basique, comporte deux 2 groupements
d’acide carboxylique et un groupement amine.
- Quels sont les charges nettes de A et B lorsqu’ils sont placés en milieu neutre ?
- Dans un champ électrique, quel est le sens de migration de A et de B?
- On soumet à une électrophorèse à pH=6 un mélange d’acide L-glutamique, de L-Leucine et
de L-Lysine, dont les points isoélectriques sont respectivement 3,22, 5,99 et 9,74. Vers quels
pôles migrent ces acides aminés ?
4-Comment peut-on déterminer la masse molaire relative d’une protéine

II. Les méthodes utilisées pour identifier une mutation au niveau de la

protéine modifiée.
Exercice n 1 :
La protéine α 1-antitrypsine est importante pour la régulation par inhibition de l’activité de
plusieurs «sérine-protéases». En particulier lorsque l’α 1-antitrypsine est déficiente, la
limitation dans le poumon de l’activité de l’enzyme élastase n’est pas assurée et le
développement d’un emphysème pulmonaire est accéléré. La détection de l’anomalie
moléculaire devient alors nécessaire.
1- chez des patients emphysémateux, des chercheurs ont pu isoler des protéines anormales
« anti-enzymes » provoquées par des mutations faux-sens (substitution d’un aminoacide par
un autre). Les mutants isolés sont :
 mutant S: E(Glu) 264V (Val)
 mutant Z: E(Glu) 342K (Lys)
 mutant DRCW: V(Val) 213A (Ala)
 mutant Sarrebruck où une partie de la séquence est tronquée (suppression des 19 C-
terminaux des acides aminés).
2- Chacune des tâches («spot») correspondant à la protéine α1-antitrypsine type «sauvage» ou
aux différents mutants est soumise à une digestion par l’enzyme protéolytique trypsine.
3- Le fragment de la séquence entre les acides aminés 192 et 217 résultant de l’hydrolyse
trypsique est analysé par spectrométrie de masse (MALDI-TOF). L’hydrolyse par la trypsine
est ménagée, donc seules les coupures réactives se produisent. On obtient le spectre de masse
A pour le peptide trypsique dérivé du type «sauvage» et le spectre de masse B pour le peptide
trypsique dérivé du mutant DRCW (figure 1).

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 Figure 1 : Spectres de masse pour les peptides trypsiques dérivés du type sauvage (A) et du type
mutant DRCW (B).
Questions :
1. Quelle(s) technique(s) de séparation de protéines peut être appliquée sur le sérum du
patient pour mettre en évidence la mutation?
2. Indiquez le principe de la manipulation de digestion des spots par la trypsine.
3. Quel est la méthode utilisée pour le séquencage de ces differentes variantes de la proteine
étudiée, donner son principe.
4. Expliquez la différence de masse enregistrée.
5. Expliquez pour ce peptide le clivage obtenu par l’action de la trypsine

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 TD2 :
Recherche de partenaires d’interaction d’une protéine puis
identification de peptides impliqués dans l’interaction et les utiliser
pour la conception d’agents thérapeutiques

Exercice n°1 :
Des chercheurs ont réalisé des lysats protéiques de cortex de cerveaux de rats pour déterminer
les interactions possibles entre les protéines PSD-95, synaptophysine et BR12, dans le
système nerveux. Des immunoprécipitations ont été faites avec des anticorps murins dirigés
contre PSD-95 (figure 1) ou la synaptophysine (figure 2) liées à des billes couplées à des
protéines G. Un contrôle négatif à été réalisé en incubant les lysats avec des IgG de souris
liées à des billes couplées à des protéines G (NC). (IB : Immuno-Blot).

Questions :
1. Quelle est le principe de la méthode utilisée pour étudier les interactions entre les
protéines ?
2. Quel est le but de cette étude ?
3. Décrire et Interpréter les deux figures.
4. Conclure.

Exercice n° 2 :
Les protéines ribosomales L et S assurent de nombreuses fonctions qui permettent aux
ribosomes de traduire les informations transportées par l’ARNm. Chez les bactéries, les
protéines L12 ( gène rpIL) et L10 (rplJ) font partie des protéines ribosomales de la grande
sous-unité (50S). Il a été démontré que les facteurs d'élongation de la traduction (EF-G et EF-
Tu) se lient au domaine C-terminal de L12. Mais cette dernière doit interagir par sa partie N
terminale avec la l’extrémité C terminale de la proteine L10 pour la biosynthèse des protéines.
Ainsi la perturbation de l'interaction L12-L10 empêche la traduction (figure 1).

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 Figure 1 : Rôle de l’interaction des protéines ribosomales L12-L10 dans la stimulation de la
transcription du gène codant pour la synthèse de la β galactosidase
(Wang W et al. Identification of anti-Gram-negative bacteria agents targeting the interaction
between ribosomal proteins L12 and L10. Acta Pharm Sin B 2018;8:772-83).
Pour confirmer cette interaction chez Escherichia Coli (E coli), des chercheurs ont utilisé la
méthode de double hybride. Les résultats sont représentés dans la figure 2.

Figure 2 : Detection de l’interaction des proteines ribosomales L12-L10 par la methode de

double hybride. A gauche, la croissance des bactéries (expression de la β galactosidase)
exprimant diverses combinaisons de fusions BD (Binding domain) et AD (activating domain).
A droite, il s’agit de la combinaison des differents plasmides de la souche de levure étudiée
AH109. 1 et 6 représentent les controles positif et négatif, respectivement.
(Wang W et al. Identification of anti-Gram-negative bacteria agents targeting the interaction
between ribosomal proteins L12 and L10. Acta Pharm Sin B 2018;8:772-83).
Pour développer un agent anti bactérien (agent thérapeutique), les chercheurs ont
utilisé la même méthode (double hybride chez les levures). Ils ont identifié deux composants
(IMB-84 et IMB-87) qui inhibent l’interaction L12-L10 et par conséquent ils inhibent la
croissance bactérienne (figure 3).

Figure 3 : Identification des composants qui bloquent l'interaction L12-L10.

SD/Leu/Trp/Ade/His, YPD : milieux de culture.
Les deux composants (IMB-84 et IMB-87) ont été ajoutés avec une concentration de 25
μg/mL dans chaque puit.

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 (Wang W et al. Identification of anti-Gram-negative bacteria agents targeting the interaction
between ribosomal proteins L12 and L10. Acta Pharm Sin B 2018;8:772-83).

Questions:
1. Commenter la figure 1 et définir l’interactomique.
2. Interpréter les résultats de la figure 2. Donner le principe de la méthodologie utilisée.
3. Interpréter les résultats de la figure 3. Quel est le rôle de l’étude des interactions entre les
protéines cellulaires dans la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

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 Partie II : Travaux pratiques

- TPI : Suivi par électrophorèse de la production de protéines de

microorganismes et l’effet des conditions du milieu (température) sur
l’expression de protéome et la détection de certaines protéines en
particulier.
- TP2 : Visite d’un laboratoire d’analyses médicales.

Concepts généraux
- Protéome : L'ensemble des protéines exprimées par un génome à un moment précis
en réponse à un environnement donné (Wilkins et al., 1997).
- La protéomique : la science qui étudie l’ensemble de protéomes. Il s’agit de
l'ensemble des protéines exprimées par le génome d'une cellule, d'un tissu ou encore
d'un organe à un moment précis de son développement.
- Analyse protéomique ou analyse à grande échelle des protéines : permet de
caractériser et de quantifier les protéines dans des conditions déterminées.
Les méthodologies mises en œuvre pour l’analyse du protéome peuvent êtres séparées en
deux grands groupes :
- les méthodes expérimentales reposant principalement sur les techniques de séparation et
d’analyse des protéines.
- l’analyse d’images et la bio-informatique :
Les étapes de l’analyse protéomique
Les étapes principales de la Protéomique sont :
- 1. Préparation des échantillons,
- 2. Séparation des protéines (électrophorèse bidimensionnelle, Chromatographie
liquide…),
- 3. Détection et quantification des protéines et
- 4. Identification des protéines par spectrométrie de masse (voir figure si dessous).

Figure 1 : Les étapes de l’analyse protéomique [Proteomes 2020, 8(3), 14]

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Objectifs :
Escherichia coli (E coli) est un bacille à Gram négatif aérobie-anaérobie facultatif
appartenant à la famille des entérobactéries (Enterobacteriaceae) qui colonisent le tube
digestif de l’homme et des animaux. Cette bactérie vit dans un milieu ou toutes les conditions
sont favorables pour sa croissance. En cas de stress (par exemple élévation de la température
≥ 42 °C), E coli doit nécessairement s’adapter à son tour pour donner une réponse au choc
thermique et faire un maximum d’économie en développant des systèmes de régulation pour
contrôler cette période de carence et en synthétisant des protéines de stress.
La majorité des protéines de choc thermique (Hsps) sont des molécules chaperonnes
comprenant GroEL (Hsp70), GroES (Hsp10), et DnaK (Hsp60). Aussi E coli synthétise des
protéases et des facteurs de régulation.
Donc, nous allons étudier la réponse des bactéries Escherichia coli (K12) au choc thermique
en appliquant la protéomique.

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 Manipulation 1
Extraction des protéines à partir d’un microorganisme : E. coli
I. Principe de l’extraction des protéines :
L’extraction des protéines est une étape cruciale et impose un contrôle strict afin de
produire un échantillon de qualité et d’éviter les dégradations protéiques qui peuvent rendre
l’analyse spectrométrique qui en suit inutile.
L’extraction de protéines commence souvent par une lyse ou désintégration des cellules,
suivis d’une purification et d’un enrichissement spécifique et/ou de l’isolement d’une protéine
d’intérêt particulier.
La lyse cellulaire, est le processus de rupture de la paroi cellulaire pour libérer le contenu
intracellulaire contenant les protéines d’intérêt.
II. Protocole expérimental :
1. Travail demandé :
- Extraire des protéines à partir d’E coli.
- Déterminer la quantité des protéines extraite par spectrophotométrie.
2. Souche, Solutions et Réactifs :
La souche étudiée est une E. coli cultivé aux températures de 30 °C pendant 12 heures
(témoin) et 46° C pendant 30 min et 60 min
Le milieu de culture et les solutions sont stérilisés par autoclavage en cycle humide de 20 min
à 120°C.
- Le Milieu Luria Bertani (LB) liquide (pH =7,4): Ce milieu contient 5 g d’extrait de
levure; 10 g de peptone et 10 g de NaCl par litre d’eau distillée. Ce milieu est utilisé
pour la culture de la souche E. coli.
- Solution de lavage : HEPES 50mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesul-fonic
acid)
- Tampon de lyse : urée 8 M, CHAPS (détergent non ionique), 4% (p/v) et Tris-HCl
(pH 7,8, 40 mM).
3. Mode opératoire :
- On fait cultiver la souche E coli dans un tube à essai de 20 ml contenant 4 ml du
milieu de culture LB.
- On incube, par la suite, les tubes ensemencés dans un shaker rotatif à une agitation de
200 rpm et à une température de 37°C pendant 12 heures (témoin) et 46°C pendant 30
min et 60 min
- Après culture, on centrifuge le milieu de culture à 10 000 g, à 4 °C pendant 10 min.
- On fait laver le culot récupéré 3 fois successives avec 500 µl d’une solution de lavage
HEPES pour éliminer le reste des résidus de milieu de culture.
- On dissous la suspension obtenue dans 250 µl de tampon de lyse dans la glace pendant
30 minutes.
- On centrifuge la suspension à 10 000 g, à 4 °C pendant 10 min.
- On élimine le surnageant puis on remet en suspension le culot cellulaire dans 0,1 ml
de tampon de lyse
- Dans un bain de glace, la suspension obtenue est soniquée toutes les 20 secondes
pendant 3 fois et maintenue sous agitation pendant 1 heure à température ambiante
(figure 2).

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 Figure 2 : Schéma d’un sonificateur
- Après addition de 50µl de RNAase et 50µl de DNAase, on incube la suspension
cellulaire obtenue pendant 10 minutes dans la glace.
- On centrifuge la suspension à 20 000 g, à 4 °C pendant 10 min.
- On suspend le culot cellulaire dans l’eau bidistillée.
- Afin d’estimer la concentration des protéines, on fait une dilution de 1µl de
l’échantillon avec 800 µl d’eau distillée stérile puis on ajoute 200 µl de réactif de
Bradford. Après 5 minutes d’incubation, la DO à 595 nm est mesurée par
spectrophotométrie (on peut utiliser l’eau bidistillée pour le blanc).
- La quantité de protéines de chaque échantillon peut être déterminée à partir d’une
courbe de régression réalisée par la préparation d’une gamme étalon de protéine
standard (BSA) (des concentrations allant de 0 mg/ml à 2 mg/ml).
4. Interprétation des résultats :
- Dessiner la courbe d’étalonnage
- Après extraction, mesurer la DO des échantillons des suspensions protéiques obtenues
à 595 nm et estimer la quantité des protéines pour chaque échantillon.

Echantillon Témoin (37 °C) 46 °C pendant 30 46 °C pendant 60

min min
DO (595 nm)
Quantité de protéines
(mg/ml)

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 Manipulation 2
Séparation des protéines
I. Electrophorèse bidimensionnelle :
L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2DE) est une technique à base de gel largement
utilisée pour analyser la composition protéique des échantillons biologiques. Elle est capable
de résoudre des mélanges complexes contenant plus de mille composants protéiques en taches
protéiques individuelles par le couplage de deux techniques de séparation orthogonales : la
focalisation isoélectrique (première dimension) et l’électrophorèse SDS PAGE (deuxième
dimension).
-La focalisation isoélectrique utilise un gradient de pH formé dans le gel pour séparer les
protéines en fonction de leur pI.
-La SDS PAGE sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire lorsqu’elles
migrent à travers une matrice de gel de densité définie.

II. Identification des protéines après coloration des gels :

Les protéines sont généralement visualisées en colorant le gel avec des réactifs non
spécifiques, visibles, fluorescents ou absorbant les UV. Le bleu de Coomassie peut être
décoloré de manière réversible et est compatible avec la spectrométrie de masse, alors que la
coloration à l’argent n’est pas compatible en raison de l’utilisation de formaldéhyde ou de
glutaraldéhyde pendant l’étape de fixation et de sensibilisation qui entraîne une réticulation
des résidus de lysine dans la chaîne protéique interférant avec l’analyse par MS et entravant
ainsi la digestion de la trypsine.
Les protéines de chaque échantillon sont marquées de manière covalente avec des colorants
fluorescents de couleur différente. Les protéines qui sont communes aux échantillons
apparaissent comme des taches avec un rapport fixe de signaux fluorescents, alors que les
protéines qui diffèrent entre les échantillons ont des rapports de fluorescence différents.
L’aspect important de cette technologie est l’élimination de la variabilité entre les gels grâce
au multiplexage.

III. Travail demandé :

Séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle.
A. DIMENSION 1 : Séparation des protéines en fonction de la charge par focalisation
isoélectrique (FIE) :
1. Matériels et Réactifs:
- Bandelettes de gel d’acrylamide de 17cm, avec un gradient de PH 3-10 immobilisé
(Immobiline DryStrip gels Bio-Rad)
- Tampon de réhydratation (8 M urée, 50 mM dithiothreitol (DTT), 4% CHAPS, 0.2%
ampholyte, pH 3–10, et 0.0002% bleu de bromophénol)
2. Mode opératoire (figure 3):
- on fait pénétrer 50 µg (dissout dans 250µl de tampon de lyse) des protéines de l’échantillon
dans un gel d’acrylamide accolé à une fine languette de plastique : une bandelette (strip) de
pH 3–10 de longueur 7 cm (Readystrip IPG Strip, Bio-Rad), pour une réhydratation pendant
une nuit.
- On ajoute de l’huile minérale afin d’éviter tout phénomène d’évaporation.
- La focalisation isoélectrique sera effectuée à l’aide de l’appareil Protean IEF avec le
gradient tension/temps suivant : 100 V pendant 1 minute, 250 V pendant 30 minutes, 4 000 V
pendant 2 heures, et 4 000 V pour 10 000 V-h (V heure).

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Figure 3 : les étapes de séparation des protéines en fonction de la charge par focalisation
isoélectrique

DIMENSION 2 : Séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire par

électrophorèse (SDS-PAGE) :

1. Matériels et Réactifs:
 Tampon d’équilibration 1 (Urée 6M, SDS 2% P/V, glycérol 20% V/V, Tris-HCl 1,5M,
DTT 130mM, pH 7)
 Tampon d’équilibration 2 (Urée 6M, SDS 2% P/V, glycérol 20% V/V, Tris-HCl 1,5M,
iodoacétamide 135mM, .0002% bleu de bromophénol, pH 7,8)
 Tampon de migration (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3).
2. Mode opératoire :
- Avant de transférer la bande de gradient de pH immobilisé (IPG) sur la deuxième
dimension, il est nécessaire de l’équilibrer avec du tampon contenant du SDS. Une première
incubation de 10 minutes dans le tampon d’équilibration I permet de saturer le gel en SDS et
en agent réducteur (DTT). Puis une seconde incubation avec de l’iodoacétamide dans la
solution II d’équilibration (figure 4).

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Figure 4 : Equilibration des protéines avant le transfert de strip dans la deuxième dimension
- Après équilibration, on dépose les échantillons dans un gel de polyacrylamide à 12 %
(SDS-PAGE).
- La migration s’effectue dans le tampon de migration à 200 Volts pendant 55 minutes.
- Après migration électrophorétique, le gel est plongé dans une solution de coloration (bleu
de coomassie), ensuite, il est transféré dans une solution de décoloration. Le gel est stocké
dans de l’eau avec 20% d’éthanol, ce qui achève la décoloration et évite l’apparition de
bactéries (Figure 3).

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 Figure 5 : Les étapes de l’électrophorèse bidimensionnelle

IV. Interprétation des résultats :

Analyser les profils électrophorétiques de la figure 7, en rappelant de principe de la
methodologie utilisée.

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 Figure 6 : 2-D-Gels (coloration au bleu de coomassie)

Figure 7 : Une partie de gel 2D comparant le profil des protéines cellulaires extraites de souches d’E.
coli.
A : protéome de E coli incubé à 30°C (témoin)
B : protéome de E coli incubé à 46°C (pendant 30 minutes)
C : protéome de E coli incubé à 46°C (pendant 60 minutes)

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 Manipulation 3
Visite d’un laboratoire d’analyses médicales.
I. Définition et importance de la biochimie clinique :
La biochimie clinique est le domaine de la biologie médicale qui est en général concerné par
l'analyse des molécules contenues dans les fluides corporels (sang, liquide céphalo-rachidien
(LCR), urines, etc.) et l'interprétation des résultats de ces analyses par un biologiste médical
dans le but de caractériser l'origine physiopathologique d'une maladie. La biochimie clinique
se cantonne à la recherche ou au dosage des molécules pouvant être impliquées dans une
pathologie. Le travail du biologiste médical spécialisé en biochimie clinique consiste en
l'interprétation des résultats en fonction du reste du bilan biologique et avec l'aide du
clinicien. Cette interprétation prend en compte les caractéristiques physiologiques du patient
(âge, sexe, poids...) et les symptômes repérés par le clinicien dans le but d'aboutir avec lui (à
l'aide, si besoin, de tests supplémentaires) au diagnostic de la pathologie. Le dosage d’un
paramètre biochimique ne se limite pas seulement à rendre une valeur numérique, mais
consiste en une série d’étapes bien codifiées et minutieusement contrôlées allant du
prélèvement au rendu du résultat. Ce dernier doit être précis, pertinent et intégrés de façon
appropriée à la décision clinique.

II. Les différentes étapes d’une analyse biochimique :

L’analyse d’un paramètre biochimique passe par 3 phases :
- La phase pré-analytique : phase allant de la prescription à l’analyse.
- La phase analytique : phase de la réalisation manuelle ou sur un automate de l’analyse.
- La phase post-analytique : phase de validation, d’interprétation et de rendu du résultat.

III. Objectif de la séance :

Dans cette séance, nous visiterons un laboratoire d’analyse médicale (étatique ou privé).
Les buts de cette visite sont :
 Connaitre l’organisation générale d’un laboratoire (salles, consommables, équipement
biomédical, personnels…)
 Connaitre le circuit de chaque analyse biologique (Phase pré analytique, phase
analytique et phase post analytique)

Fascicules de TD/TP_Protéo-Métabolo & Applications_LABE 3

  Connaitre des principales analyses effectuées (Biochimie, hématologie,
microbiologie…), de l’équipement et des techniques utilisées.

IV. Travail demandé :

Rédiger un bref rapport de votre visite au laboratoire d’analyse médicale.

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