Année Universitaire 2022/2023

COURS DE BIOCHIMIE
Enzymologie Approfondie
SV6 Biologie Générale

Correction TD
Prof. Noureddine BOURHIM
Travaux dirigés

EXERCICE IV
L’hexokinase et la glucokinase sont deux isoenzymes du métabolisme des sucres. On se
propose d’étudier les caractéristiques cinétiques de ces deux enzymes vis à vis de leur
substrat commun ; le glucose. Les vitesses des réactions ont été mesurées pour des
concentrations différentes du glucose à 25°C et à pH=7. Les résultats obtenus sont
présentés au niveau du tableau I. La concentration en enzyme utilisée pour les deux séries
d’expériences est la même.

1/ Déterminer les paramètres cinétiques pour ces deux

enzymes. Comparer les deux paramètres cinétiques.
Quelles conclusions déduisez-vous ?

2/ Sachant que la concentration intracellulaire

hépatique de glucose est de 5 mM (glycémie normale) :
a- Calculer en pourcentage de Vmax, les vitesses
initiales des réactions catalysées par les deux
enzymes.

b- Quelle serait l’influence d’une augmentation importante de la glycémie?

c- Indiquer laquelle de ces deux enzymes est susceptible d’intervenir efficacement
en cas d’élévation de la concentration en glucose au-delà de 5 mM. Justifier votre
réponse.
3/ La cinétique de l’hexokinase en absence ou en présence du
glucose-6-phosphate (G-6-P) donne les résultats présentés sur la
figure 1 en représentation de Lineweaver-Burk. Interpréter ce
résultat
En présence de 5 mM G6P

Figure 1 : Effet du 1/V

Glucose-6-phosphate sur En absence du G6P
L’activité de l’hexokinase.

1/[Glucose]
 Vmax

GLUCOKINASE
V µM/min

Vmax/2

Vmax
Vmax/2
HEXOKINASE

Km
Km [Glucose] mM
 HEXOKINASE
𝟏
𝒗 𝝁𝑴!𝟏 . 𝒎𝒊𝒏 𝟏
𝑽𝒎𝒂𝒙

𝟏
𝑽𝒎𝒂𝒙
GLUCOKINASE

𝟏
- 𝟏 𝟏
𝑲𝒎 -
𝑲𝒎 𝐆𝐥𝐮𝐜𝐨𝐬𝐞 𝐦𝐌!𝟏
Glucokinase : Km = 9,470 mM;
Vmax = 4,810 µM/min.
Hexokinase : Km = 5,1 mM
Vmax = 0,984 µM/min.
On doit donc comparer les efficacité catalytique c’est à dire le rapport
k2/Km .
Et, on obtient en faisant le rapport:
Glucokinase Hexokinase
𝐕𝐦𝐚𝐱 𝐕𝐦𝐚𝐱
= 𝟎, 𝟓𝟎 (é𝐟𝐟𝐢𝐜𝐚𝐜𝐢𝐭𝐞 𝐜𝐚𝐥𝐚𝐥𝐲𝐭𝐢𝐪𝐮𝐞) = 𝟎, 𝟏𝟗(é𝐟𝐟𝐢𝐜𝐚𝐜𝐢𝐭𝐞 𝐜𝐚𝐥𝐚𝐥𝐲𝐭𝐢𝐪𝐮𝐞)
𝐊𝐦 𝐊𝐦

Lorsque ce rapport k2/Km augmente enzyme efficace et rapide, donc la

glucokinase est plus efficace et plus rapide que l’hexokinase.
2/ L’hexokinase présente plus d’affinité pour le substrat (glucose)
que la glucokinase, car son Km est plus petit par rapport à celui de la
glucokinase.

Néanmoins, la vitesse maximale de la glucokinase est supérieure à

celle de de l'hexokinase.

Le fait que le rapport Vmax/Km de l'hexokinase (0,19) est inférieur à

celui de la glucokinase (0,50); montre que L'hexokinase est une
enzyme relativement peu spécifique que l'on trouve dans toutes les
cellules et qui catalyse la phosphorylation d'hexoses comme le D-
glucose, le D-mannose et le D-fructose.

Elle déclenche la glycolyse (forte affinité pour le glucose).

Pour calculer le pourcentage de Vmax il suffit
de trouver la valeur qui correspond à la
vitesse au niveau de la glycémie normale c’est
à dire 5 mM et faire la règle de 3 par exemple :
pour la glucokinase au niveau de la
représentation de v en fonction du [Glucose]:
La Vmax = 4,810 µM/min correspond à 100% et
pour une concentration de glucose à 5 mM
nous avons vi=1,7 µM/min et donc;
x= 1,7x100/4,810= 35%.
 Vmax

GLUCOKINASE
V µM/min

Vmax
HEXOKINASE

[Glucose] mM
2/ Avec une glycémie égale à 5 mM,

la glucokinase est à 35% de son Vmax.

L'hexokinase est à 51% de son Vmax.

A une glycémie supérieure à 5 mM (exemple 20 mM),

la glucokinase est à 66% de son Vmax.

l'hexokinase est proche de son Vmax 81% de son Vmax.

Dans une réaction enzymatique pour que Vmax soit atteinte, il faut
que [S] >> Km. Ce n’est pas le cas ici, faisant penser au
fonctionnent 'au ralenti' des enzymes dans les conditions
physiologiques.

Si la glycémie augmente de manière importante, la vitesse des

enzymes augmentera pour se rapprocher de Vmax (phosphorylation
accélérée). De plus, le Km de la glucokinase vis-à-vis du glucose est
élevé.

Donc, elle n'agit de manière significative que lorsque le taux de

glucose intracellulaire est augmenté. Contrairement l'hexokinase
est adaptée au besoin des tissus périphériques se résumant dans la
capture au maximum de molécules de glucose plasmatique pour
pouvoir s'en servir comme substrat énergétique via la glycolyse,
contrairement au foie qui possède la glucokinase, enzyme adaptée
à ses besoins notamment la synthèse du glycogène.
 Glucose Inhibition non compétitive
Glucose-6-Phosphate

En présence de 5 mM G6P

Hexokinase 1/V

𝟏
𝐕𝐦𝐚𝐱𝐚𝐩𝐩
Le glucose-6-Phosphate
joue le rôle d’Inhibiteur En absence du G6P
𝟏
non compétitif vis à vis -
du glucose au niveau de 𝑲𝐦 𝟏
l’hexokinase, Mais pas au 𝐕𝐦𝐚𝐱
niveau de la glucokinase. 1/[Glucose]
3/ Le glucose-6-phosphate est un inhibiteur de
l'hexokinase (Inhibiteur non compétitif), qui se fixe avec
la même affinité à la fois sur l'enzyme libre et l'enzyme
complexée avec le glucose.

Comme le G-6-P est un produit de la réaction de

phosphorylation du glucose, ce composé joue le rôle d'un
régulateur de l'activité de l’enzyme (retro-inhibiteur).

GLUCOKINASE
Travaux dirigés

EXERCICE V
 I/ La protéase du SARS-CoV-2 (Covid-19) joue un rôle essentiel dans
l’infection par ce virus. Cette protéase utilise comme substrat une
polyprotéine. Cette polyprotéine, inactive, ne peut conduire à la formation
de particules virales nouvelles en absence de protéase active. La
recherche d’inhibiteurs (anti -protéase) qui freinent la multiplication du
virus et diminue la charge virale chez les personnes infectées, les résidus
d’acides aminés de la protéase du SARS-CoV-2 dans la catalyse ont été
identifiés, et le mécanisme catalytique a été élucidé. C’est l’objet de
l’étude présentée ici :
Afin de mettre en évidence les résidus d’acides aminés impliqués dans
l’activité, on a étudié l’hydrolyse du dipeptide (N--acétyl--L--phénylalaninyl-
-L--phénylalanine--amide) par la protéase du SARS-CoV-2 en fonction du
pH. Les résultats sont montrés dans la figure suivante :
1/ Discuter l’effet du pH sur l’activité enzymatique et donnez la
signification de cette courbe en cloche.

2/ À l’aide la représentation de Dixon, identifiez les « pK » des acides

aminés impliqués dans l’activité de la protéase du SARS-CoV-2.
3/ Dans quelle forme de la protéase du SARS-CoV-2 (enzyme libre ou
complexée) ces résidus d’acides aminés interviennent--ils ?
 1/ Discuter l’effet du pH sur l’activité enzymatique et donnez la
signification de cette courbe en cloche.

Les enzymes sont des protéines composées d’acides amines

qui peuvent être protonés et déprotonés suivant le pH du
milieu de la réaction.
L’effet du pH est lié à l’état d’ionisation des groupes
dissociables intervenant dans la stabilité de la structures
tridimensionnelle de la protéine et des acides aminés du site
actif.
Les pH extrêmes inferieures à 2 ou supérieures à 11
provoquent la dénaturation de la protéine d’une manière
irréversible pour quelques secondes, on les appelles les pH
d’arrêts.
L’activité de toutes les enzymes varie en fonction du pH, elle
présente en général un maximum pour un certain pH qu’on
 𝑽𝒎𝒂𝒙
𝑲𝒎
𝑳𝒐𝒈

pK1 pK2

𝒑𝑯
ENZYME LIBRE [E]
𝑳𝒐𝒈 𝑉𝑚𝑎𝑥

pK1 pK2

𝒑𝑯 ENZYME LIÉE [ES]

2/ À l’aide la représentation de Dixon, identifiez les « pK » des
acides aminés impliqués dans l’activité de la protéase du SARS-
CoV-2.

Log k2

pK= 2,7 pK= 3,9

pH
3/ Dans quelle forme de la protéase du SARS-CoV-2 (enzyme libre
ou complexée) ces résidus d’acides aminés interviennent--ils ?

Les acides aminés identifies participent dans

l’interaction de l’enzyme avec le substrat, donc c’est
sous forme complexée, puisque nous avons avons
déterminés les pk des acides aminés impliqués dans
l’interaction en utilisant la représentation de Dixon
Log Vmax en fonction du pH.

Forme liée ES
Travaux dirigés

EXERCICE VI
La lactate déshydrogénase catalyse la réduction réversible du pyruvate en
lactate :
PYRUVATE + NADH + H+ D LACTATE + NAD+
Les vitesses initiales de la réaction sont déterminées pour différentes
concentrations [S]0 de pyruvate. La concentration du NADH est constante
et égale à 5,4 10-4 M et KMNADH = 5,4 10-5 M.
On suit la disparition du NADH à λ = 340 nm en fonction du temps.

[S]0 (mM) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1 2 3 4 5 9

vi (U.A.min-1) 0,075 0,125 0,157 0,180 0,200 0,212 0,232 0,250 0,270 0,270 0,250 0,240 0,190

1/ Tracez la courbe de saturation et commentez l'allure.

2/ Déterminez tous les paramètres cinétiques de cette réaction.
3/ Expliquez ce mécanisme.
Données : εMNADH = 6220 M-1.cm-1 ; U.A. = unité d'absorbance
 Vmax Inhibition par
excès de substrat

Vi (U.A.min-1)

[S]0 mM
Vmax Inhibition par excès
de substrat
v0

[S]
 KS !!"# .[$]
Km
𝑣= ["]
&!'[$]()' )
$!
 ! ! $$ ! [&]
"
=# + ×
#$%& [&]
+ $'.#)*+
$%&

! ! $$ ! ! ! [&]
"
=# + ×
#$%& [&]
=# +
$%& " $%& $'.#)*+

Cinétique Michaelienne
on représente 1/v en
On représente 1/v en
Fonction de 1/[S].
fonction du substrat!!!!.
 $ $ '' $ [)]
Inhibition par excès = + × +
% &'() &'() [)] '*.&!"#
de substrat
Pour [S]élevée

1
𝑣 Cinétique Michaelienne
Pour [S]faible

1
𝑉𝑚𝑎𝑥

( 1 1
- [𝑆]
 Représentation
1 de Linweaver et Burk
𝑣

𝑆 mM
La forme de la courbe de saturation est
caractéristique d'une inhibition par excès de
substrat :

l'incurvation de la courbe de saturation a lieu pour

[pyruvate]0 = 4 mM >> [NADH]0 = 0,54 mM.

Il y a compétition entre les 2 substrats et on

remarquera la formation d’un nouveaucomplexe
[pyruvate - E - pyruvate] au lieu de [pyruvate - E -
NADH].
 Cas de l’inhibition
Cas Normal par excès de substrat

H+

vate
vate
vate

DH,

u
u
u

Pyr
Pyr
Pyr

NA

[pyruvate]0 = 4 mM >> [NADH]0 = 0,54 mM

Vmax = 0,34 UA.min-1 qu’il faudra
transformer en mole on divisant par le
coefficient d’extinction molaire, qui
représente 6220 M-1.cm-1, ainsi on a :
0,34/6220

Vmax= 55 µmoles NADH oxydées.min-1

KMpyruvate = 0,36 mM
 ( ( [+]
= +
1 ) *!"# ,$.*./0

𝑣
$
%$.'()*

1
𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑆 ‼‼‼‼!
−𝐾𝑠
1
𝑣

l
l

−𝐾𝑠
K = 3 mM 𝑆 mM
Travaux dirigés

EXERCICE I
TD 2
Travaux dirigés
EXERCICE I

Une enzyme catalyse une réaction à deux substrats :

X+YDP+Q
Afin de déterminer le mécanisme réactionnel de cette enzyme, on
a mesuré la vitesse initiale de la réaction pour différentes
concentrations de l'un des substrats (X) en maintenant fixe la
concentration de l'autre substrat (Y), et inversement.

Y (mM)
X (mM)

3 5 10

0,33 0,017 0,025 0,039

0,67 0,024 0,033 0,038

5 0,034 0,040 0,061

Travaux dirigés

1/ En n'utilisant les deux représentations primaires

(fournies) et à l’aide des représentations secondaires (à
faire), déterminer les paramètres cinétiques et en
déduire le mécanisme réactionnel.

2/ Représentez le mécanisme de la réaction selon

Cleland.

3/ Si la concertation de l’enzyme de 5x10-9 M, calculer

l’activité moléculaire de l’enzyme et donnez la
signification biologique de cette constante.
Deux représentations différentes, donc il s’agit
d’un mécanisme bi-bi ordonné.
Représentation secondaires
1/Vmaxapp

1/Vmax = 3 Vmax = 0,3 µM/min

-1/KY 1/[Y]

0,05 KY = 20 mM
Représentation secondaires
Pente

-1/KX 1/[X]

1,68 KX = 0,6 mM
 2/ Représentez le mécanisme de la réaction selon Cleland.
Si on compare les constantes on remarque que KX est inférieur à
KY par conséquent le substrat X se fixera obligatoirement avant le
substrat Y. La libération des produits se fera également selon un
ordre bien défini, c’est à dire le produit P sera issu de Y et le
produit Q sera issu de X.

X Y P Q

E E-X EXY ⇋ EPQ E-Q E

Chemin réactionnel selon Cleland:

3/ Si la concertation de l’enzyme de 5x10-9 M, calculer l’activité
moléculaire de l’enzyme et donnez sa signification biologique.

Détermination de k catalytique, on a:
Vmax = 0,3 μM.min-1
Et on sait que Vmax = k2.[E]0
𝑽𝒎𝒂𝒙
Donc, 𝒌𝟐 = 𝑬 𝟎
𝟎, 𝟑𝒙𝟏𝟎'𝟔
𝒌𝟐 =
𝟓𝒙𝟏𝟎'𝟗

Donc, kcat= 60 min-1

Travaux dirigés

EXERCICE II
EXERCICE II

On étudie la cinétique d’action de la malonyl-

transacylase qui catalyse.

Malonyl-COA + ACP ⇋ malonyl-ACP + CoA – SH

On suit la réaction par comptage radioactif en

utilisant la malonyl-COA marqué et on suit
l’incorporation de la radioactivité sur l’ACP, le tableau
suivant donne la vitesse en nanomoles de malonyl
transférées par minutes quand l’expérience à lieu dans
0,2 ml pour une concentration d’enzyme de 5,98 x10-10
mol/L.
 [ACP] (µM) 12,5 25 75
[Malonyl-CoA]
(µM)
12,5 0,2 0,28 0,38
25 0,25 0,40 0,60
40 0,29 0,465 0,83
50 0,29 0,50 0,93
60 0,30 0,52 1,01

- Déterminer le mécanisme d’interaction de l’enzyme pour le

substrat.
- Calculer les paramètres cinétiques pour les 2 substrats et
calculer kcat.
- Proposer le mécanisme réactionnel selon la représentation de
Cleland.
1/V
A 1/Vmaxapp [ACP] B
[M-CoA] 1/V
1/Vmaxapp

1/[ACP] 1/ [M-CoA]
Représentations primaires parallèles, donc on est en
présence d’u mécanisme Ping-Pong
1/ Représentations secondaires:
Pour la figure A, On trace les 1/Vmaxapp en fonction du [M-CoA] et
pour la figure B on trace les 1/Vmaxapp en fonction de [ACP]

1/Vmaxapp 1/Vmaxapp

1/Vmax Vmax 1/Vmax Vmax

1/[M-CoA] 1/[ACP]
-1/KM-CoA KM-CoA -1/KACP KACP
Les représentations secondaires permettent de
déterminer les constantes cinétiques.

Ainsi, nous avons:

Vmax =11,1nmoles/min/0,2 ml

=55500 nmol/l/min

= 55,5 µM/min

Vmax= 55,5 µM/min

Détermination de k catalytique
On sait que Vmax = k2.[E]0

𝑽𝒎𝒂𝒙
Donc 𝒌𝟐 =
𝑬 𝟎
𝟓𝟓, 𝟓𝒙𝟏𝟎*𝟔
𝒌𝟐 =
𝟓, 𝟗𝟖𝒙𝟏𝟎*𝟏𝟎

Donc kcat= 92809 min-1

ou bien en seconde:

kcat=1546 sec-1
Les constantes d’affinités déterminées à
partir des représentations secondaires sont:

KM-CoA= 290 µM

KACP = 400 µM

On constate que le KM-CoA< KACP

Par conséquent, le M-CoA se fixera en premier

Chemin réactionnel selon Cleland:

M-CoA CoA-SH ACP Malonyl-ACP

E E-M-CoA F-Malonyl F-Malonyl-ACP

E

Malonyl-COA + ACP D malonyl-ACP + CoA – SH

Travaux dirigés

EXERCICE III
EXERCICE III
On étudie le comportement de glutamate déshydrogénase de levure
Glutamate + NADP+ D a-cétoglutarate + NH3 + NADPH + H+

On étudie la réaction de gauche vers la droite en la démarrant

avec le mélange E + NADP+. Les vitesses initiales sont mesurées
par l’apparition de NADPH par spectrophotométrie à 340 nm. On
opère dans chaque cas avec 0,2 ml de substrat contenant 5,2 µg
d’enzyme.

Le tableau suivant donne la vitesse en µmole de NADPH/µg

d’enzyme/min.

Déterminer les paramètres cinétiques et proposer le mécanisme

réactionnel selon Cleland.
Tableau
GLU mM 5 10 20 50 100

NADP+ mM

0,05 9,70 x10-3 1,68 x10-2 2,5 x10-2 4,08 x10-2 6,25 x10-2

0, 062 1,16 x10-2 2,00x10-2 2,98 x10-2 4,76 x10-2 7,41x10-2

0,083 1,43 x10-2 2,47x10-2 3,64 x10-2 5,71 x10-2 8,69x10-2

0,125 1,89 x10-2 3,17x10-2 4,76 x10-2 7,14 x10-2 1,05x10-1

0,25 2,86 x10-2 4,55x10-2 6,45 x10-2 1,00 x10-1 1,33x10-1

1 4,17 x10-2 6,67x10-2 9,09 x10-2 1,10 x10-1 1,54x10-1

1/V [NADP+]
1/V [Glu]

1/[GLU] 1/[NADP+]

Représentations primaires de 1/V en fonction de 1/[Glu]

et de 1/V en fonction de 1/[NADP+].
Deux représentations identiques par conséquent, c’est
un mécanisme bi-bi aléatoire.

Pour répondre à la question suivante :

Est ce que c’est un mécanisme bi-bi aléatoire dépendant

ou indépendant?

On réalise les représentations secondaires, à partir de

1/Vmaxapp et des pentes des représentations primaires.
 1/ Représentations secondaires de 1/Vmaxapp

1/Vmaxapp
1/Vmaxapp

Vmax = 0,2 µmol/min/mg de protéines

1/Vmax 1/Vmax

-1/K’[NADP+] 1/[NADP+] -1/K’[Glu] 1/[Glu]

K’NADP+ = 0,082 µM K’Glu = 11,90 mM

1/ Représentations secondaires de Pentes

Pentes Pentes

-1/K[NADP+] 1/[NADP+] -1/K[Glu] 1/[Glu]

KNADP+ = 0,29 mM KGlu = 50 mM

Travaux dirigés

Si on compare les K et K’ on constate que

K¹K’, par conséquent, il s’agit d’un
mécanisme bi-bi aléatoire dépendant.
Chemin réactionnel selon Cleland:
Glu NADP+ NADPH,H+ a-cétoglutarate

E-Glu E-a--CG

E-NADP+
E-Glu-NADP+ E-NADPH,H+-a-cétoglutarate E-NADPH,H+

a-cétoglutarate NADPH,H+
NADP+ Glu
Travaux dirigés

EXERCICE IV
EXERCICE IV
Une enzyme catalyse une réaction entre deux substrats A et B:

A+B DC+D
Afin de déterminer le schéma cinétique de la réaction, on a
mesuré les vitesses initiales de la réaction en présence de
concentrations variables des substrats. Les résultats suivants
ont été obtenus :

A 0,1 0,2 0,5 1 2

B

0,1 0,05 0,10 0,21 0,33 0,46

0,2 0,09 0,16 0,30 0,43 0,55
0,5 0,14 0,24 0,40 0,52 0,62
1 0,17 0,28 0,45 0,57 0,65
2 0,20 0,31 0,48 0,59 0,66
 A et B sont exprimés en absorbance à 357 nm et les
vitesses sont exprimées en variation d’absorbance
(DDO) à 357 nm par minutes. Les coefficients
d’extinction molaire à 357 nm pour les différents corps
sont les suivants : A : 1350 ; B : 225 ; C : 720 ; D : 1830.
a. Déterminer le mécanisme de la réaction

a. Déterminer les constances cinétiques de cette réaction

a. Représenter le mécanisme réaction en utilisant la

représentation de Cleland.
 1/V 1/V
[A] [B]

1/[B] 1/[A]

Représentations primaires de 1/V en fonction de 1/[A]

et de 1/V en fonction de 1/[B].
Deux représentations différentes par conséquent,
c’est un mécanisme ordonné ou séquencé.
Pour déterminer les paramètres cinétiques on réalise
les représentations secondaires.
Dans cet exercice on ne peut pas déterminer les Vmax
apparent de la représentation primaire de 1/v en
fonction de 1/B puisque toutes les droites convergent
vers le Vmax de la réaction.
Dans ce cas on trace directement les pentes de cette
représentation et on détermine la constate
d’équilibre K.
L’équation de vitesse de ce mécanisme est la
suivante :
 𝒌𝟐 𝑬 𝟎
𝒗=
𝑲𝑩 𝑲𝑨×𝑲𝑩
𝟏+ +
[𝑩] 𝑨 [𝑩]
1/ Représentations secondaires de la pente et de 1/Vmaxapp

Pentes 1/Vmaxapp

Vmax = 1,32.10-5 M/sec

1/Vmax

-1/KA 1/[A] -1/KB 1/[B]

KA = 3.10-4 M KB = 1,1.10-3 M
Les calculs pour la détermination de Vmax de la réaction :

On sait que dans la présente étude nous avons les vitesses qui
sont exprimées en variations de DO c’est à dire DDO.

Nous savons aussi que la loi de Beer-Lambert :

DO = e.C.l
Si on a variation de DO on aura la relation suivante :

DDORéaction = DO(ep.C.l)Produit – DO(es.C.l)substrat

= (Seproduit - Sesubstrat).C.l
Donc,
∆𝑫𝑶
𝒄=
[𝚺ℇ𝒑 − 𝚺ℇ𝒔 ]×𝒍

Donc pour transformer la variation de DO en molaire, on

doit diviser par la somme des e des produits moins la
somme des e des substrats, ainsi on obtient :

𝚺ℇ𝒑 − 𝚺ℇ𝒔 = 𝟕𝟐𝟎 + 𝟏𝟖𝟑𝟎 − 𝟏𝟑𝟓𝟎 + 𝟐𝟐𝟓 = 𝟗𝟕𝟓 𝑴'𝟏 . 𝒄𝒎'𝟏

Au niveau de la représentation nous avons obtenus la

valeur suivante :
 𝟎,𝟕𝟕
Vmax= 0,77 DDO/min = = 𝟏, 𝟑𝟐. 𝟏𝟎(𝟓 𝑴/𝒔𝒆𝒄
𝟗𝟕𝟓×𝟔𝟎

SCHÉMA DU MÉCANISME RÉACTIONNEL SELON CLELAND

Le substrat A se fixe en premier car il un de l’ordre de

KA = 3.10-4 M et ensuite le substrat B avec un KB =
1,1.10-3 M car KA<KB. Ensuite, la libération des produits
se fera selon la règle du « Dernier fixé, premier
libéré » par conséquent le produit C sera
obligatoirement issu de B.

A +B ⇋ C+D
Chemin réactionnel selon Cleland:

A B C D

E EA EAB ⇋ ECD ED E
Travaux dirigés

CORRECTION EXAMEN 2021/2022

Travaux dirigés

EXERCICE I DE L’EXAMEN
I/On étudie le mécanisme catalytique de la glycogène
phosphorylase (2 µg et PM 500000) en mesurant les vitesses
initiales de la réaction pour différentes concentrations des 2
substrats (le glycogène et le phosphate).

Glycogène phosphorylase

Glycogène (n+1) Phosphate a-D-Glucose-1-P Glycogène (n)

Les résultats, en µmoles de glucose-1-phosphate/min/mg de

glycogène phosphorylase, sont les suivants :
[Phosphate] [glycogène] (mg/mL)
(10-3M)
3,2 8 16 24 48

6 12 18 21 23 25

15 24 35 43 46 49

30 35 53 64 68 74

45 43 64 71 82 88

60 47 71 85 91 98

Les représentations primaires pour cette réaction sont données

ci-dessous :
1/ En utilisant les deux représentations primaires ci-jointes et à
l’aide des représentations secondaires (à réaliser), déterminer
les paramètres cinétiques et en déduire le mécanisme
réactionnel.
2/ Représentez le mécanisme de la réaction selon Cleland.

3/ Calculer l’activité moléculaire de l’enzyme et expliquer sa

signification biologique.
Les représentations des 1/V en fonction de l'inverse des substrats
1/[A] OU 1/[B], la concentration de l'autre étant maintenue
constante, sont linéaires. On les appelle les représentations
primaires. Les droites obtenues dans une représentation primaire
sont identiques dans un mécanisme bibi aléatoire. Pour déterminer les
constantes et vérifier si le mécanisme est dépendant ou indépendant
on réalise les représentations secondaires.

1/Vmaxapp en fonction de 1/[Phosphate]

1/Vmaxapp en fonction de 1/[Glycogène]

Pour déterminer les K’ et la vitesse maximale de la

réaction.
 𝟏
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟔 𝛍𝒎𝒐𝒍/𝒎𝒊𝒏/𝐦𝐠
𝑽𝒎𝒂𝒙

𝟏
− = −𝟎, 𝟎𝟑𝟑 𝒎𝑴*𝟏
𝑲′𝒑𝒉𝒐𝒔𝒑𝒉𝒂𝒕𝒆
 𝟏
= 𝟎, 𝟎𝟎𝟔 𝛍𝒎𝒐𝒍/𝒎𝒊𝒏/𝐦𝐠
𝑽𝒎𝒂𝒙

𝟏
− = −𝟎, 𝟐𝟓 𝒎𝒈*𝟏 . 𝒎𝒍
𝑲′
Les Pentes en fonction de 1/[Phosphate]

Les Pentes en fonction de 1/[Glycogène]

Pour déterminer les K de la réaction.

Pente

𝟏
−
𝑲𝒑𝒉𝒐𝒔𝒑𝒉𝒂𝒕𝒆
Pente

𝟏
−
𝑲′𝒈𝒍𝒚𝒄𝒐𝒈è𝒏𝒆
Vmax ≈ 167 µmoles/min

K’ phosphate ≈ 30 mM
K’glycogène = 4 mg/ml
Kphosphate ≈ 30 mM
Kglycogène = 4 mg/ml

Kphosphate = K’phosphate et Kglycogène = K’glycogène

Mécanisme Bi-Bi aléatoire Indépendant

 a-D-Glucose-1-P Glycogène
Glycogène Phosphate

E
E-Glycogène-Phosphate E-Glycogène1P-Glycogène
E

Phosphate Glycogène
Glycogène a-D-Glucose-1-P
Activité moléculaire kcat
Vmax ≈ 167 µmoles/min

𝑽𝒎𝒂𝒙 𝟏𝟔𝟕𝒙𝟏𝟎_𝟔
𝒌𝟐= = = 41,75.106/min
𝑬 𝟎 𝟒.𝟏𝟎K𝟏𝟐
'
𝟔
𝒎 𝟐.𝟏𝟎
𝒏= = = 4.10-12 moles
𝑴 𝟓𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎

Donc, kcat = 41,75.1012 min-1

Signification biologique:
En une minute une d’enzyme transforme 41,75x1012 moles de substrats.
Travaux dirigés

EXERCICE II DE L’EXAMEN
II/ On considère l’enzyme tétramérique composées de 4
sous-unités distinctes et indépendantes non coopératives.
Chaque sous unité contient un site actif.

1/ Donner toutes les possibilités de fixation du

substrat sur les quatre sous- unités .

2/ En déduire l’équation de vitesse pour une S S

enzyme tétramérique.
S S
3/Donner l’équation générale pour une enzyme avec n sous-
unités.