Cours 1 – Méthodologies de recherche

1. Culture cellulaire (in vitro)

Procédés à croître cell isolées de l’organisme

 Découvertes

- Cell facilement obtenues/↑ qt

- Maj cultures à 1 seul type de cell
- Étude activités cell : endocytose, mouv/division cell, trafic memb, synthèse mol
- Cell à différenciables en culture (ex. HeLa)
- Réponse à traitements : meds, hormones, facteurs croissance
- Éviter utilisation animaux vivants

 Aspects importants

- Milieu cultivation à nutriments/vit/hormones/facteurs croissance/cofacteurs

isolés de lymphe/sérum sang/homogénat embryon = viabilité & prolifération
- Croissance dans conditions env spécifiques à T°c & CO2
- Cultures à conditions stériles  éviter contamination par microorganismes
- Obtention cell
o Cultures primaires : prélevées de l’animal (embryon)
 Dissociation dans trypsine à digère domaines extracell des
protéines d’adhérence cell
o Cultures secondaires : cell déjà cultivées/congelées (azote liquide)
- Méthodes de cultivation; sous-cultivation régulière à éviter sénescence/mort
o En suspension : cell tumorales/immortelles
o Boites de pétri : cell tumorales et normales
- Temps de cultivation
o Cell normales : division limitée avant mort
o Cell tumorales : cultivation illimitée (ex. HeLa)
o Lignées cell à croître indéfiniment après modification génétique

 Propriétés de différenciation des cell animales/végétales en culture

- Fibroblastes : continuent sécrétion collagène

- Myoblastes : fusion/formation fibres musc à contractent spontanément dans
pétri (musc squel embryonnaires)
- Cell souches neuronales : formation prolongements axonaux électriquement
excitables + synapses avec autres cell
- Cell souches épithéliales : formation feuillets extensifs à conservent propriétés
d’un épithélium intact
  Production d’anticorps

Anticorps détectent protéines spécifiques parmi types peptidiques que cell peut produire

1) Polyclonaux
- Animaux inoculés avec protéine
- Anticorps de protéine à isolés à partir sérum de l’animal
- Qt limitée obtenue : mélange hétérogène d’anticorps  reconnaissent plsrs sites
antigéniques de mm protéine; anticorps spécifiques à antigène à % anticorps
dans sérum

2) Monoclonaux (+ spécifique; lignées cell hybridomes)

- Qt illimitée d’anticorps identiques
- ↑ spécificité des méthodes basées sur anticorps

Méthodologie
- Propager clone de cell issues lymphocyte B sécréteur d’anticorps = pop
homogène d’anticorps ↑ qt
o Problème : lymphocytes B à courte durée vie en culture
o Solution : lymphocytes B isolés souris immunisée  cell dérivées lignée
cell lymphocytes B transformés = hybrides à fabriquer anticorps
spécifique & multiplier indéfiniment en culture
- Hybridomes : cell  lymphocytes B/cell tumorales; source permanente/stable d’1
type d’anticorps monoclonaux à reconnaître 1 type site antigénique

Avantage/utilisation
- Bio cell : anticorps fabriqués/dirigés contre protéines dans échantillon bio
o Localiser protéine dans cell/tissu et suivre son trajet
o Purifier protéine à étudier sa structure/fonction
- Traitement maladies
o Cancers : infusion IV d’anticorps monoclonaux à lient/inhibent récepteurs
de signalement sur cell cancéreuses + inhibent prolifération
o Maladies auto-immunes (ex. arthrite rhumatoïde) : lient/inhibent mol
stimulatrices de l’immunité
 2. Fractionnement du contenu cellulaire par centrifugation différentielle

Étude d’organites particuliers; isolation par centrifugation différentielle et purification

- Homogénéisation : briser/ouvrir cell dans solution isotonique de sucrose
(empêche rupture vésicules memb en empêchant osmose)
- Centrifugation : vitesses variables
o V basse/court temps : noyaux au fond (sédiment)
o V moyenne : mitochondries, chloroplastes, lysosomes, peroxysomes
o V élevée (ultracentrifugation) : microsomes (memb
réticulaires/vacuolaires), ribosomes
e
*1 centri impures; contaminants retirés par resuspension sédiment/centri répétées
*surnageant contient quand mm phase soluble cell & particules trop petites à la fin

 Étapes pour extraire et purifier

1) Destruction cell
a. Choc osmotique
b. Vibration ultrasonique : brise memb cell (plasmalemme et RE) à
fragments à forment vésicules
c. Malaxage : homogénéisateur
*épargne organites (mito, noyau, golgi, lysosomes, peroxysomes)

2) Obtention homogénat : suspension de cell en coulis épais; contient

a. Organites de dimension/densité variable
b. Vésicules dérivées du RE (microsomes)

 Types de sédimentation

- De vélocité (* isolation ribosomes/macromolécules) (pas homogénéisation)

Centrifugation sépare composantes diff en dimension; séparation + précise :
o Homogénat sur solution saline dans tube centrifugation
o Post-centrifugation : composantes cell forment bandes collectées indiv
 Vitesse : 80 000 rpm; force gravitationnelle 500 000
o Gradient de sucrose à éviter proximité bandes
o Gradient de densité : + dense au fond

- D’équilibre (favorise isolation ARNt/petites macromolécules & isotopes)

Ultracentrifugation sépare composantes selon densité flottaison; gradient de haute
densité avec bcp sucrose ou chlorure de césium; + précis
o Composantes atteignent position densité mm que la leur; bouge plus
o Bandes au fond à + forte densité de flottaison
 3. Purification et caractéristique des protéines

 Chromatographie

- Purification : retirer contaminants

- Caractérisation : mesurer qt protéines avec azote total (16% poids des protéines)
- En phase liquide : mélange composantes dissoutes à fractionné lors
déplacement à travers matrice; s’associent à
o Phase mobile : solvant migrateur
o Phase immobile : matrice
- Protéines peu affinité avec matrice à descendre + vite
- Types de matrice
o Par échange d’ions; séparation selon charges
 Matrice chargée; protéines fractionnées selon leur charge
o Hydrophobe; séparation selon hydrophobicité
 Matrice avec régions latérales hydrophobes; protéines hydrophiles
descendent + vite (- affinité)
o Filtration sur gel; séparation selon dimension
 Matrice poreuse; petites protéines descendent – vite (restent dans
pores)
o Affinité; séparation selon capacité à se lier à petites mol
 Matrice à substrats/anticorps attachés à covalente; lier à
enzyme/protéine spécifique

 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Séparation protéines selon capacité migratoire des mol chargées à champ électrique;
conduites par courant électrique & passent à travers matrice gel (polymères
d’acrylamide à liens transverses & forment crible mol)
- Apparence du gel : tranche entre 2 plaques de verre
- Étapes
o Une fois polymérisée, tranche gel à suspendue entre 2 compartiments à
tampon; immersion d’électrodes de charges opp (1/compartiment)
o Dépose échantillon protéines à fentes à extrémité sup du gel
o Électrophorèse : applique courant à q compartiment = déplacement
protéines vers électrode de charge opp
 Anions à électrode + = anode
 Cations à électrode - = cathode
o Retire tranche gel des plaques de verre + colore (colorants à l’argent) =
emplacement protéines; découpe gel & isole protéines
o Transfert protéines à memb cellulose = former taches inversées :
absorbées par memb nitrocellulose = mm position que sur gel
o Identification protéines selon interaction anticorps spécifiques (épitope)
- Mouvement protéines; dépend de
o Densité charge : + charge ↑, + taux migration ↑
 o Dimension/forme : + protéines volumineuses, + migration lente
- Problème :

- Solution : technique SDS

SDS (-) : dodécyl sulfate de sodium

o Enlève les charges naturelles des protéines
o Couvre protéines à charges - = migration vers anode
Beta-mercaptoéthanol (alcool)
o Brise les ponts sulfure entre sous-unités protéine

*sous-unités de protéine séparées et chargées négativement*

Séparation sur le gel par taille

o Dimension détectée par position de la bande, ø largeur
 4. Fractionnement des acides nucléiques et séquençage de l’ADN

 Électrophorèse sur gel (fractionnement des acides nucléiques)

1) Fractionnement cell
- Centrifugation (séparer noyau)
- Incubation ADN avec enzyme de restriction = coupe mol en fragments

2) Séparation acides nucléiques de diff masses mol (longueur segments

nucléotides)
- Petits ARN/ADN : séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
o ADN à - = vers anode
o Séparation selon longueur segments : + longs à sommet (+ lents)
- Grosses mol : séparées sur gel d’agarose à pores + gros

3) Voir fragments ADN sur gel à trempant dans solution colorant (bromure
d’éthidium)
- Colorant à double hélice = fluorescer bandes ADN sous lumière UV
o Port de gants/lunettes obligé

4) Forte sensibilité (très précis)

- Permet séparation de mol ADN/ARN pouvant différer que par 1 nucléotide =
séquençage ADN

 Technique de Sanger-Coulson (séquençage de l’ADN)

Du à découverte enzymes de restriction & dév technique clonage

1) Obtenir pop mol matrices identiques (ex. fragments ADN clonés)

a. Peut amplifier mini fragment par PCR
2) Dénaturation des 2 brins matrices à chaleur
3) Hybridation d’1 brin patron avec amorce (GGA) à refroidissement
4) Polymérase Tag ajoute dNTP (A,C,T,G) à extrémité amorce à complémentaires
à mol matrice = synthétise new brin ADN complémentaire
5) Occasionnellement, Tag ajoute ddNTP marqué par fluo au lieu dNTP = termine
chaîne (ø C3 avec groupe OH)
6) Étapes 1-4 répétées ad = grande pop de brins ADN incluant mol à ddNTP
incorporé à tous endroits
7) Quand tous cycles complets, produits réaction à séparés par électrophorèse sur
gels capillaires minces
a. Gel forte résolution = séparer fragments différant que par 1 nucléotide = q
bande successive sur gel contient mol de + en + longues de 1 nucléotide
b. Q ddNTP marqué avec colorant fluo unique = couleur bande à identité
nucléotide terminal de q mol fille; ordre couleurs sur gel = séquence bases
de mol matrice (lue par ordi à partir bas selon intensité/longueur onde de
lumière fluo)
 5. Microscopie

Instrument produisant image agrandie de l’obj; dépend préparation spécimen &

performance microscope

1) Microscopes composés (photoniques/optiques)

Spécimen éclairé grâce source lumière

- Composantes
o Condenseur (lentilles) : rassemble rayons lum diffus provenant à source
lum & les focalise à spécimen
o Objectifs (lentilles) : collectent rayons lum ayant été focalisés sur
spécimen; sources rayons -
 Rayons lum provenant condensateur passent à lentilles objectifs =
lum en arrière-plan du champ visuel
 Rayons lum émanant de diff parties du spécimen = image
spécimen; focalisés par objectif à image agrandie/réelle de l’obj
o Oculaires (lentilles) : utilise image formée par objectifs = image agrandie,
virtuelle
 Lentilles des yeux utilisent image virtuelle produite par lentilles
oculaires à image réelle sur rétine

- Grossissement : agrandissement total spécimen; produit par objectifs (x4, x10,

x40) + lentilles oculaires (4x10, 10x10, 40x10)

- Observation cell animale

o Dia : 40-50 um
o Incolore/translucide = dév colorants à fournir couleur/contraste pour
ressortir caract. internes

- Comportement faisceau lum passant par microscope àààààààààààà

- Voyagement de lum : comme ondulations dans eau (ø ligne droite)

o Ondes de lum
 En phase : 2 traits atteignent mm pt lors diff trajets =
renforcent/clarté ↑; crête avec crête, creux avec creux
 Déphasés : traits interfèrent entre eux = se cancellent
  Résolution (ad 0.2 um)

- Pouvoir de résolution : capacité voir 2 pts voisins  champ visuel à distincts

- Limite de résolution : + petite dist 2 obj/pts à distingués clairement; dépend de
o Longueur onde; entre 0.4 um (violet) ad 0.7 um (rouge)
 Détails + petits que 0.5 um à flous à nature ondulatoire de lum
o Ouverture numérique du sys de lentille : n sin thêta
 Affecte capacité lentilles à rassembler lum; selon angle à lum
entrant & indice réfraction (n) du milieu
*meilleures conditions : violet & ouverture num 1.4 = lim résolution 0.2 um

Résolution = 0.61 lambda/n sin thêta; meilleure  + petite valeur

 Sur fond clair/spécimen coloré

Cône lumière = fond clair  spécimen contraste; pour sections colorés plantes/animaux
- Étapes  préparer sections
o Fixation (tuer cell) : formaldéhyde, alcool, acide acétique
o Déshydratation : alcool
o Enrobage : paraffine (cire)
o Formation tranches fines : microtome
o Retrait paraffine : toluène
o Coloration : diff colorants

 Contraste de phase

Diff de densité (diff réfractions = diff intensités lum)  composantes intracell amplifiée
à améliorer contraste  ø colorées/transparentes; observation de cell vivantes (en
culture); forte résolution

 Fluorescence

Observ évé à int cell vivantes (ex. transport protéines), local protéines/mol (fluorophores
 liés à protéines  injecté dans cell), suivre chang [ ] mol
- Fluorophores : mol émet lum visible; absorbe photons à longueur onde = émet
longueur onde + ↑
- Colorants fluo : colorer cell; épuisement rapide quand éclairés (Cy3, Cy5, Alexa)
- Source lum : produit faisceau lum  2 filtres  bloquer toutes longueurs ondes
sauf celles excitent sub fluo / filtre lum obtenue du spécimen
- Immunofluorescence : rhodamine (excité jaune/vert; émet rouge)/fluorescine
(excité bleu; émet vert) liés  anticorps  fluo = local protéine dans cell

 Contraste interférentiel différentiel

Visualisation des obj avec dédoublement inf à limite résolution de l’objectif = images
avec pseudo relief typique; + populaire  Nomarski
 Sur fond noir

Éclairage oblique = améliorer contraste échantillons  qualité images insuffisante dans

éclairage normal; ↑ degré contraste + ressort échantillons sur fond complexe
- Fonctionnement : lum directe bloquée par diaphragme opaque  condensateur;
lum traverse échantillon selon angles obliques  diffractée/réfractée/réfléchie
dans objectif = image claire superposée sur fond noir

 Observation cell en contraste (obtenir bon contraste du spécimen)

- Observation cell une fois fixées/colorées; contraste permis par couleur

o Désavantage : composantes cell  perdues/déformées  préparation
- Observation cell vivantes sans fixation/congélation  microscope photonique
o Fond clair : lum passe à travers cell cultivée & forme image directement
o Fond noir : rayons lum  dispersés par petites composantes lors trajet; si
éclairage oblique condensateur utilisé/entre ø direct  objectif =
composantes cell ø colorées  disperse rayons (certains entrent dans
obj) = image claire sur fond obscur; ondes passe spécimen = contraste
(déphasage)
o Contraste : lum passe à travers cell vivante = phase onde modifiée 
réfraction; ↑ diff de phases = contraste quand séries ondes se
recombinent = créent image des structures cell
 Ex. noyau (dense) ralentir lum = onde déphasée p/r autres
*fond noir & contrastes : observation mouv (mitose, migration cell)

 Préparation de tissus pour l’observation

- Fixation : pour préserver cell à int de leurs tissus

o Traitement avec fixateur : glutaraldéhyde
 Effet : forme liaisons covalentes transverses entre groupes aminés
libres du tissu = stabilisés/maintenus en position
- Enrobage dans médium : car tissus mous/fragiles
o Dans cire ou résine
 Sous forme liquide, imprègnent/entourent tissu fixé, durci par
refroidissement/polymérisation = bloc solide
- Sectionnement en tranches minces : car tissus trop épais pour observer cell
individuellement à forte résolution
o Microtome
 Lame coupante (acier/vitre); coupes de 0.5-10 um épaisseur;
déposées sur lame microscopique

- Observation
o Coloration trad. : colorants organiques  affinité  composantes subcell
 Ex. hématoxyline  mol nég (ADN, ARN, protéines acides)
  Utilisé dans labs d’hôpitaux
o Sondes/marqueurs fluorescents : localiser protéines d’intérêt
 Utilisation anticorps pour détecter protéines

- Anticorps : protéine produite par sys immunitaire; défense contre infections

o Plsrs formes : q  site liaison  reconnaître mol cible (antigène)
o Couplés à colorant fluo : local mol par fluo
o Obtention : purifiés à partir antisérum  retirer anticorps ø spécifiques;
monoclonal (anticorps monoclonaux  1 mol cible)
- Immunocytochimie indirecte : anticorps primaire/secondaire
o Signal fluo ø amplifié : colorant fluo lié direct à anticorps = primaire
o Signal fluo amplifié : colorant fluo lie à anticorps secondaire; anticorps
primaire ø marqué  détecté par groupe anticorps secondaires  lier

 Microscopie confocale

Production sections optiques; images à faible profondeur de champ = séries images =

3D (recomposé par ordi)
- Fonctionnement : lum réfléchie ou fluo
o Source lum : souvent laser (MCBL); très précis (- interférence)
- Observation de réseaux fibres du cyto, organites en mouv, organisation
chromosomes/gènes dans noyau
- Différence avec microscope : focalise jet lum sur un pt/profondeur précis vs
éclairer spécimen 1 coup
- Fluorescence en focalisation : émise par matériel/collectée par détecteur = image
o Mini ouverture placée face au détecteur à position confocale avec
ouverture d’éclairage
o Rayons du pt éclairé du spécimen convergent vers ouverture  détecteur
- Fluorescence hors focalisation : émise par régions spécimen en dehors de
focalisation; lum ø concentrée dans ouverture = exclue
 2) Microscopie électronique (forte résolution)

 MEB (balayage) (3D)

Images par électrons frappant surface spécimen (rebondissent)

- Observation surface spécimen en 3D
- Préparation spécimen : forme/propriétés de surface identiques à état vivant, mais
ø liquide (observé sous vacuum)
o Fixation
o Passe dans alcool
o Déshydratation (pt critique de déshydratation)  solv spécifiques/CO2
 Ø tension de surface  détruire cell
o Enrobage avec fine couche métal = faisceau é  cibler spécimen

 MET (transmission) (2D)

Images par électrons transmis à travers spécimen; + forte résolution que microscope
photonique (ondes é + petites = résolution ↑)
- Observation structures int cell
- Préparation spécimen
o Fixation dans glutaraldéhyde puis OsO4
o Déshydratation dans éthanol
o Passe dans oxyde de propylène
o Enrobage dans épon puis milieu plastifié dans petites fioles
o Polymérisation  bloc solide
o Tranchage par ultramicrotome
o Coloration avec métal lourd sur grille