Spectroscopie pour l’analyse pharmaceutique et biomédicale

- 20 h de théorie / 30 (20) h d’exercices/démo

Plan du Cours

- méthodes purification des mélanges de composés organiques

- méthodes d’identification et d’analyse structurale et dynamique des composés organiques.

Purification des mélanges de composés organiques

A. Enumération des composants d’un mélange (méthodes « analytiques »)

B. Séparation et isolement des composants d’un mélange (méthodes « préparatives »)

A. Enumération des composants d’un mélange (méthodes « analytiques »)

- Techniques chromatographiques analytiques (plaque, colonne, GC, HPLC, …)
- Quantités de l’ordre du microgramme (µg)

 Identification de composants d’un mélange

Analogie (Rf ou temps de rétention sur colonne) avec les substances pures utilisées comme références
(rappel : chromato d’un mélange inconnu en BAC1)
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B. Séparation et isolement des composants d’un mélange (quantités « macroscopiques »)
- Techniques « classiques » de laboratoire : distillation, recristallisation, …
- Techniques « modernes » utilisées pour des substances sensibles à la chaleur et coûteuses : la
chromatographie HPLC

 Identification d’un produit pur inconnu (après purification)

- Masse moléculaire
- Composition élémentaire (C, H, N, ..)
- Structure « plane »
- Structure 3D et analyse conformationnelle

Masse moléculaire (osmométrie, cryoscopie, spectrométrie de masse, …)

Composition élémentaire C, H, N, : analyse chimique (combustion)

Analyse plus détaillée (spectroscopie)

C. UV/vis
D. IR
E. SM
F. RMN

 2eme partie du cours (~95% du cours)

2
Comment avoir le produit pur ?  techniques chromatographiques

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Techniques de chromatographie
Principe de base : répartition des molécules d’un constituant (analyte) entre 2 phases non miscibles selon un
coefficient de partage Kd (par ex, une extraction entre 2 liquides)

Kd : constant à une température donnée

En chromatographie, la distribution d’un analyte dans 2 phases distinctes est observée :

Un fluide (un liquide ou un gaz) appelé phase mobile parcourt un tube qui contient des « granulés » poreux.
Cette colonne est appelée phase stationnaire.

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Le facteur de capacité k’ est défini comme le rapport des quantités de l’analyte :

Un coefficient de partage relatif ’ est défini :

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Principe :

Le mélange à séparer est injecté, il se dilue dans la phase mobile qui l’entraîne à travers la colonne. Si la phase
stationnaire est bien choisie, les constituants du mélange sont différemment retenues lors de la traversée de la
colonne.
De ce phénomène, appelé rétention, il résulte que les constituants du mélange se déplacent tous moins vite que la
phase mobile et que leurs vitesses de déplacements sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns
après les autres et donc séparés.
Un détecteur placé à la sortie de la colonne et couplé à un enregistreur permet d’obtenir un tracé appelé
chromatogramme.

Dans des conditions données (pression de la phase mobile, température, solvant, …), le « temps de rétention »
(temps après lequel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance.
L’amplitude de ces pics permet, moyennant calibration, de mesurer la concentration de chaque soluté dans le
mélange injecté.

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Suivant la valeur de Kd (ou ’), plusieurs cas peuvent être envisagés.

Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics correspondant à chacun des produits.

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Terminologie générale de la chromatographie.

Phase mobile ou éluant: le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté.

Phase stationnaire: le produit qui, par ses affinités avec les solutés, va permettre leur séparation

quand la phase mobile les déplace.

Colonne chromatographique: tube de diamètre et longueur variable, en verre, métal,

ou autre substance, à l’intérieur duquel s’opèrent les séparations chromatographiques.

Rapport frontal ou valeurs de retention: rapport entre la distance parcourue par un soluté

dans une phase stationnaire et la distance parcourue dans le même temps par l’éluant.

Coefficient de partage: rapport des concentrations respectives du soluté dans la phase

stationnaire et la phase mobile, au cours de l’analyse.

Chromatogramme: trace sur papier des réponses successives du détecteur, au cours de l’élution

des solutés hors des colonnes.

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Exclusion moléculaire : Synonyme de filtration sur gel, perméation de gel ou tamisage moléculaire

Principe
Séparation des molécules de tailles différentes par des composés organiques polymériques capables de
s’hydrater de manière importante et de donner grâce à un réseau tridimentionnel une matrice poreuse appelée
gel. Ce gel est commercialisé sous forme de billes ou de grains et constitue la phase stationnaire.

Les particules les plus grosses sont complètement exclues, car elles ne peuvent pas pénétrer dans la phase
stationnaire, elles passent entre les grains de polymères (Kd =0)

Les petites molécules sont distribuées entre la phase

mobile et la phase stationnaire car elles peuvent
diffuser dans les pores du gel. Dans ce cas, Kd
pourra avoir une valeur comprise entre 0 et 1.
Un Kd > 1 indique que la molécule réagit avec le
gel en s’adsorbant, ce comportement ne fait pas
partie de l’exclusion moléculaire.

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Applications :

- purifications de protéines, peptides, polysaccharides, hormones, acides nucléiques, …

- détermination du poids moléculaire puisque le volume d’élution est approximativement une fonction
linéaire du log (poids moléculaire) dans la zone de séparation (domaine d’application)

Cette technique de chromatographie d'exclusion peut être utilisée pour évaluer la masse molaire, M, d'un composé
inconnu (ou plus précisement, le rayon de Stockes de la protéine, r h), en utilisant une gamme d'étalonnage (protéines
connues). Le volume mort de la colonne est déterminé en utilisant un composé de très haut poids moléculaire (le bleu
dextran, par exemple), qui sera totalement exclus de la colonne. Puis on trace le graphe Vr (ou Vr-Vm) en fonction du
logarithme de la masse molaire (ou du rayon de Stokes) des étalons.
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 - dessalage : une colonne de gel (par ex :Sephadex G25 ou G10) sépare les substances de haut poids
moléculaire éluées dans le volume d’exclusion, les sels sont retenus. Cette méthode s’applique aux acides
nucléiques, protéines, … C’est une technique plus rapide que la dialyse.

Les billes de « Sephadex » sont constituées d’un dérivé de dextran (voir structure ci-dessous) : ce sont des
chaînes de glucose liées par des lisaisons osidiques 14 et 16.

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Chromatographie par échange d’ions (IEC)

De nombreuses substances biologiques (acides aminés, protéines, …) possèdent des groupes ionisables et
peuvent donc ainsi avoir une charge positive ou négative. Les substances chargées peuvent être séparées des
mélanges grâce à l’utilisation d’échangeurs d’ions. La charge nette est dépendante du pKa de la substance et du
pH de la solution.

Rappel :

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Principe :
Si plusieurs analytes (A) portant des charges différentes (A+, A-, A++, A+++, …) sont présents dans un mélange,
ils se fixent sur les sites d’un échangeur en fonction du signe de leur charge. L’adsorption des analytes par
l’échangeur est illustré à la figure ci dessous. Les analytes n’ayant pas de charge ou ayant le même signe de
charge que l’échangeur ne sont pas retenus. La fixation des analytes à charge positive s’effectue selon leur
affinité. L’analyte A+++ se fixe avec une forte affinité tandis que A+ met en œuvre l’affinité la plus faible. Un
mécanisme de compétition a lieu lorsque la concentration des analytes est importante puique A +++ est capable de
déplacer A++ et A+.

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L’ordre d’élution est le suivant :

Cette séparation est valable pour des petites molécules mais de nombreux facteurs autres que la charge globale
affectent la séparation pour les macromolécules. La séparation des analytes est aussi fonction de la force ionique
du milieu, du pH, des additifs comme les solvants organiques et des propriétés de l’échangeur d’ions.

Les ions arrivent à la surface de l’échangeur, ils diffusent à travers la structure de l’échangeur jusqu’aux sites
chargés. Ensuite, il y a échange d’ions à ce niveau :

- avec un échangeur cationique (résine chargée négativement)

- avec un échangeur anionique (résine chargée positivement)

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Plus la molécule est chargée, plus son affinité vis à vis de l’échangeur est élevée. De ce fait, elle sera aussi
moins facilement déplacée par les autres ions.
L’ion échangé diffuse à la surface de l’échangeur et est éliminé, il faut ensuite désorber sélectivement les
molécules liées, et les éluer dans la phase mobile. Ceci peut se faire par exemple en changeant le pH de l’éluant.

Type d’échangeur

Un exemple d’échangeur d’ions est obtenu par polymérisation du styrène avec le divinylbenzène. Le produit de
condensation contient de nombreuses réticulations intra et inter-chaînes ce qui lui confère son insolubilité
contrairement au polystyrène qui est un polymère linéaire.

Les résines à faible taux de réticulation sont plus perméables aux substances de haut poids moléculaires que
celles à taux de réticulation élevé, ce qui les destine à la séparation de molécules de grande taille.

Les groupes greffés confèrent aux résines leurs propriétés, ainsi une résine sulfonée portant des groupements
SO3-H+ (comme ci dessus ou les Dowex 50) correspond à un échangeur acide fort.
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Les échangeurs basiques sont constitués, par exemple, par des résines portant des groupes aminés tertiaires.

D’autres supports que celui du polystyrène sont très utilisés

- la cellulose qui est un polymère de glucose de haut poids moléculaire
- la carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) où les groupes –CH2OH (C6 du glucose) sont convertis en –CHOH-
CH2-COOH
- la diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) où les groupes –CH2OH (C6 du glucose) sont convertis en –
CHOH-CH2-CH2-N(CH2CH3)2

rem : tous les échangeurs sont caractérisés par une capacité totale d’échange définie comme le nombre de milli-
équivalents d’ions échangeables par gramme d’échangeur sec ou par unité de volume d’échangeur hydraté.

Exemple : la capacité d’échange de la résine AG1-X4 (Bio-Rad) est de 1.2 meq/cm3, celle de Bio-Rex 70 est de
3.3 meq/cm3.

16
17
Applications

Ce type de chromatographie s’applique à un grand nombre de molécules biologiques chargées.

Ex :
- Les acides nucléiques sont séparés sur échangeurs anioniques.
- Les protéines ne sont stables que dans un domaine étroit de pH, donc l’échangeur doit être choisi pour
travailler dans ce domaine de pH

Si l’analyte est plus stable en dessous de son point isoélectrique, il a une charge nette positive et un échangeur
cationique doit être utilisé.

Si l’analyte est plus stable au dessus de son point isoélectrique, il a une charge nette négative et un échangeur
anionique doit être utilisé.

Pour les substances stables dans un large domaine de pH, les 2 types de résine peuvent être utilisés.

Le choix entre un échangeur faible ou fort dépend de la stabilité de la substance et de l’effet du pH sur sa charge.
Les électrolytes faibles nécessitent une très basse ou une très haute valeur de pH pour s’ioniser. Ces substances
ne peuvent être séparées que par des échangeurs forts.
Inversement, les électrolytes forts sont séparés par des échangeurs faibles, ce qui réduit les risques de
dénaturation des protéines et limite la fixation d’impuretés faiblement chargées.

Le pH et la force ionique sont ajustés pour permettre la fixation de la substance d’intérêt. En général, on se place
à une unité de pH en dessous ou au dessus du point isoélectrique.

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Par exemple, la séparation des acides aminés provenant de l’hydrolyse des protéines est effectué avec des
échangeurs acides forts. L’échantillon est déposé sur la colonne à une valeur de pH de 1 ou 2, ce qui permet de
fixer tous les acides aminés présents dans l’échantillon.

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Exemples de séparation des protéines

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Chromatographie en phase inverse
Aussi appelée RPC (Reversed Phase Chromatography)
La phase stationnaire est constituée par de la silice portant des chaînes variant entre C8 et C18.

Par rapport à la chromatographie généralement utilisée où les analytes sont élués selon un ordre de polarité
croissante, la RPC doit son nom au fait que l’ordre d’élution est inversé, les molécules polaires sont peu
retenues. La retention des molécules dépendra donc dans l’hydrophobicité.

L’élution s’effectue en augmentant la proportion de solvant organique dans la phase mobile. Pour un analyte
donné, l’ordre d’efficacité des solvants correspond à :

Méthanol < éthanol< acétonitrile<propanol

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Pouvoir d’élution de la phase mobile

22
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Ou TLC (thin layer chromatography)

Technique essentiellement qualitative (et parfois semi-quantitative)

Elle utilise une phase stationnaire de papier, d’acétate de cellulose ou de silice

Avantage : possibilité de chromatographier simultanément un grand nombre d’analytes

Mise en œuvre
L’analyte est déposé en bas de la plaque. (on peut effectuer plusieurs dépôts du même analyte au même endroit
pour le concentrer).
Le bas de la plaque est placé dans la phase mobile, celle-ci va diffuser par capillarité.
Généralement, la migration de la phase mobile (éluant) s’effectue de façon ascendante dans une cuve fermée et
saturée de vapeur d’éluant.

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La séparation des analytes s’effectue selon le coefficient de partage, donc tout changement de polarité de
l’éluant se traduit par une modification de la migration des analytes. Le rapport de la distance de migration de
l’analyte sur celle de l’éluant correspond au facteur de retardement Rf dont la valeur est comprise entre 0 et 1. Rf
est constant pour un analyte donné mais varie en fonction des conditions expérimentales (nature de la phase
stationnaire et de l’éluant, température, ..)
A la fin de la chromatographie, la plaque est séchée et la position des analytes est repérée généralement soit par
leur couleur naturelle (ou fluorescence) soit par la coloration spécifique grâce à la vaporisation d’un réactif
chromogénique ou fluorogénique approprié.

Cette technique permet de détecter de faibles quantités d’analyte (pg à ng)

La quantification peut être réalisée en grattant les spots des analytes. L’analyte ainsi récupéré est solubilisé par
un milieu organique et est ensuite dosé.

Applications

Dans les domaines de la chimie, de la biochimie, de la biologie, agroalimentaires, pharmaceutiques, cliniques,

…
Cette technique permet la séparation et l’analyse de nombreuses substances comme les lipides, les acides
organiques, les peptides, les vitamines, les colorants, les stéroïdes, ..

Dans l’exemple choisi, la séparation de stéroïdes sur silice est effectuée dans un éluant constitué de
méthanol/eau (40/60). Les stéroïdes 2 et 3 sont mal séparés. Si la proportion de méthanol est augmentée
(méthanol/eau : 70/30), une meilleure séparation de ces stéroïdes est obtenue comme le montre la figure
suivante :
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La détermination du Rf pour l’hydrocortisone est donnée en exemple.

Une élévation de l’hydrophobicité de l’éluant favorise la séparation des espèces à migration rapide, au contraire
une diminution de l’hydrophobicité entraîne une amélioration de la séparation des espèces migrant peu ou pas du
tout. Le choix de la composition d’un éluant est un compromis entre la séparation des substances polaires et
celle des substances non polaires.

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Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
Les différentes parties de la chaîne HPLC

a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité suffisante. Plusieurs flacons
d'éluants (solvants de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution
(mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse.

b) La pompe : elle est muni d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la
nature du solvant. Elle permet de travailler:
- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.
- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluants.
Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques µl à plusieurs ml/min.

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 c) Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents
volumes. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration
supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté
constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative. (par ex : 20, 50, 100 µl)

d) La colonne
Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en
inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs
généralement de 15 à 30 cm. Les colonnes sont relativment chères : pour une colonne analytique, les prix sont
de l’ordre de 300 euros, pour des colonnes semi-préparatives ou préparatives, il faut compter ~5000 euros.

e) La phase stationnaire

- La phase normale:
La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant
apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement
aux produits apolaire qui sortent en tête.
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne
un manque de reproductibilité des séparations.

- La phase inverse :
La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de
carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (CH3CN, MeOH, H2O). Dans
ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.
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Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la
qualité de la séparation est donc maintenue constante.

f) La phase mobile :
L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire se répercute sur les temps de
rétention des solutés. La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :
- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie est dite en
phase normale ;
- si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le plus souvent des mélanges
de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité
de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des composés.

g) Détecteurs
Deux types de détecteurs sont classiquement utilisés

* détecteur UV-visible : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. La lampe
Deuterium est utilisé pour des longueurs d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe à vapeur de mercure est
utilisé à la longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :
- le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient
d'absorption  soit suffisamment grand
- la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.

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* réfractomètre : il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne. Cette mesure,
extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du liquide. On compare cet indice avec celui de la
phase mobile pure : il y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut les
variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec
ce détecteur.
Les données sont collectées par l'intermédiaire soit d'un intégrateur ou d'une -station d'acquisition.

Analyse des chromatogrammes

Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics correspondant à chacun des produits.

Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible.

La composition de la phase mobile est un paramètre particulier à la HPLC. Il faut donc préciser pour chaque
analyse :
- le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…
- la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa composition, débit, mode de détection en nm.
- la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilité du détecteur, etc…

Analyse qualitative
Le temps de rétention (tR en min) est une caractéristique de chaque soluté dans les conditions opératoires
fixées.

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Analyse quantitative
Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est proportionnelle à la concentration
ou à la quantité de produit analysé.
Méthode de l'étalonnage externe :
Il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante du produit afin de faire une courbe d'étalonnage Aire =
f(masse ou concentration du produit), pour un volume injecté constant V. L'injection ultérieure du même
volume V de l'échantillon à doser permet, à l'aide de la mesure de l'aire du pic reportée sur la courbe
d'étalonnage, de connaître la masse ou la concentration recherchée. Cette méthode est plus précise que celle qui
consiste à ne faire qu'une mesure avec l'étalon et à utiliser une règle de trois :
Ae/Me = Aet/met
A: Aire des pics
e : échantillon
et : étalon
m : masse du produit remplaçable par la concentration

30
Chromatographie d’affinité

Ce type de chromatographie exploite les propriétés des interactions biologiques pour séparer et purifier les
substances. Cette technique a été développée pour la purification d’enzymes, elle est actuellement étendue aux
acides nucléiques, aux fragments cellulaires, aux cellules, …

Il est nécessaire que le matériel à isoler soit capable de se lier réversiblement à un ligand spécifique, lequel est
attaché à une matrice insoluble.

Dans des conditions normales, seul l’analyte doit se lier au ligand. La méthode nécessite une connaissance de la
structure et de la spécificité biologique de l’analyte à purifier. Dans le cas d’enzyme, le ligand peut être un
substrat ou un inhibiteur ou un activateur. La réussite de la purification est liée à la formation réversible du
complexe et est alors dépendante des constantes k+1 et k-1.

D’autres méthodes reposant sur l’affinité ont été développées, elles incluent la précipitation par affinité où le
ligand est attaché à un support soluble pouvant précipiter par changement du pH ou l’affinité de partage où le
ligand est fixé à un support hydrosoluble comme le polyéthylène glycol pouvant à l’équilibre, se repartir entre
deux phases liquides.

Support utilisé : dextrans réticulés (Sephacryl), agarose (Sepharose), gels de polyacrylamide (Bio-Gel P), …

31
Il est essentiel que le ligand possède un groupe chimique permettant son ancrage à la matrice qui ne soit pas
impliqué dans la fixation de la macromolécule étudiée. Les groupements les plus utilisés sont NH 2, COOH, SH
ou OH (alcool ou phénol).
Afin d’éviter l’attachement du ligand directement à la matrice, ce qui affaiblit la capacité de liaison, un bras
espaceur est généralement placé entre le ligand et la matrice. Ce bras a pour rôle de minimiser les
encombrements stériques entre la macromolécule et la matrice. La longueur du bras varie entre 6 et 10 atomes
de C.

La plupart des molécules de fixation du ligand à une matrice comprenant des groupes OH, emploient une étape
d’activation puis une 2eme étape de condensation du ligand avec un groupement réactif porté par la matrice :

Groupement fonctionnel OH + agent activateur  matrice activée

Matrice activée + ligand  ligand immobilisé

32
Quelques exemples de méthodes chimiques avec un ligand L-NH2.

33
Une méthode très utilisée, facile à mettre en œuvre, s’applique au sépharose activé par le bromure de cyanogène
à pH = 11. Le bras espaceur contient un second groupement fonctionnel sur lequel le ligand peut être fixé. Cette
méthode emploie un carbodiimide.

34
Utilisation
Lorsque l’échantillon est déposé sur la colonne et l’élution commencée, la macromolécule cible se lie au ligand.
La colonne est ensuite lavée de façon exhaustive afin d’éliminer les contaminants non retenus. Il faut ensuite
récupérer la macromolécule.

L’élution de la macromolécule fixée est effectuée soit spécifiquement (avec un compétiteur) soit non
spécifiquement. Dans ce dernier cas, le changement du pH peut être fait par ajout d’acide acétique dilué ou de
NH4OH. Il en résulte un changement de l’ionisation des groupements du ligand affaiblissant l’interaction entre
le ligand et la macromolécule étudiée.
Dans beaucoup de cas, la variation de pH provoque un changement de conformation ce la macromolécule qui lui
fait perdre son affinité pour le ligand.
Il est nécessaire après élution de restaurer l’activité biologique de la macromolécule en dialysant par exemple.
Le changement de force ionique est une autre alternative, effectuée généralement avec 1M NaCl.

35
Dans le cas de l’élution spécifique, on choisit généralement des compétiteurs ayant une affinité supérieure à
celle présentée par le ligand immobilisé. Le tableau suivant présente quelques gels d’affinité commerciaux et
leurs applications.
support Macromolécule Affinité Mode d'élution
Anticorps Antigène très forte pH
Antigène Anticorps très forte pH
IgG (différentes classes et sous-
protéine A, protéine G forte (Fc d'IgG) pH
classes)
glutathion S-transferases, protéines
fixant le glutathion, protéines de
glutathion forte glutathion
fusion incluant la glutathion S-
transférase
ATPases, protéine kinases,
calmoduline phosphodiestérases, forte
neurotransmetteurs
L-arginine, p-aminobenzamidine protéases à sérine
L-lysine plasminogène (et activateur), ARNr
AMP, ADP, ATP Enzyme à cofacteurs moyenne cofacteur
Lectines(concanavaline A, protéines glucannées, glucolipides,
moyenne à forte glucanne
WGH,HPL ...) polysaccharides, lymphocytes T
facteurs de croissance et de
Héparine coagulation, récepteurs stéroïdiens, moyenne force ionique
endonucléases, lipoprotéines, lipases
oligonucléotide, température, agents
Poly nucléotides séquences complémentaires très forte
dénaturants
Enzymes à cofacteurs NAD ou
Colorant bleu (cibacron) NADP, albumine, facteurs de moyenne
coagulation, interféron

36
Les principales étapes de sont reprises ci-dessous :

37
Chromatographie covalente

Développée pour retenir les protéines et autres produits contenant des groupements thiols. Le principe exploite
les propriétés des ligands immobilisés pouvant interagir avec les analytes (A-SH) en formant des ponts
disulfures :

38
L’élution s’effectue avec du dithréitol ou de la cystéine. LE succès de la séparation dépend du nombre de
groupements thiols de l’analyte et de la facilité à ouvrir les ponts disulfures formés. La papaine et l’uréase
possédant de nombreux groupements thiols sont facilement purifiés par cette technique. La régénération de la
phase stationnaire est réalisée avec le 2,2’-dipyridyl disulfure.

39
Chromatographie d’affinité par chélation de métaux immobilisés (IMAC)

Ce type de gel de chromatographie est une technique permettant la séparation mais aussi l’étude structurale des
protéines et des peptides possédant une affinité pour les ions de métaux lourds.

Le principe de la séparation repose sur la complexation des analytes (protéines) avec des ions métalliques tels
que Cu2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Fe2+, Co2+, …
Ces ions métalliques sont immobilisés sur un gel porteur d’un ligand chélatant (acide iminodiacétique (IDA),
carboxyméthyle, éthylènediamine, …)

L’IDA est un chélatant liant le métal (Me) par l’atome d’azote et les 2 oxygènes des carboxyles. Comme les
métaux peuvent donner des liaisons de coordinence avec 4 ou 6 ligands, les sites des liaisons restantes non
engagées sont occupées par des molécules d’eau ou par des ligands apportés par le tampon.
Ces molécules et ligands peuvent être déplacés par des groupements protéiques appropriés.

40
Cette fixation est dépendante du pH, de la force ionique mais aussi de la structure de la protéine, de l’ion
métallique et du temps de contact entre échantillon et matrice. Elle dépend aussi de la nature et de la localisation
des acides aminés favorisant le transfert de charge. Ainsi, l’histidine, la cystéine et le tryptophane sont
d’excellents donneurs d’électrons : ils sont nécessaires à l’interaction métal-protéine. La stabilité des complexes
obtenus de l’ion métallique utilisé varie selon :

Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+>Ca2+

L’ion Cu2+ interagit très fortement avec les protéines, au contraire Ni2+ et Zn2+ donnent de plus faibles chélations
et sont souvent choisis pour la purification.

41
En résumé : comment choisir le type de chromatographie ?

avant tout, il faut regarder le type de molécule que l’on doit séparer, taille, charge, …. (si on connaît)

* si masse moléculaire différente,

on choisit la chromato de gel d’exclusion

(on élue les molécules par ordre de taille décroissante, d’abord les grosses puis les plus petites)

* si la molécule possède des groupements ionisables,

on choisit la chromato par échange d’ions

- pour les mol chargées pos (+), on utilise une résine avec échangeur cationique
RSO3- Na+ + RNH3+ RSO3- ….. NH3+R + Na+
échang contre-ions mol chargée échang ….mol liée ions échangés

- pour les mol chargées nég (-), on utilise une résine avec échangeur anionique
R4N+ Cl- + -OOC-R R4N+ …..-OOC-R + Cl-
échang contre-ions mol chargée échang ….mol liée ions échangés

(élution selon la charge, ce qui est plus chargé est plus retenu sur la colonne, donc sort en dernier)
42
* pour séparer des mol à caract hydrophobe (comme petits peptides isomères),
on choisit une chromato hydrophobe (sur phase inverse)
(les molécules polaires sont peu retenues, on élue d’abord les mol les plus polaires puis les moins polaires)

* si on peut exploiter les propriétés d’interactions ligands –mol à purifier / isoler (enzymes, cellules, ..),
on choisit la chromato d’affinité

* si les molécules ont des groupements thiols (A-SH) pour former des ponts
S-S,
on choisit la chromato covalente
(on élue la mol fixée avec du DTT)

* si les substances à séparer ont une affinité pour les métaux lourds,
on choisit la chromato d’affinité par chélation de métaux immobilisés
(si aa tels que His, on élue en allant de pH 7 vers des pH plus faibles)

43
Lorsqu’on a le produit pur, on peut le caractériser par sa formule brute
CxHyOzNw

Rappel : calcul des non saturations : on ramène à CxHy et la formule est (2x+2 –y)/2 = NS
Pour ramener à CxHy : N = CH, O = rien, Cl, Br, I, F = H

Parfois, on trouve les informations d’un produit sous la forme :

C=68,2% H=13,6% O=18,2% (cas lorsque les données viennent de l’analyse élémentaire)

réaction de l'analyse élémentaire = réaction de combustion complète, réalisée en présence d'un excès d'oxygène
dans un tube fermé. L'eau et le CO2 formés sont fixés dans des filtres spécifiques, préalablement tarés, et pesés
après la combustion. La différence de masse mesurée donne respectivement le poids de l'eau et du dioxyde de
carbone produits par la combustion du composé

CxHyOzNw + excès O2  n H2O + m CO2

Selon le nombre de moles d’eau et de CO2 formées, on aura la quantité de C et d’H

Pour les autres éléments, d'autres réactions sont nécessaires:
Azote, conversion (minéralisation) en ammoniac (NH3, méthode de KJELDHAL) ou en azote moléculaire (N2,
méthode de DUMAS).
Oxygène, conversion en monoxyde de carbone par chauffage à plus de 1100°C en présence d'un excès de
carbone et sous un courant de gaz inerte.
Halogènes, minéralisation en ions halogénures et dosages classiques, gravimétriques ou électrochimiques.
Soufre, conversion en sulfate.

44
Les molécules organiques peuvent aussi comprendre des éléments plus rares, phosphore, arsenic et même des
métaux comme le fer, cuivre, zinc, … La diversité et la précision des méthodes d'analyse actuelles permet toutes
les mesures pour autant que la quantité relative de l'élément soit détectable.
Que doit on faire pour avoir la formule brute ?

On divise le % par la masse de l’élément considéré (ex : C=12, H=1, O=16, N=14)
On divise le résultat par le nombre le plus petit
On multiplie par un facteur entier qui donne des nombres entiers

Prenons l’exemple :

C= 68,2/12 = 5.68 ; H= 13,6/1 = 13,6 O=18,2/16=1,14

Le nombre le plus petit = 1,14  on divise par 1,14
C=4.98 H=11,93 O= 1

Aux erreurs près, on trouve C5H12O

Dans notre cas : Cb de NS ? (0 NS)

45
Autres problèmes quand on a la formule brute : on connaît la composition des différents éléments mais pas la
structure chimique.

En effet, nous avons des isomères possibles.

Ex : C4H10

CH3CH2CH2CH3 ou (CH3)2CH-CH3
(butane) (isobutane)

ou C7H16O : nombreux isomères possibles

 la solution est la spectroscopie

46
Rappel :

Préfixes utilisés pour les unités

10-1 : déci (d) 101 : déca (da)

10-2 : centi (c) 102 : hecto (h)
10-3 : milli (m) 103 : kilo (k)
10-6 : micro (µ) 106 : méga (M)
10-9 : nano (n) 109 : giga (G)
10-12 : pico (p) 1012 : tera (T)
10-15: femto (f) 1015 : peta (P)
10-18 : atto (a) 1018 : exa (E)

1A = 10-10 m

47
SPECTROSCOPIE
La spectroscopie a 2 rôles majeurs :

 L’identification de la structure des molécules

 La quantification de molécules

La spectroscopie est l’étude de la réponse d’un échantillon irradié par une onde électromagnétique (ex : la
lumière). On mesure cette réponse en fonction de l’énergie de l’onde envoyée au départ : on obtient un spectre
(en application en sciences biomédicales, on mesure la réponse de métabolites par exemple)

La réponse de l’échantillon (= réaction à l’irradiation) peut être :

 Une absorption (onde émanent diminuée) Ex : UV/vis

 Une réémission Ex : RMN
 Une diffusion/diffraction
48
 La spectroscopie sera qualifiée de :

 Destructive : dans ce cas, l’échantillon est détruit.

o Ex : spectrométrie de masse : on bombarde des molécules en phase vapeur avec des électrons et on
casse ces molécules.
 Non destructive : on récupère l’échantillon intact.
o Ex : spectroscopie UV/visible, Infrarouge (IR) et résonance magnétique nucléaire (RMN)
 Qualitative : on identifie un ou plusieurs « produit(s)» (Ex : recherche de produits dopants dans les urines de
sportifs)
 Quantitative : on mesure la quantité d’un produit (Ex : 10 µg/L d’EPO furent décelés dans les urines).

Principe
En spectroscopie, on balaie toutes les fréquences. La source d’énergie lumineuse est polychromatique (Ex : la
lumière blanche), c’est-à-dire qu’elle possède plusieurs fréquences (ν) et plusieurs longueurs d’onde (λ).
On place dès lors, entre la source d’énergie et l’échantillon, un monochromateur (= prisme) qui va sélectionner
les différentes λ (ou fréquences) afin d’irradier cet échantillon.

49
Résultats :
 L’échantillon absorbe l’énergie, l’onde est atténuée = absorption
 Absorption et réémission dans toutes les directions = réémission
 Diffusion : réémission sans absorption

Les énergies de mouvement

Lorsqu’on analyse une molécule, on y envoie de l’énergie (E), la molécule va alors changer d’état et certains
états énergétiques seront plus élevés.
Les molécules possèdent des énergies de mouvement (cinétique) de 3 sortes : translation, rotation et vibration.
Cependant, elles ne bougent pas de la même façon selon que la matière est en phase liquide, gazeuse ou solide.

50
 a) La translation
Dans les mouvements de translation, les molécules se déplacent en ligne droite d'un point à un autre, frappent les
parois de leur contenant (ce qui crée d'ailleurs la pression), et se frappent entre elles, rebondissent et repartent en
ligne droite, sans aucune perte d'énergie. Par exemple, en plein soleil, on peut voir les particules de poussière qui
flottent dans l'air. Ces particules sont constamment en mouvement à cause des collisions avec les molécules
d'oxygène et d'azote de l'air. Ce sont des mouvements rectilignes désordonnés. Ce sont des mouvements de
translation. On appelle ce déplacement mouvement Brownien.
b) La rotation
Une molécule peut tourner
c) La vibration
Les molécules vibrent autour de leur centre de masse. Les liaisons au sein d’une molécule sont comme des
ressorts : il existe plusieurs modes de vibration à différentes fréquences ( Ex : ν OH ≠ νCH)

Mouvements moléculaires
Phases de
vibration rotation translation
la matière
Gaz très grands très grands très grands
Liquide grands petits très petits
Solide petits nuls Nuls

51
Une onde électromagnétique (OEM) est une variation périodique de champs électrique et magnétique (voir cours
de physique). Cette onde peut être absorbée par une molécule qui peut dès lors se mettre à tourner ou à vibrer.
Pour les énergies plus fortes, la liaison peut être rompue.

Les énergies sont quantifiées : pour la liaison chimique, seules certaines valeurs d'énergie sont possibles. Pour
les ondes, la quantification est directement reliée à la fréquence (ou la longueur d'onde) de la radiation selon :

E = h relation de PLANK avec h = constante de Plank = 6, 626 10-34 J.s

E est un quantum d'énergie. Les absorptions et les émissions sont faites par valeurs entières de quanta.

Une onde électromagnétique se caractérise par :

- la longueur d’onde  (en nm)

- la fréquence  (en Hz)
c =   = c/ c = vitesse de la lumière = 3 108 m/s

(aux grandes fréquences correspondent les petites longueurs d’onde, aux grandes longueurs d’onde
correspondent les petites fréquences)

52
 ex : si  = 100 MHz, que vaut  ?
(3 m)

- le nombre d’ondes (en cm-1)

  1/ 
(le nombre de fois que l’on peut mettre l’onde dans l’unité de longueur choisie)
ex : si  = 5 m-1, que vaut  ?
(20 cm)

- l’énergie (en Kcal)

E=hυ h= 6.62 10-27 erg s = 6.62 10-34 Js

Ex: si  = 25 µm, que vaut E ?

(E= 6.63 10-34 x 3 108/25 10-6 J ou
E pour 1 mole = 6.02 1023 x 6.63 10-34 x 3 108/25 10-6 J/mole)

Quantification des niveaux énergétiques

Les niveaux énergétiques sont tous quantifiés, l’énergie n’a que certaines valeurs.
Quand une molécule absorbe ou émet de l’énergie, cela se traduit par le passage d’un niveau à un autre niveau.

53
Plusieurs groupes sont distingués :
1. les niveaux électroniques
les é sont sur des couches, seuls certains niveaux sont permis

2. les niveaux de vibration

les molécules vibrent, la longueur de la liaison peut s’étendre ou se raccourcir
il existe un nombre quantique : v = 0, 1, 2, 3, ….

3. les niveaux de rotation

les niveaux sont caractérisés par un nombre quantique de rotation J = 0, 1, 2, 3, ….
Pour chaque état de vibration, il y a un certain nombre de niveaux de rotation

54
Il existe 2 types de spectroscopies

A. Spectres d’émission

Une molécule est excitée par de la chaleur (par exemple), elle passe à un niveau supérieur (niveau excité) et
ensuite, elle émet de la lumière dont la fréquence peut-être calculée par la relation E = h υ

B. Spectres d’absorption

On envoie sur une molécule un rayonnement. Si la molécule a des niveaux excités dont la différence
d’énergie = la fréquence envoyée, cette molécule s’excite et absorbe la lumière. Un photon est capté.
Pour retourner à l’état fondamental, il y a des chocs thermiques, il peut y avoir réémission de lumière,
phosphorescence ou fluorescence
La lumière réémise est de émis > ou = abs et donc Eemis < ou = Eabs

55
56
Pour mémoire, le visible se situe en longueur d'onde entre 400 et 800 nm.

Gamme d’absorption Couleur émise

400 nm – dans le violet Jaune - verte
450 nm – dans le bleu Orange
490 nm – dans le bleu-vert Rouge
550 nm – dans le jaune Bleu
590 nm – dans l’orange Bleu
730 nm – dans le rouge Vert

Des calculs théoriques ont permis d’estimer l'énergie cinétique de translation, de rotation et de vibration. Les
résultats, confirmés par les mesures, montrent que les énergies moléculaires peuvent être classées de la plus
faible à la plus grande selon l'ordre suivant.

E translation < E rotation < E vibration < E électronique liaison < E électronique atomique.

On exclura l'énergie de translation qui n'est pas directement reliée à l'énergie transportée par les OEM. Par
contre les énergies d'autres types sont quantifiées, et peuvent donner lieu à des échanges avec les OEM. Par
absorption un quantum absorbé permet le passage de la molécule au niveau d'énergie supérieur, par émission en
revenant au niveau d'énergie inférieur, la molécule émet une onde électromagnétique.

Il faut dans ce cas plusieurs conditions : le quanta absorbé doit être au moins égal à la différence entre les
niveaux d'énergie possibles de la molécule. D'autres conditions plus complexes, appelées règles de sélection
sont aussi nécessaires.

57
Que se passe-t-il quand la molécule absorbe de l’énergie?

Le tableau suivant résume les variations observées

Type d'OEM absorbée Variation d'énergie de la matière

micro onde saut d'un niveau de rotation

Infrarouge saut d'un niveau de vibration

Visible saut d'un niveau électronique dans une orbitale moléculaire délocalisée

Ultraviolet proche saut d'un niveau électronique dans un orbitale moléculaire ,

ou formation d'un radical libre si liaison 

58
Micro-ondes :  qlques mm, E~10-1 kcal
Peu d’énergie, la seule chose possible est de passer d’un niv de rotation à un autre, on a un spectre de
rotation

IR :  qlques µm, E~1 kcal

Énergie un peu plus grande, on a suffisamment d’énergie pour passer d’un niv vibration à un autre, on a
un spectre de vibration

UV-visible :  qlques 100 nm, E ~1012 kcal

Energie suffisante pour passer d’un état électronique à un autre, on a un spectre électronique

59
Sensibilité du phénomène
La sensibilité va dépendre des différences d’énergie. Les réponses seront : RMN < IR < VIS < UV.
La cause de cela trouve un fondement dans la loi de Boltzmann et la population des niveaux.
C’est la population de molécules se trouvant aux différents niveaux.

En fait, l’absorption de l’énergie dépend du nombre de vibrateur qui vont passer à l’état supérieur. Si toutes les
molécules ont leur vibrateur dans l’état fondamental, et qu’elles passent toutes à l’état supérieur, on aura le
maximum de l’état absorbé.

Avant de passer d’un niveau d’énergie à un autre, donc à l’état initial, il y a déjà un certain nombre de molécules
qui sont au niveau supérieur. Il faut être au « 0 absolu »(ou -273°C) pour que toutes les molécules soient à l’état
fondamental, dans ce cas, on a le maximum de transition possible, tout en sachant que le maximum est 50-50
(seulement la moitié des molécules passent à l’état supérieur).
Par exemple si on a 40% des molécules à l’état supérieur (excité), on a un potentiel de transfert de 10%
seulement (10% des molécules peuvent encore passer à l’état supérieur)
La différence de population entre les 2 niveaux (N+ et N-) dépend de la différence d’énergie (ΔE):

 Pour 2 niveaux très proches, on est beaucoup plus susceptible d’avoir 50-50 à
l’état initial car il faut très peu d’énergie pour passer d’un état à un autre
 alors que pour 2 niveaux éloignés, il faudra beaucoup d’énergie pour faire
passer les molécules au niveau supérieur.

60
Pour les UV, par exemple, l’état excité (supérieur) est très élevé : on a beaucoup de molécules à l’état
fondamental, une grande réserve, ce qui explique la grande sensibilité (si on a une faible réserve et qu’on est
presque à 50-50, on a beau mettre de l’énergie, rien ne se passera puisqu’on est déjà au max).
L’équation de Boltzmann donne la distribution des particules selon les états possibles, elle donne le rapport entre
N+/N- qui est = 1 quand 50/50

 N+/N- = e (-∆E/kT)

Plus le E est grand, plus N+/N- est différent de 1.

Le RMN se rapproche très fort de 1 alors que l’UV est très inférieur à 1.

Comparaison des différentes spectroscopies

Spectroscopies Fonctionnement Energie Méthodes et Prix N+/N- Sensibilité
requise informations
récoltées
UV/vis Transitions Très Quantitatives >25.000 € 10-42 Très forte
électroniques haute
IR Vibration Haute Qualitatives >25.000 € 8.10-3 Forte
(Rotation (excellentes)
moléculaire)
SM Impact Basse Qualitatives >100.000 € - -
électronique (excellentes)
RMN Transitions Très Quantitatives De 200.000 à 0,99995 Très
magnétiques basse (bonnes) 3.000.000 € faible
nucléaires Qualitatives
(excellentes)
61
SPECTROSCOPIE UV-Visible

1. Domaine de l’U.V.

Le domaine concerné s'étend de 800 à 80 nm (10-9m).

Le visible va de 800 (rouge) à 400 (bleu) nm, l'UV proche de 400 à 200 nm et l'UV lointain de 200 à 80 nm. On
observe les substances en solution diluée (quelques mg pour 100 ml). Les solvants utilisés ne doivent pas
absorber dans cette zone. Par exemple, on utilisera l’éthanol, l’hexane.

Schéma d’un spectromètre

62
Ce schéma donne un aperçu des composants typiques d’un spectromètre. Une source lumineuse envoie de la
lumière polychromatique sur un monochromateur, qui sélectionne les longueurs d’onde (décomposition de la
lumière). Les rayons monochromatiques, par un système de miroirs, sont envoyés sur les cuvettes contenant :

(a) le solvant uniquement = reference cuvette

(b) la solution « solvant-soluté » = sample cuvette

63
Transition électronique

temps nécessaire à une transition électronique : de l’ordre de 10-15 s.

(une vibration est de l’ordre de 10-12-10-13s). Le temps de la transition électronique est au moins 100 plus rapide
que celui de la vibration.

Principe de Franck-Condon : pendant l’excitation électronique, la distance inter-atomique reste inchangée.

2. Loi de Beer - Lambert.

Le spectre compare un faisceau monochromatique de longueur d’onde donnée  passant au travers de la solution
à étudier, et un autre faisceau de même longueur d’onde et de même intensité initiale passant au travers d’une
cuve ne contenant que le solvant utilisé. On définit la densité optique de la solution à étudier par : A = log (Io/I),
qui est toujours positif.

I0 = intensité du faisceau incident

I = intensité du faisceau sortant

l = épaisseur de la cuvette = 1 cm

C = concentration de la solution en Mol/L

  = coefficient d’extinction molaire en L mol-1 cm-1

64
La densité optique d (ou Absorption A) est proportionnelle à la longueur de la cuve et à la concentration molaire
du composé.
Le coefficient de proportionnalité s’appelle le coefficient d’extinction molaire  : A =  . l(cm) . c (g/l)

 varie beaucoup. Au maximum d’absorption de chacun des corps suivant (max) correspond une valeur de 

Rem : la loi de Beer-Lambert (A =Cεl et A= log (I0/I)) n’est valable que pour des concentrations relativement
faibles.

Ex : si A =1, log I0/I = 1, donc I0/I =10

(10% du faisceau initial ressort,  90% de lumière a été absorbé)

Si log (I0/I)=2  I0/I = 102  I = 0,01 I0

( 1% du faisceau initial ressort,  99% de lumière a été absorbé)

Si I0 =I, log I0/I = log 1 = 0  pas d’absorption

On peut parler en absorption ou en transmission.

La transmission : I/I0, c’est la fraction de lumière qui passe au travers de la cellule
T= I/I0 x 100, on l’exprime en %
Ex : A = 0.1 A=log I0/I  I0/I= 1.259
I/I0=0.794  T= 79.4 % (voir ex)
65
3. Études des différents chromophores.
3.1. Définitions

Un chromophore est une fonction ou un groupe d’atomes qui modifient la fréquence de l’onde U.V. ainsi que
l’intensité d’absorption (). Les quatre termes utilisés sont:

· effet bathochrome : le chromophore diminue la fréquence d’absorption (augmente

lemax).

· effet hypsochrome : le chromophore augmente la fréquence d’absorption (diminue le

max).

· effet hypochrome : le chromophore diminue l’intensité d’absorption : (diminue ).

· effet hyperchrome : le chromophore augmente l’intensité d’absorption : (augmente ).

Lorsque se forme une liaison entre deux atomes, il y a formation d'une orbitale moléculaire résultant du
recouvrement des orbitales atomiques. Elle possède deux niveaux, un liant plus stable que les orbitales
atomiques de départ et un anti-liant moins stable. Chacun ne peut recevoir que deux électrons au plus.

A l'état fondamental les électrons des liaisons occupent les orbitales de plus basses énergies. (voir fig ajoutée)

L'absorption de photons se traduit par des transitions d'électrons engagés dans les OM situées à la frontière entre
les derniers niveaux occupés de l'état fondamental et les premiers niveaux non occupés des états excités. Quand
un électron est promu dans une orbitale d'énergie supérieure son état de spin est conservé, du moins dans un
66
premier temps. C'est l'état singulet. Ensuite, le spin peut se retourner pour donner l'état triplet un peu plus
stable (règle de Hund). Chaque transition est caractérisée à la fois par sa longueur d'onde et par son coefficient
d'absorption molaire, , à cette longueur d'onde.

Les transitions sont possibles entre :

- la dernière orbitale occupée « HOMO » (=Highest Occupied Molecular Orbital)

- et la première orbitale inoccupée « LUMO » (= Lowest Unoccupied Molecular Orbital)

67
Les orbitales moléculaires : rappel

Pour les éléments comme l’oxygène, le carbone et l’azote, les orbitales, c’est-à-dire l’espace qu’occupent les
électrons autour du noyau, prennent l’aspect du schéma ci-dessus.

Les règles suivantes régissent la formation des O.M.

1 Les O.M. s'obtiennent par combinaison où recouvrement d'orbitales atomiques (OA). On s'intéresse
seulement aux orbitales atomiques contenant les électrons de valence.
2 Lorsque le recouvrement des OA s'effectue selon l'axe des noyaux, l'OM formée sera de type  (sigma).
Lorsque le recouvrement des O.A. s'effectue latéralement, l'O.M. formée sera de type  (pi).
3 La combinaison de 2 OA donne toujours 2 OM:
-orbitales moléculaires liantes de basse énergie, les électrons étant surtout situés entre les deux noyaux.
-orbitales moléculaires anti-liantes de haute énergie, les électrons étant situés à l'extérieur des noyaux.
4 Une OM contient au maximum deux électrons (principe de Pauli).

68
Les orbitales moléculaires σs et σp
L'orbitale moléculaire σs provient du recouvrement axial de deux orbitales . A ce moment les deux
orbitales atomiques n'existent plus et font place à une orbitale moléculaire qui appartient à la molécule.
C'est dans l'axe entre les deux noyaux qu'il est probable de retrouver les électrons.
Un électron dans cette région exerce une attraction sur les deux noyaux. On dit alors que cet électron est
liant et que l'orbitale est liante. Dans le cas de l'orbitale anti-liante c'est le contraire.
L'énergie d'une orbitale moléculaire liante est plus basse que l'énergie des orbitales atomiques. Ceci
explique pourquoi il peut se former une molécule à partir de deux atomes (tendance d'un système vers
l'énergie minimum).
Vous pouvez voir ci-dessous la représentation de la formation des orbitales moléculaires σs.

Orbitales Recouvrement des OM σ liantes OM σ

atomiques orbitales antiliantes

Le raisonnement pour les orbitales σp est le même.

69
Les orbitales moléculaires π
L'orbitale moléculaire π (pi) provient du recouvrement latéral de deux orbitales p. A ce moment les deux
orbitales atomiques n'existent plus et font place à une orbitale moléculaire qui appartient à la molécule. La
probabilité de présence des électrons se situe de part et d'autre de l'axe des noyaux.
Les électrons dans cette région sont moins bien retenus par les noyaux que les électrons dans l'orbitale
moléculaire σs qui sont plus près des noyaux.
Ci-dessous la représentation de la formation des orbitales moléculaires π

Orbitales Recouvrement OM π liantes OM π antiliantes

atomiques d’orbitales p

70
Distribution électronique dans les orbitales moléculaires  et 

Orbitale moléculaire du formaldéhyde

71
Niveaux d’énergie électronique dans une molécule

- Transition σ  σ*

La grande stabilité des liaisons σ des composés organiques se traduit par un écart important entre les niveaux des
orbitales frontières correspondants. Cette transition d'un électron d'une OM liante σ dans une OM antiliante *
demande beaucoup d'énergie; elle est située dans le lointain UV, vers 130 nm (max, éthane = 135 nm,  =
10000). C'est pourquoi les hydrocarbures saturés, tels l'hexane ou le cyclohexane, qui ne présentent que des
liaisons de type σ, sont pratiquement transparents dans le proche UV.

72
- Transition n  π*

C'est la transition de plus faible énergie. Néanmoins, elle ne correspond qu'à un faible pic sur les spectres. Cette
transition résulte du passage d'un électron d'une OM non-liante n à une OM antiliante *. Ce type de transition
est rencontré, dans le cas des molécules comportent un hétéroatome porteur de doublets électroniques libres
appartenant à un système insaturé. La plus connue est celle qui correspond à la bande carbonyle, facilement
observable, située entre 270 et 280 nm. Le coefficient d'absorption molaire est faible : pour l'éthanal par
exemple, max= 293 nm. C'est une transition interdite (donc de faible ) car les transitions ne se font pas
facilement dans des orbitales perpendiculaires.

- Transition n  σ*

Le transfert d'un électron d'une paire libre (doublet n) des atomes O, N, S, X à un niveau σ* est observé pour les
alcools vers 180 nm, pour les amines vers 220 nm, pour les éthers vers 190 nm ainsi que pour les dérivés
halogénés. Cette transition d'intensité moyenne, se situe à l'extrême limite du proche UV. Exemples méthanol :
max= 183 nm (= 500); éther max= 190 nm ( = 2 000) éthylamine :max = 210 nm ( = 800).

- Transition π π*

Ce type de transition n'existe que dans les composés possédant des électrons π, issus des doubles ou triples
liaisons. Cette transition est assez intense car énergétiquement favorable. La valeur de la longueur d'onde
73
maximale d'absorption dépend de l'environnement de la double liaison. Les composés, qui possèdent une double
liaison éthylénique isolée, conduisent à une forte bande d'absorption vers 170 nm (éthylène max = 165 nm, =
16 000)

Associations donneur-accepteur et retours à l'état non-excité

Il peut se produire qu'un composé, transparent dans un domaine spectral lorsqu'il est pris à l'état isolé, devienne
absorbant s'il est mis en présence d'une espèce avec laquelle il interagit par un mécanisme du type donneur-
accepteur (D-A). Ce phénomène est lié au passage d'un électron appartenant à une orbitale liante du donneur (le
partenaire nucléophile) vers une orbitale vacante de l'accepteur (l'électrophile), d'un niveau d'énergie proche. La
position de la bande d'absorption correspondante est fonction du potentiel d'ionisation du donneur et de
l'affinité électronique de l'accepteur; la valeur correspondante de  est en général très grande.

Mécanisme de transfert donneur-accepteur.

74
Fluorescence et phosphorescence

Après l'étape d'absorption, l'énergie captée peut être restituée soit par un processus non-radiatif, soit par
émission de photons. Le processus non radiatif permet d'éliminer l'énergie accumulé par transfert vers d'autre
molécules ou par vibration-rotation (émission IR) jusqu'au niveau de vibration le plus bas et le niveau
électronique fondamental. Dans le cas des processus radiatifs le retour à l'état électronique fondamental se fait
sans changement de mode vibrationnel avec l'émission d'un photon. Ces processus sont la fluorescence (retour
au niveau v=0, état électronique singulet excité puis émission d'un photon (dans les 10-8 seconde)) et la
phosphorescence (conversion dans un état triplet excité, retour au niveau v=0, état électronique triplet excité
puis émission d'un photon (dans la seconde ou la minute)).

Diagramme de Jablonski.

75
La fluorescence : réaction immédiate

Pour les molécules fluorescentes, ce retour à l'état fondamental se fait rapidement, ce qui explique que sous
lampe ultraviolette, par exemple, les molécules émettent de la lumière dans l'instant. Mais une fois la source
d'excitation ôtée, la réaction ne s'effectue plus. Elle s'arrête instantanément. La fluorescence ne dure pas plus de
10-8 secondes.

La fluorescence est très utilisée. Des fluorochromes sont souvent insérés comme marqueurs dans des molécules
ou des cellules. On peut ensuite les visualiser au microscope.

La phosphorescence : un lent retour à la normale

Pour les molécules phosphorescentes, le passage de l'état excité à l'état fondamental des électrons ne se réalise
pas instantanément. Les électrons évoluent vers un état secondaire, d’énergie plus basse. Le système
électronique accède à cet état par redistribution d’une partie de son énergie par exemple sous forme de chaleur.
Les électrons vont mettre plusieurs minutes à revenir à l’état initial à partir de cet état secondaire… pendant ce
temps, l'émission lumineuse dure. Cette distinction physique explique qu'en dehors d'une source d'excitation, les
molécules phosphorescentes continuent à émettre une lumière.

76
- Groupements chromophores isolés

Les groupements chromophores des composés organiques sont des groupements d'atomes responsables
d'absorptions caractéristiques.

Pour une série de composés possédant le même chromophore, la position ainsi que l'intensité des bandes
d'absorption restent sensiblement constantes, sauf s'il y a accumulation de plusieurs chromophores à proximité
les uns des autres. Lorsque les chromophores sont isolés, c'est-à-dire séparés par au moins deux liaisons simples,
on observe uniquement la superposition des effets individuels.

max
NOM Chromophore 
(nm) max
amine -NH2 195 3000
oxime -NOH 190 5000
nitro -NO2 210 3000
nitrite -ONO 230 1500
nitrate -ONO2 270 12
nitroso -N=O 300 100

77
Effets dus aux solvants: solvatochromie

La position, l'intensité et la forme des bandes d'absorption des composés en solution, diffèrent lorsqu'on change
de solvant. C'est une des raisons qui rendent les bibliothèques de spectres UV difficilement exploitables. Ces
changements traduisent les interactions physiques soluté/solvant qui modifient la différence d'énergie entre état
fondamental et état excité. L'étude de ces modifications permet de tirer quelques règles générales.

- Effet hypsochrome

Il existe des transitions pour lesquelles la polarité du chromophore diminue quand on passe de l'état fondamental
à l'état excité. (ex : la transition n  du carbonyle des cétones en solution). Avant absorption, la polarisation
C+-O- sera d'autant plus stabilisée que le composé sera en présence d'un solvant polaire dont les molécules seront
attirées par effet électrostatique autour du soluté. Ceci aura pour effet de nécessiter plus d'énergie pour
provoquer la transition électronique n , d'où un déplacement du maximum d'absorption correspondant vers
les courtes longueurs d'ondes (effet hypsochrome) comparativement à la position de la bande d'absorption de ce
chromophore dans un solvant non-polaire.

-Effet bathochrome

Pour les solutés peu polaires, il n'y a pas d'effet d'orientation des molécules de solvant autour des molécules de
soluté. Si le moment dipolaire du chromophore augmente au cours de la transition, l'état final sera plus solvaté.
On rencontre cette situation pour la transition  des hydrocarbures éthyléniques dont la double liaison de
départ est moins polaire avant qu'après absorption du photon. Un solvant polaire a donc pour effet de stabiliser
la forme excitée, ce qui favorise la transition : on observe un déplacement vers les grandes longueurs d'ondes.
Cet effet bathochrome est défini par rapport au spectre obtenu dans un solvant non polaire.

78
-Effet sur le coefficient d'absorption :

Lors de changement de solvant ou d'ajout de substituant sur la molécule, il peut y avoir une modification du
coefficient d'extinction molaire. Si  diminue on a alors un hypochrome, les transitions sont moins favorables et
le nombre de photons absorbés diminue. L'effet inverse, pour  qui augmente est appelé effet hyperchrome.

Effet Conséquences
Hypsochrome (Blue shift) max diminue
Bathochrome (Red shift) max augmente
Hyperchrome max augmente
Hypochrome max diminue

79
- Chromophores des systèmes conjugués

Si plusieurs chromophores sont juxtaposés dans une même molécule, l'ensemble forme un système conjugué de
chromophores. Le spectre est fortement perturbé par rapport à la simple superposition des effets produits par les
chromophores isolés. Plus le nombre d'atomes sur lequel le système conjugué s'étend, plus la délocalisation
spatiale des électrons est importante et plus l'écart entre niveau fondamental et niveau excité diminue. Le spectre
d'absorption est déplacé "vers le rouge" (effet bathochrome) avec augmentation d'intensité (effet hyperchrome);
ce phénomène est appelé stabilisation par résonance de l'état excité.

Cet effet est à l'origine de la couleur de nombreux composés naturels dont les formules semi-développées
présentent des chromophores conjugués étendus. Ainsi la couleur orangée du -carotène (formule ci-dessous),
provient de la réunion de 11 doubles liaisons conjuguées entre elles max = 497 et 466 nm dans le chloroforme).

- Carotène

L 'absorption des composés aromatiques est beaucoup plus complexe que celle des éthyléniques. Plusieurs
transitions,  * sont observées. La substitution du noyau modifie les bandes d'absorption de manière très
importante.

80
3.2. Double liaison carbone-carbone.

Plus le groupe est substitué, plus la bande d’absorption est déplacée vers le visible : effet bathochrome. Par
exemple:

- Z et E but-2-ène et 2-méthyl-propène : max = 186 nm

- 2-méthyl but-2-ène : max = 192 nm

- 2,3-diméthyl but-2-ène : max = 198 nm

On constate donc un incrément de 5 nm par substituant.

Mais l’intérêt de l’U.V. pour les éthyléniques reste réduit

La spectroscopie U.V. est donc surtout intéressante pour étudier les systèmes conjugués et aromatiques.

Le système conjugué est long, + λ est grand, +  est grand et + il absorbera de lumière.

81
Coloration
La couleur correspond aux longueurs d’ondes non absorbées.
Ex : pour la couleur noire, toutes les longueurs d’ondes sont absorbées.

La couleur est d’autant plus intense que ε est grand

Une substance qui absorbe dans le bleu paraît jaune (couleurs complémentaires).

Les couleurs perçues par l'oeil s'expliquent physiquement. L'oeil est un récepteur et réagit quand il reçoit des
radiations électromagnétiques. Cette réponse est traitée par la rétine puis transmise au cerveau qui l'analyse et le
résultat est une image en couleurs. L'oeil perçoit des couleurs si les longueurs d'onde associées à ces ondes sont
dans une gamme variant de 400 à 800 nm.

La superposition de toutes ces longueurs d'onde donne la lumière blanche et inversement, la décomposition de la
lumière blanche permet l'observation de toutes ces couleurs. Cette décomposition s'observe fréquemment dans la
nature, le phénomène le plus connu étant l'arc en ciel.

82
Le domaine visible est divisé grossièrement en trois parties auxquelles sont associées les 3 couleurs primaires.

Teinte de base Teinte complémentaire

Bleu Jaune
Vert Violet-Magenta
Rouge Cyan

Spectre d'absorption d'une substance colorée

Un colorant nous parait bleu car il laisse passer les photons correspondants à cette couleur et nos yeux les
reçoivent. Les photons absorbés sont donc les "autres", correspondant à la teinte complémentaire.

83
Utilisation de l’ UV/VIS

On a recours à l’UV/VIS pour le dosage de produits et très rarement pour leur identification.
Elle est utilisée en industrie (colorants), en laboratoire (clinique, recherche), en cosmétique (crèmes solaires =
écran UV)…
Lorsqu’on se retrouve en présence d’un produit à doser, il faut d’abord réaliser une droite d’étalonnage :
 Préparer des solutions de concentrations précises de produit pur
 Relever le spectre (UV/VIS)
 Détermination de 
En connaissant , on peut dès lors doser le produit à différentes concentrations.

Exemple :
On pèse 10 mg de « X » que l’on solubilise dans un litre de solvant. On
mesure A et on reporte la valeur de log (I0/I) sur un graphique du log (I0/I)
en fonction de la concentration de « X » en mg/L. On recommence pour
différentes concentrations (5 mg/L , 2mg/L, etc.)
 On obtient une droite = la droite d’étalonnage dont la pente est 

Remarque :
- attention à la valeur du log. Si log > 2, il faut diluer !
- attention à l’absorption du solvant utilisé !

84
On peut également utiliser l’UV/VIS pour étudier des cinétiques de réactions :
Imaginons une réaction enzymatique transformant A en B : A + Enzyme  B.
On va quantifier A et B au cours de la réaction.
Les intensités varient au cours du temps, successivement de t0 à t1 puis
à t2 ,etc… Grâce à l’UV/VIS, on mesure l’absorbance (abs.) de A et de
B au décours de la réaction.

Il y a une évolution d’une entité A en une autre entité B. Dès lors, les spectres se croisent tous en un même point
appelé le point isosbestique

85
 Produit B
t0 t1 t2

Produit A

L’UV/VIS est aussi utilisée comme détecteur HPLC.

86
Spectroscopie infrarouge
- Une méthode non destructive
- Peu coûteuse
- Une méthode qui nécessite peu de produit
- Une méthode d’identification des produits (qualitative)

Cependant, l’IR n’est pas idéale pour le dosage de produits. En effet, pour que la loi de Beer-Lambert soit
applicable (linéaire), il faut que les échantillons soient très dilués. Toutefois, l’extinction molaire () en IR est
très faible : les solutions utilisées sont très concentrées, voire pures.

Ce type de spectroscopie nous renseigne sur les vibrations des liaisons moléculaires (covalentes), que l’on
appelle « vibrations de groupe ». En effet, tout groupement au sein d’une molécule a une fréquence de vibration
propre, identifiable grâce aux IR.

Appareillage

L’infrarouge est également une spectroscopie de transmission. L’échantillon est donc soumis à une source
infrarouge et on va mesurer les absorptions. L’appareillage, schématisé ci-dessous, est similaire à celui utilisé
pour la spectroscopie UV/VIS

87
 a) Spectrophotomètre traditionnel à doubles faisceaux

La source est un filament incandescent qui émet sur l'ensemble du spectre infrarouge.
La radiation de la source est divisée en deux faisceaux par un miroir; les faisceaux de référence et échantillon.
Les faisceaux sont dirigés dans le compartiment à échantillon où ils passent respectivement à travers les cellules
de référence et échantillon. À la sortie du compartiment à échantillon, un obturateur permet de bloquer
alternativement un et l'autre des faisceaux. On obtient un seul faisceau composé de segments alternants des
faisceaux de référence et échantillon. Le faisceau combiné passe à travers le monochromateur (double réseau)
pour produire un balayage de la bande de fréquences au détecteur.
Le détecteur (thermocouple) compare l'intensité des segments de référence et échantillon pour chaque fréquence
et produit un spectre de transmittance (%) ou de l'absorbance (UA) en fonction de la fréquence (cm-1) ou de la
longueur d'onde (mm).
88
 b) Spectrophotomètre moderne à transformée de Fourier (FT-IR)

Faisceaux
de
référence

La radiation de la source est divisée en deux faisceaux par un séparateur de faisceaux (beamspliter).
Un des faisceaux parcourt un chemin optique fixe, l'autre un chemin optique de longueur variable à cause d'un
miroir mobile, avant d'être recombinés, de traverser l'échantillon et de frapper le détecteur.
Comme il y a une différence de chemin optique entre les 2 faisceaux, il y aura au cours du temps des
interférences.
L'ensemble des interférences positives et négatives produit un interférogramme. Celui-ci contient toutes les
informations requises pour produire un spectre suite à une opération mathématique appelée transformée de
Fourier. Cela nécessite un ordinateur qui applique la FT et donne le spectre.
89
Préparation des échantillons
a) Echantillons liquides

En IR, le faisceau lumineux est arrêté par le verre, le

quartz… il faut donc un dispositif adapté à l’échantillon. On
place ce dernier sur des fenêtres de NaCl ou de KBr car ce
sont des matières transparentes en IR. Un système de plaques
et de vis (portoir) permet de serrer les fenêtres et d’écraser
l’échantillon. Dès que ce conditionnement est terminé, le
spectre IR peut être obtenu.
NB : les matériaux en NaCl sont hydroscopiques

90
 b) Echantillons gazeux
Le dispositif (ci-dessous) est similaire et permet de confiner le gaz en empêchant sa fuite. Les fenêtres en NaCl
(ou KBr) permettent aux IR de traverser la cellule contenant le gaz.

c) Echantillons solides
Deux méthodes de conditionnement existent pour les solides :
1. Le solide est broyé dans du NaCl ou du KBr (=dispersion) qui n’absorbe pas les IR. On place ensuite le
mélange dans une presse pour en faire une pastille.
2. Le produit peut être directement écrasé sur une fenêtre à l’aide d’une pointe. Le faisceau infrarouge va
rebondir, se réfléchir chaque fois qu’il touche la surface où se trouve le produit écrasé.
le spectre est obtenu directement au sein du solide.
L’avantage est que le temps pour prendre ce spectre est de l’ordre de la seconde.

91
Spectre IR

L’axe des X correspond à l’axe des énergies (fréquence ou encore nombre d’onde).
L’axe des Y correspond à la lumière transmise au travers de l’échantillon. (100 % signifie que l’échantillon
n’absorbe rien ; 0 % signifie qu’il a tout absorbé).
Chaque pic correspond à une liaison moléculaire particulière. En effet, un groupement nitrile (-CN) par exemple,
ou encore une double liaison « C=C », vibreront toujours à la même fréquence, quelque soit l’assemblage
moléculaire mais à des endroits différents sur le spectre, ce qui permettra l’identification des groupements
présents dans un composé. C’est l’effet de vibration de groupe.

92
La gamme de l’infrarouge (en ) se situe entre 2,5 et 25 µm.

En infrarouge, on utilise comme paramètre pour mesurer les énergies, l’unité « nombre d’onde » (  (en cm-1)).

 = 1/ = cm-1
Pour rappel, 1 µm = 10-4 cm

 en cm-1

 = 2,5 µm = 2,5 .10-4 cm

 = 25 µm = 25.10-4 cm

93
Les spectres infrarouges (en nombre d’onde) se situent entre 4000 cm-1 et 400 cm-1
NB : Cette gamme spectrale ne couvre que les vibrations moléculaires. Il existe en effet des rotations mais
celles-ci ne seront pas détaillées.

On peut séparer le spectre à infrarouge en 2 zones :

 Une zone au-delà de 1600 cm-1(jusqu’à 4000 cm-1) qui correspond à une zone où sont identifiés les
vibrateurs de groupe.
Par exemple NH, CH, OH, …
 Une zone en dessous de 1600 cm-1 aussi appelée zone du fingerprint où l’on ne va pas chercher à
identifier une vibration particulière mais l’ensemble de la molécule qui vibre ou du moins, une grosse
partie de celle-ci. Ce sont les vibrations d’ensemble ou de structure ou encore du squelette. Cette zone
(entre 1600 et 400 cm-1) permet de réaliser l’identification d’un produit inconnu par rapport à un
produit de référence.

Remarque : il n’y a pas 2 molécules qui ont le même fingerprint (même si elles possèdent des groupements
identiques, leur fingerprint sera différent).

Les absorptions nécessitant le plus d’énergie sont à gauche.

94
Les modes de vibration

L’énergie utilisée en IR est plus faible que celle utilisée en UV/VIS (qui casse les liaisons). En effet,
l’échantillon est simplement chauffé (chaleur due à l’agitation moléculaire) car l’IR stimule ce qui est
mécanique dans les molécules :
 Stimulation de la translation : elles se déplacent plus vite
 Stimulation des rotations
 Stimulations des vibrations : les vibrateurs (=liaisons covalentes) vibrent plus vite ce qui augmente
l’énergie

Dans une molécule, il y a différents types ou modes de vibration :

Si la molécule est non linéaire :

Le nombre de mode = 3 n – 6

Si la molécule est linéaire

Le nombre de mode = 3 n – 5
Remarque : n correspond aux nombres d’atomes présents dans la molécule

Exemples :

 H-Cl : 1 vibration possible

En effet, n = 2  comme on a une molécule linéaire : 3n-5 = 1 mode

95
  CO : 1 vibration possible
En effet, n = 2  3n-5 = 1 mode

 H-C  N : 4 vibrations possibles

En effet, n = 3  3n-5 = 4 modes

 : 3 vibrations possibles
En effet, n = 3  comme on a une molécule non linéaire : 3n-6 = 3 modes

 CH4 : 9 vibrations possible

En effet, n=5  comme la molécule est non linéaire : 3n -6 = 9 modes

Plus le nombre d’atomes est important ( plus la molécule devient complexe), plus on a de modes de
vibrations.

Pour voir les vibrations, il faut que le moment dipolaire (µ) du vibrateur change au cours de la vibration.
le vibrateur doit être asymétrique (du point de vue de sa composition spatiale).
Le moment dipolaire est la distribution des charges sur une molécule.

Exemples de moment dipolaire :

 Cl-Cl : il n’y a pas de moment dipolaire car la molécule est symétrique

 H-Cl : possède un moment dipolaire
96
  H-C  CH : C  C ne change pas de moment dipolaire. De ce fait, on ne voit pas la vibration.

Types de vibration qui peuvent exister au sein d’une molécule

97
Les transitions énergétiques se font ici entre les niveaux d’énergie de rotation des molécules ou entre leurs
niveaux d’énergie de vibration.

Les transitions entre niveaux de rotation apparaissent dans l’I.R. lointain (de 25 à 250 m ou de 400 à 40 cm-1).
Les transitions entre niveaux vibrationnels apparaissent de 2.5 à 25 m (ou de 4000 à 400 cm-1). Les transitions
vibrationnelles nécessitent plus d’énergie que les transitions rotationnelles. Aussi la lumière excitatrice
provoquera-t-elle, pour chaque transition vibrationnelle, une multitude de transitions rotationnelles, qui vont
donner au pic de transition vibrationnelle l’allure d’une bande d’absorption :

98
Modes de vibration.

1. Élongation.

Appelé aussi vibration de valence ou "stretching", ce mode concerne la vibration de la molécule le long des
liaisons. La fréquence de l’onde électromagnétique qui induit la vibration d’élongation est donnée par la

relation :

où k est la constante de force de la liaison (considérée ici comme un ressort), proportionnelle à l’énergie de
liaison, et µ la masse réduite des deux atomes reliés par cette liaison. Ainsi, les liaisons multiples, plus
énergétiques que les simples, auront une constante de force plus élevée, donc une fréquence de vibration
(remplacée dans la pratique par le nombre d’onde) plus élevée que celles des liaisons simples entre atomes
identiques : C–C absorbe vers 1100 cm-1, C=C vers 1600 cm-1et CC vers 2100 cm-1.

2. Déformations dans et hors du plan.

Considérons une structure CH2. En plus de la vibration de valence, l’angle des liaisons peut varier : il y a flexion
ou déformation. Ces déformations peuvent avoir lieu dans le plan des deux liaisons concernées ou hors du plan.
Il y a aussi possibilité de déformations symétriques et asymétriques.

99
Application de l’I.R. à la détermination des diverses fonctions d’un composé organique.

Non seulement la nature des deux atomes vibrants intervient dans la valeur de la constante de force, mais aussi
l’environnement électronique. Aussi chaque groupement fonctionnel aura des fréquences caractéristiques
d’élongation et de déformation. Nous allons passer en revue les diverses fonctions grâce à l’étude de quelques
spectres :

1. Les groupements carbonés saturés : les alcanes.

On trouve principalement les vibrations d’élongation de la liaison C–H entre 3000 et 2840 cm-1.

Il suffira de repérer une absorption dans ce domaine pour suspecter fortement la présence de liaisons C–H.

Vers 1400 cm-1 se situent les vibrations de déformation dans le plan des liaisons C–H :

100
2. Doubles liaisons carbone - carbone.

Par rapport à l’exemple précédent, il apparaît deux pics nouveaux :

à 1645 cm-1, il s’agit de Csp2=Csp2, à 3050 cm-1, il s’agit de Csp2-H.

Lorsque les doubles liaisons sont conjuguées :

101
Les trois bandes précédentes sont shiftées :

3. Triple liaison carbone–carbone.

Il faut remarquer la faible bande de l’élongation à 2110 cm-1. On ne la voit pas toujours, surtout lorsqu’il
s’agit d’alcynes disubstitués. Par contre, la bande d’élongation des alcynes monosubstitués est toujours
-1
intense et sort ici à 3268 cm .

102
4. Composés aromatiques mononucléaires (benzènoïdes).

La zone intéressante est comprise entre 2000 et 1667 cm-1 (lorsqu’il n’y a pas de carbonyle dans la molécule) où
l’on retrouve les harmoniques des bandes de déformation hors du plan et dans le plan : c’est la signature de la
molécule aromatique. Il faut aussi rappeler les bandes Car -H (un peu au dessus de 3000 cm-1). Il existe
également plusieurs modes d’élongation des liaisons C = C aromatiques : dans cet exemple ils apparaissent à
1605, 1495, 1466 cm-1. S’il y a conjugaison du cycle avec un doublet  ou  non liant, il peut apparaître une
quatrième bande.

103
5. Alcools et phénols.

Les bandes caractéristiques concernent les liaisons C–O et O–H. L’élongation de O–H d’un alcool donne une
absorption intense dont la fréquence dépend de l’existence ou non de liaisons hydrogène : O……H-O. Pour une
molécule diluée dans un solvant aprotique apolaire, donc lorsqu’il n’y a pas de liaisons H, la fréquence O-H se
situe entre 3600 et 3584 cm-1. Par contre pour l’alcool benzylique pur, avec de fortes et nombreuses liaisons H,
cette fréquence descend à 3300 cm-1.

104
L’alcool secondaire suivant (2,6,8-triméthyl-nonan-4-ol) voit son O-H à 3355 cm-1.

Le phénol montre les pics précédents: CAr-H (3045 cm-1), et CAr=Car aromatique (1580 cm-1).

105
6. Éthers.

La réponse caractéristique des éthers est associée à l’élongation du système C–O–C. Il y a une bande
d’élongation symétrique (faible en général, sauf s’il y a conjugaison) : 1030 cm -1 pour l’anisole ; et une bande
d’élongation asymétrique, toujours forte, vers 1200 cm-1 (1245 cm-1 pour l’anisole : E)

106
7. Cétones.

Tous les composés organiques comportant un groupement carbonyle C=O ont une absorption caractéristique
intense vers 1700 : c’est la bande la plus intense et la plus nette d’un spectre IR.

Une cétone aliphatique absorbe vers 1715 cm-1.

La conjugaison avec une double liaison C=C diminue la force de la liaison C=O et de la liaison C=C. Il y a effet
bathochrome pour les deux absorptions C=O et C=C (1685 -1666 cm-1pour le C=O).

Sur les deux spectres de cétones proposés, on va retrouver les respectivement à 1725 cm-1 (non conjugué) et
1683 cm-1 (conjugué). Il faut remarquer l’existence d’une bande d’élongation C–CO–C, de faible intensité, à
1172 cm-1 pour le premier composé, à 1255 cm-1, plus forte, pour la cétone aromatique. Cette bande est à
distinguer de celle des esters et des acides (beaucoup plus forte, dans la même zone de nombre d’onde).

107
8. Aldéhydes.

L’absorption de C=O se fait pour une fréquence un peu plus élevée que pour une cétone (1740–1720 cm-1).

108
9. Acides carboxyliques.

Deux bandes importantes : O-H et C=O. Les acides carboxyliques existent sous forme de dimères à cause des
très fortes liaisons H existant entre O–H et C=O :

Ainsi observe-t-on la plupart du temps le O-H du dimère. En solution très diluée dans un solvant apolaire, O-H
vaut 3520 cm-1. Lorsque le dimère existe, on a au contraire une bande très large et très intense entre 3300 et
2500 cm-1, sur laquelle se superposent les C-H alkyles et aryles (B sur le spectre de l’acide heptanoïque). Le
signal du C=O du monomère est intense et absorbe vers 1760 cm-1. Dans le dimère (qui est la structure
habituelle), la liaison C=O est affaiblie par la liaison H et la bande d’absorption subit un effet bathochrome
important : entre

1720 et 1706 cm-1 (ici 1715 cm-1).

109
10. Ions carboxylate.

On trouve deux bandes pour COO-, avec un effet bathochrome par rapport à la bande C=O : 1600 cm-1
(symétrique) (m) et 1385 cm-1 (asymétrique) (F).

110
11. Esters et lactones.

Ceux-ci ont deux bandes intenses qui permettent de bien les identifier : les C=O et C-O. À cause des effets –I de
O (tempérés par les effets +I du groupe alkyle), l’absorption C=O subit un effet hypsochrome :1750 – 1735 cm-1.

111
12. Halogénures d’acides.

Le C=O subit un effet hypsochrome, entre 1815 et 1785 cm-1 (1870 pour les fluorures). Ici, l’absorption se fait à
1790 cm-1 à cause de la conjugaison (A). Le C–Cl vibre à 875 cm-1 (C), et donne un harmonique assez net vers
1645 cm-1 (B).

112
13. Anhydrides d’acides.

Les deux carbonyles vibrent de manière couplée : . Aussi observe-t-on des fréquences
d’élongation asymétrique (1825 cm ) et symétrique (1758 cm ). À 1040 cm-1, il s’agit de l’élongation
-1 -1

symétrique et asymétrique.

113
14. Amides

Les amides sont caractérisées par les vibrations relatives à C=O, N–H essentiellement, C–N accessoirement (C-
N = 1425 cm ). Le C=O sort pour une fréquence plus basse que dans le cas des cétones (effets +E de N) et
-1

recouvre la bande correspondante au (1640 cm-1 pour ces bandes). Dans le cas de la N’N–diméthyl–
méthanamide, seul le C=O existe (1680 cm-1). Les bandes de vibration N-H sortent aux alentours de 3250 cm-
1
dans les produits purs à cause des liaisons H. Il y a deux bandes pour les amides primaires (élongations
symétrique et asymétrique) (ici 3350 et 3170 cm-1), l’asymétrique étant la plus intense. On ne trouve qu’une
bande dans cette zone pour les amides secondaires (3210 cm-1 pour la N–éthylpropanamide), et pas de bande du
tout pour les amides tertiaires.

114
15. Amines.

Comme pour les amides, on retrouve, mais en moins intense, les bandes suivantes : N-H: deux pour les amines I
(3365 et 3290 cm-1 ici), une pour les amines II et zéro pour les amines III ; C-N: 1063 cm-1 (pas de conjugaison).

115
16. Les nitriles.

La bande sort, comme pour les acétyléniques, vers 2200 cm-1 (2210 dans ce cas), mais elle est plus intense.
D’autres groupements absorbent intensément dans cette zone : les isocyanates –N=C=O, les isothiocyanates –
N=C=S , les diimides –N=C=N– et les isonitriles .

116
17. Dérivés nitrés.

Deux bandes très intenses correspondant aux élongations asymétrique (1520 cm-1) et symétrique (1345 cm-1) du
groupement –NO2 ressortent très nettement du spectre.

117
18. Hétérocycles aromatiques.

On retrouve les mêmes modes de vibration que pour les aromatiques :

* , entre 3077 et 3003 cm-1, comme pour les aromatiques (il y a ici un grand nombre de modes
d’élongation)

* ; lorsqu’elle existe, cette liaison fait apparaître une bande entre 3500 et 3220 cm -1 (cf. amides). C’est le cas
pour le pyrrole, l’imidazole, l’indole,...

* ; comme dans le cas des benzènes substitués, on compte le nombre d’atomes d’hydrogène adjacents
pouvant se déformer de manière couplée. Ainsi, pour la pyridine, il y a 5 H adjacents, ce qui correspond à un
benzène monosubstitué, et donc à deux modes de déformation hors du plan à 748 et 703 cm -1 Il y a 4 bandes de
squelette (B) pour la pyridine, moins pour les cycles à 5 chaînons.

118
19. Dérivés soufrés.

Les Thiols sont remarquables par l’existence d’une bande assez faible vers 2560 cm -1 (ici C : 2665 cm-1).
Comme les dérivés nitrés, les sulfones et autres acides sulfoniques, sulfonates,..., présentent deux bandes très
fortes vers 1350 cm-1 (ici 1351 cm-1) et vers 1180 cm-1 (ici 1176 cm-1).

119
20. Méthode d’étude d’un spectre IR :

1. Rechercher la présence d’un groupe C=O : présence d’une bande intense vers 1700 - 1800 cm–1. Si oui,
continuer ci-dessous, sinon, passer au §2

1.1. Essayer de trouver d’autres bandes caractéristiques des fonctions comprenant un C=O :

· CH des aldéhydes entre 2650 et 2800 cm–1.

· bande large et forte OH des acides entre 2500 et 3300 cm–1

· bande très forte CO des esters à 1200 cm–1

· bande attenante au CO de la fonction amide primaire et secondaire vers 1650 cm–1 et bande(s)N-H vers
3300 cm–1 (2 bandes pour les primaires et une pour les secondaires)

1.2. vérifier la fréquence d’absorption du CO en fonction des autres bandes trouvées :

· 1660-1685 pour les amides

· 1700 pour les acides

· 1715 pour les cétones

· 1720-25 pour les aldéhydes

· 1740-55 pour les esters

· 1780-1850 pour les lactones

120
· 1800-1870 pour les halogénures d’acide

2. Rechercher la présence de bandes fortes et pas trop larges vers 3250–3500 cm–1. Il s’agit d’élongations O-
H des alcools (3350),N-H des amines (2 bandes pour les primaires et une pour les secondaires) , C-H des alcynes
vrais (vers 3250).

3. Il reste les fonctions particulières :

· dérivés halogénés

· dérivés soufrés

· dérivés azotés (nitriles, isocyanates, etc...)

pour tous ceux-là, voir le tableau des valeurs IR

4. Enfin, étude des liaisons C–H autres que celles vues auparavant :

· CH : alcanes : 2850 à 2950 cm–1

· CH : alcènes : 3050 à 3080 cm–1, avec les C=C à 1640 cm–1

· CH : aromatiques : 3020 à 3050 cm–1, avec les  C H caractéristiques de la substitution (voir tableau) vers 650
- 900 cm–1, et les C=C vers 1450 – 1600 .

121
Utilisation de l’IR : Effets isotopiques

Comparaison entre υ (Z-H) et υ (Z-D)

1 k
2c Mz
 (Z-H)= Mz  1

1 k
2c 2Mz
 (Z-D)= Mz  2

 (Z  H ) 2Mz  2

 ( Z  D) Mz  2

ex :υ(O-H) = 3600cm-1
quelle sera (O-D) ?

 (O  H ) 2Mz  2 34
   1.89 1.37
 (O  D) Mz  2 18

:υ(O-D) = 3600/1.37 = 2619 En première approximation, on divise la fréquence par racine de 2 (1.41 ~1.37)
122
- Si on veut attribuer un signal, on remplace H par D, par ex, pour OH  OD, on agite dans D2O

υ(C-H) = 2850 cm-1

υ(C-D) = 2091 cm-1

C’est un effet isotopique.

- Intensité des vibrations

Pour avoir une interaction entre une onde électromagnétique et une molécule, il faut qu’il y ait absorption
d’énergie,
2 qu’il
2 y ait une variation du moment dipolaire de la molécule.
  
 ~  2 
 Q 

μ = moment dipolaire et Q = axe de vibration

pour avoir une absorption intense, il faut une variation intense du moment dipolaire
(par ex : le C=O car C(+) –O(-), grande variation du moment dipolaire,
C=C, le μ ne varie pratiquement pas ε ~0)
En IR, le ε est très grand et varie de 102 à 103, les petits ε sont de l’ordre de 10.

- Différences entre alcools et alcools associés :

υ (O-H) = 3600 cm-1 et υ (O-H)assoc = 3300 cm-1
les OH s’associent par liens hydrogènes (liens H)

la vibration est plus difficile si les OH sont associés

123
Spectrométrie de masse
1. Principe de la méthode.

Le spectromètre de masse est conçu pour répondre aux exigences suivantes :

 vaporisation et ionisation des molécules en phase gazeuse S

 séparation des ions en fonction du rapport m/z B
 séparation des ions selon leur énergie cinétique E
 détection des ions D

S  B  E  D
1RLC 2RLC 3RLC

si pas de E  simple focalisation

si E et B  double focalisation

E / B : géométrie conventionnelle
B / E : géométrie inversée

124
2. CHEMIN PARCOURU PAR LES IONS
Source d'ions (ionisation par impact d'électrons)
Un filament chauffé émet des électrons. L'interaction entre le nuage électronique des molécules neutres et ce
faisceau d'électrons provoque l'ionisation.

M  M(g)

M(g) + e  M+. + 2e

Les ions ainsi formés sont expulsés de la source par un potentiel positif et sont accélérés par une différence de
potentiel de plusieurs milliers de volts (V).

Si le potentiel d'accélération est de V volts, l'énergie cinétique des ions à la sortie des plaques accélératrices est
donnée par :

½ mv2 = ZeV

125
Analyseur magnétique
Un faisceau d'ions peut être focalisé par un champ magnétique perpendiculaire à la direction de propagation.
Dans ces conditions, un ion de masse m, de charge ze et de vitesse v est le siège de deux forces à son entrée
dans le champ magnétique : une force centripète (FB) et une force centrifuge (Fc).

FB = Bzev Fc = mv2/rM

A l'équilibre de ces deux forces, on a :

Bzev = mv2/rM
or ½ mv2 = zeV

 m/z = r²M.B².e/2V

Analyseur électrique
Un faisceau d'ions de même énergie cinétique peut être focalisé par un champ électrique créé entre deux laques
métalliques de rayon de courbure rE.
A l'équilibre entre force centripète (FE) et centrifuge (Fc), on aura :

FE = zeE Fc = mv²/rE

mv²/rE = zeE
or mv²/2 = zeV

 rE =
2V/E
126
Détecteur

Multiplicateur d'e (diode)

3. TYPES D'IONS
Ions moléculaires

- résultent de l'arrachement d'un e

- ce sont des cations radiaux (nombre impair d'e) M+.
- masse paire (sauf si la molécule contient 1 nombre impair d'azotes)
* généralement ions abondants  structure aromatique
peu abondants  pas de structure aromatique

Ions fragments

 compétitives
A  B consécutives
C  E  G
D

127
Ions isotopiques
Certains isotopes ont une abondance non négligeable qui se traduira évidemment dans le spectre par l'apparition
de pics satellites. Ainsi, on a le pic correspondant principalement à l'ion moléculaire contenant un 13C.
Connaissant l'abondance naturelle en 13C (1,1 %), on peut dès lors déterminer le nombre de carbone contenu
dans la molécule.

* Intensité du pic isotopique = nombre de C x 1,1 % *

__________________________________________

La présence de soufre est assez facile à détecter grâce à l'abondance assez importante de 34S (4 %) donnant lieu à
un ion (M + 2)* inhabituellement intense. L'abondance particulièrement élevée des isotopes 37Cl et 31Br est
également extrêmement utile pour mettre en évidence ces éléments. la figure 2.3 donne le spectre de masse du
bromobenzène où l'on distingue nettement l'ion moléculaire à m/z 156/158, les pics situés à m/z 157/159
correspondant à l'incorporation de 13C.

128
1 31
H 1,0078246 99,985 % P 30,973764 100,000
2 32
H 2,0141022 0,015 S 31,972072 95,000
7
12 33
C 12,000000 98,893 S 32,971463 0,760
0 5
13 34
C 13,003355 1,107 S 33,967862 4,240
4 8
14 35
N 14,003073 99,634 Cl 34,968853 75,529
8 1
15 37
N 15,000108 0,366 Cl 36,965903 24,471
8 4
16 79
O 15,994914 99,759 Br 78,91839 50,537
1
17 81
O 16,999132 0,037 Br 80,91642 49,463
2
18 127
O 17,999161 0,204 I 126,90466 100,000
6
19
F 18,998402 100,000
2

129
Ions métastables
Considérons la réaction : M+1  m+2 + m3
selon l'énergie interne acquise par m+1 lors du processus d'ionisation :

 la durée de vie de m+1 est > au temps de vol entre source et collecteur (>10-5s) et on enregistre m+1
 la durée de vie de m+1 est très courte (<10-6 s) et on collecte m+2
 la durée de vie de m+1 est comprise entre 10-5 et 10-6 s, la fragmentation se produit entre la S et le D et l'ion
m+2 ainsi formé est enregistré sous forme de pic diffus à une position ne correspondant ni à m+1, ni à m+2.

L'énergie acquise par m+1 à la sortie de S est donnée par ½ mv² = zeV.

Si m+1 se décompose avant B, cette énergie est partagée entre m+2 et m3 :

½ m1v² = ½ m2v² + ½ m3v² = zeV

et l'énergie cinétique de m+2 est donc ½ m2v² = (m2/m1)zeV

Cet ion traversera le rayon de courbure (rM) de B si

m2/z = r²M.B².e/2(m2/m1)V

Pour un tel rapport B²/V, un ion de source m* sera focalisé si :

m*/z = r²M.B².e/2V

En substituant r²M entre ces 2 équations, on aura finalement

 m* = m²2/m1
130
Ions métastables

m+1  m+2 + m3

m* = m²2 / m1
 
ions ions
fragments parents

131
4. Haute résolution
Des spectromètres à hautes performances sont particulièrement intéressants si l'on désire différencier des ions de
même masse entière, mais de masses exactes différentes. En effet, le poids atomique du carbone est 12
exactement, tandis que ceux de l'hydrogène, azote et oxygène sont respectivement 1,00782, 14,0031 et 15,9949.
Il est donc évident que bien que des molécules telles que CO, C 2H4 et N2 aient la même masse entière, les
masses exactes de ces trois espèces seront différentes.

CO 27,9949

C2H4 28,0313

N2 28,0061

Si on a assez de précision, on pourra distinguer CO, C2H4, N2

132
Pouvoir de résolution

 M/M

2 pics de masse M et M+M sont résolus si la hauteur de la vallée les séparant ne dépassent pas
10% de la hauteur totale

Ex :
1. Pour séparer les ions m/z = 100 et 101, quel pouvoir de résolution faut-il ?

2. Quel PR faut-il pour pouvoir séparer les ions moléculaires du benzaldéhyde et de

l’éthylbenzène ?

133
134
135
5. Techniques d'ionisation

 E.I. (m/z 20-500)

m+1, m+2.....

M+ e  M+ + 2 e 

 FAB
protéines, peptides,....

 ionisation chimique (C.I.)


G + E  G+. + 2 e

 
CH4 + e  CH4+. + 2 e

CH4+. + CH4  CH5+ + CH3.

M + GM+  MH+ + G

ex : G = C4H8, CH4, NH3

GH+ = C4H9+, CH5+, NH4+

136
Problèmes liés à la source par impact d’électrons

137
138
FAB

139
Electrospray

140
141
MALDI

142
Exercices

143
144
Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Les premiers signaux de RMN ont été obtenus par deux groupes de physiciens, l'équipe du Professeur BLOCH
(Stanford) et celle du Professeur PURCELL (Harvard). Cette technique s’est rapidement développée en visant
de multiples applications :

- la chimie avec l'élaboration des structures chimiques et la dynamique moléculaire,

- plus récemment, le domaine médical avec l'Imagerie par Résonance Magnétique (ou I.R.M.)...

Les aspects de la RMN

La résonance magnétique nucléaire (RNM ou NMR en anglais) est une méthode puissante d’un point de vue
qualitatif et quantitatif. Elle regroupe différents aspects :
a) La spectroscopie RMN
C’est une technique exploitant les propriétés magnétiques de certains noyaux. Elle est applicable pour tout
noyau possédant un spin (voir plus loin). Le spectre RMN (absorption en fonction de la fréquence) obtenu donne
des informations sur le nombre et le type d’entités chimiques constituant une molécule.
b) L’imagerie par RMN
Cette technique est abrégée par IRM : Imagerie par résonance magnétique (MRI en anglais). Elle permet la
production d’une image représentant une tranche ou un volume du corps humain (très utilisée en médecine).

c) La relaxométrie
Elle concerne la désexcitation des noyaux quand ils ont été excités.
145
La RMN permet de résoudre les problèmes de détermination de structure des composés organiques.
C’est une méthode qui tire les informations de l’interaction qui peut apparaître entre les noyaux des atomes
présents dans l’échantillon quand on le soumet à un champ magnétique intense et constant produit par un
aimant.

On place dans un aimant un échantillon contenant, par

exemple, de l’eau. Cet aimant va créer un champ
magnétique dans l’environnement de l’échantillon.
Autour de celui-ci, il y a une bobine connectée à un
détecteur radio.
De l’autre côté de l’échantillon, il y a une autre bobine
connectée à un émetteur radio.
On envoie sur l’échantillon une onde radio (grâce à
l’émetteur). L’échantillon réémet alors une onde radio
qui est spécifique à sa composition.
Le détecteur récupère cette onde : le signal est
transformé en spectre RMN qui représente les pics qui
proviennent des noyaux d’hydrogènes en fonction de
la fréquence.

146
Quels sont les noyaux pouvant donner ce phénomène de résonance magnétique nucléaire ?

L’atome est constitué de :

 Un noyau
 Un nuage électronique (électrons)
Le noyau est lui-même constitué de :
 Protons (éléments +)
 Neutrons (éléments neutres)

Tout élément dans le tableau périodique est caractérisé par :

147
1. Phénomène de la R.M.N.

Tout noyau est caractérisé par un spin nucléaire I.

Les noyaux, comme les électrons, ont aussi un spin. Il y a un spin pour chaque particule.

Ex : le proton H+  I = ½ ou –1/2

Quand on a plusieurs nucléons (noyaux plus complexes), les particules s’organisent en couche à peu près
comme les e-. Les spins se combinent les uns aux autres  spin du noyau pris globalement.

148
Tous les noyaux ne peuvent pas être étudiés par RMN  Règles :

1. si on a un noyau avec un nombre de masse et un nombre atomique pairs, le spin total du noyau = 0
I=0
12 16 18 32
ex : 6 C ; O
8 ; 8O ; 16 S  I =0 et ne peuvent pas être étudié par RMN

2. si le nombre de masse est impair, le spin nucléaire est demi-entier

1 13 15 19 31
ex :
H 1
; 6 C ; 7 N F
; 9 ; 15
P  I= ½
11
ex : 3 B  I =3/2 ; 23
Na  I = 3/2
17
ex : 8 O  I =5/2

3. Si le nombre de masse est pair et le nombre atomique est impair, I est un nombre entier.
2 14
Ex : H ; 7
1
N I=1

Si I est différent de 0, on a un spin nucléaire, on peut considérer le noyau comme tournant sur lui-même or le
noyau a une charge qui tourne  moment magnétique 
149
Il y a aussi une masse tournante  moment cinétique p

1.1. Moment cinétique d’un noyau atomique.

L’existence d’un moment cinétique p pour certain noyau rend celui-ci semblable à une charge électrique en
rotation.

1.2. Moment magnétique du noyau atomique.

Il en résulte pour le noyau un moment magnétique  proportionnel à p:   p où , le rapport gyromagnétique,

est une constante caractéristique du noyau considéré.

Que se passe-t-il lorsqu’on met les noyaux dans un champ magnétique H0?

Le noyau avec I  0 se comporte comme un petit aimant, il a une énergie différente selon la direction. Les
niveaux sont quantifiés. On ne peut pas avoir n’importe quelle orientation. Il faut que la projection de p sur le
champ magnétique = m h (avec m = nombre quantique magnétique)

M = -I, -I+1, ….I-1, +I, on passe de -I à +I par saut de 1.

Pour un spin I, le nombre d’orientation est égal à 2I+1, chaque orientation étant un niveau énergétique. Il y a
donc 2I +1 niveaux énergétiques.

Ex :

Pour I=1/2, les orientations possibles de p sont telles que la projection de p doit être soit à –1/2 ou à +1/2
150
Pour I=1, les orientations possibles de p sont telles que la projection de p doit être soit à –1, 0 ou +1

Pour I=5/2, les orientations possibles de p sont telles que la projection de p doit être soit à –5/2, -3/2, -1/2, ½,
3/2 ou 5/2

En spectroscopie RMN, on envoie des ondes de bonnes énergies pour passer d’un niveau à l’autre. Les niveaux
étant équidistants, l’énergie est constante.

Plus on utilise un champ magnétique intense, plus B0 est grand et plus il faudra de l’énergie pour passer de l’état
fondamental à l’état excité.

Le retour de l’état excité vers l’état fondamental est le phénomène de relaxation, c’est ce phénomène de
relaxation qui est à la base de la spectroscopie RMN.

La différence E, entre les 2 états est de : E= E2-E1= γ h/2 B0

 E est proportionnel au champ B0

151
Rem : Si I=0, γ = 0  pas de niveaux énergétiques, pas de RMN

1.3. Transition entre ces niveaux d’énergie.

Il y a une relation directe entre la fréquence pour passer d’un niveau à un autre et B0

 = γ/2 B0

C’est la relation fondamentale de la RMN. (la fréquence est proportionnelle à B 0 et au rapport gyromagnétique
donc selon le noyau), c’est la relation de Larmor

Exemples : expérimentalement, on constate que, placés dans un champ magnétique de l’ordre de 1,4 T (Tesla),
les protons absorbent l’énergie électromagnétique vers 60.106 Hz (fréquence radio). Placés dans le même champ,
les noyaux du carbone 13 (13C) absorbent vers 15.106 Hz. Les noyaux de fluor 19 (19F) absorbent vers 56.106 Hz.

Rem :

Champ terrestre : ½ G = 0,00005T=50 µT

Champs couramment utilisés en RMN : 1.4T, 4.7T, 7.05T, 9.4T

Ce qui correspond pour le proton à : 60 MHz (=5 m), 200 MHz (=1.5 m), 300 MHz (=1 m), 400 MHz
(=0,75 m)

(vous retenez que 20 MHz =0.47 T)

152
2. Le déplacement chimique.

2.1. Phénomène du déplacement chimique.

Lorsque l’atome d’hydrogène est engagé dans une liaison, le champ magnétique régnant au niveau du noyau est
différent du champ magnétique appliqué B0 .

On peut, en effet, considérer que les électrons de liaison forment un écran autour du noyau, écran qui se
manifeste par l’apparition d’un champ local B0 opposé au champ B0 et proportionnel à ce champ : B0 = – B0
La constante de proportionnalité  , appelée constante d’écran, est indépendante du champ appliqué B0. Elle
est fonction de l’environnement chimique du noyau, donc fonction de sa nature chimique.

Pour un proton caractérisé par une constante d’écran , la fréquence de transition de spin de ce proton vaut :

Il résulte que placés dans un champ magnétique H0 , les divers protons d’une molécule organique absorberont
l’énergie à des fréquences différentes qui seront fonction des constantes d’écran, donc de l’environnement
électronique c’est-à-dire de la nature chimique des protons présents. L’analyse de ce « déplacement chimique »
des fréquences d’absorption fournira des renseignements sur la structure des molécules organiques.

153
2.2. Mesure de déplacement chimique.

La fréquence d’absorption d’un proton est proportionnelle au champ magnétique appliqué. Il n’est donc pas
commode d’exprimer le déplacement chimique en fréquence puisque ce repère dépend du champ utilisé.

Aussi repère-t-on pratiquement les signaux de composé étudié par rapport au signal d’un composé de référence
qui est généralement le tétraméthylsilane . Le tétraméthylsilane (ou TMS) a été choisi pour sa volatilité
(Teb=26°C), son inertie chimique, et une constante d’écran très élevée (il n’existe que très peu de composés
organiques dans lesquels des hydrogènes présentent des  supérieurs).

Le déplacement chimique (mesuré en fréquence) du signal d’un proton par rapport au TMS est donné par :
B0 B B
  TMS  (1   )  0 (1   TMS )  0 ( TMS   )
2 2 2

Pour faire disparaître le terme B0 on divise les deux membres de cette relation par , ce qui conduit à une
grandeur notée  indépendante du champ H0 appliqué
B :
( 0
 )
  TMS 2 TMS
   ( TMS   )
TMS B0
(1   TMS )
2

(On peut négliger devant 1 , car il est de l’ordre du cent millième).

154
Remarques importantes :

a) les constantes  sont de l’ordre du millionième et il en est évidemment de même de leurs différences. Le
déplacement chimique  sera donc généralement exprimé en « parties par million» (ppm)

b) Fréquence d’absorption et champ magnétique sont liés par une relation linéaire.

Les spectres sont présentés dans la forme ci-dessous :

Les signaux apparaissant à droite dans le spectre correspondent aux  les plus élevés.

Le déplacement chimique va croissant de la droite vers la gauche et est indépendant du champ externe.

155
La relation entre le déplacement mesuré en Hz et le déplacement chimique est de façon générale: « déplacement
en Hz » =  (ppm)  A (MHz), où A est la fréquence de fonctionnement du spectromètre.

soit, pour un appareil à 60 MHz :

60 106 x 7,3 (en ppm) = 60 106 x 7,3 10-6 = 438 Hz

Inversement, pour passer des fréquences en ppm :

le CH2 de l’éther absorbe à 338 Hz à 100 MHz

  = 338 /(100 106) x 106 = 3,38 ppm

Si on parle en fréquence (en Hz), il faut toujours préciser le champ.

Si on parle en ppm, c’est plus général (valable pour tous les champs).

156
Causes du glissement chimique

1. densité électronique du proton (et circulation des e-)  blindage du proton d’autant plus grand que la
densité électronique est grande.

δ (ppm)
CH3-Y Y=H 0,28
Y=I 2,16
Y=Br 2,62
Y=Cl 3,02
Y=F 4,25

Effet paramagnétique bien que élément diamagnétique. F est plus électronégatif, moins d’e - aux environs du
CH3 -> résonance aux fréquences plus grandes.

Effet paramagnétique ou déblindage: renforce le champ perçu ( à gauche dans le spectre)

Effet diamagnétique ou blindage : diminue le champ perçu ( à droite dans le spectre)

157
RCOH : 10 à 13 ppm, très à gauche dans le spectre, cas idéal pas d’e- autour, champ effectif ~H0

Hydrogène fixé sur C de type sp3, sp2, sp

Sp3 : à droite (~1 ppm) ;

sp : 2,3 ppm ;

sp2 : 5 ppm

phényle : 7

 comment expliquer cela ???

Si on regarde l’ordre d’acidité :  C -H > =C-H > -C-H

Normalement, la  C -H serait à gauche mais il y a une inversion.

Il y a 2 causes : le courant circulaire et l’anisotropie diamagnétique du lien chimique.

158
A. Courant circulaire :

Le benzène

Courant circulaire

champ champ

induit induit
159
il y a une circulation des e- sur les orbitales qui font le tour du benzène, ce n’est plus un effet local. Le
courant circulaire sera différent selon l’endroit où l’on se trouve.

Près des H dans le plan du noyau aromatique, on aura un déblindage par contre au dessus/en dessous de ce
plan, on aura un blindage.

Le système  du benzène (e- délocalisés) étant polarisable, un champ magnétique provoque un courant d’e-
autour du cycle comme il le ferait dans une spire conductrice. Ce courant de cycle crée en retour un champ
magnétique induit qui augmente le champ auquel sont soumis les H et diminue au dessus et en dessous du
cycle aromatique.

Les H sont sp2, normalement comme =C-H (alcène) mais à cause du courant circulaire, on a un champ qui
s’additionne à H0 ext donc par rapport à =C-H, il y a un glissement vers la gauche.

Cet effet existe chaque fois qu’il y a (4n+2) e - chaque fois qu’il a un noyau aromatique. (pour rappel :
(4n+2) e- est le critère d’aromaticité)
blindage
déblindage déblindage

160
Exemples :

1. [14] annulène
H
H H

H H
HH
HH
H H

H H
H

10

4
=C-H

7.6 5 0 ppm
161
10 : déblindage (H vers l’extérieur)

4 : blindage (H vers l’intérieur)  courant circulaire

2.

CH3 CH3

162
 10

2 CH3

=C-H C H

7.6 5 0 -2 ppm

déblindage blindage
par rapport par rapport
=C-H C-H

rem : pour les anti-aromatiques (régles : (4n)e-), c’est l’inverse : déblindage au centre et blindage extérieur.

Ex : [16] annulène (anti-aromatique)

12 H vers extérieur (vers 5.5 ppm, blindés) et 4 H vers intérieur (vers 11.3 ppm, déblindés)

B. Anisotropie diamagnétique du lien chimique

L’influence du champ n’est pas la même selon l’orientation du lien chimique. Cet effet est important pour
l’acétylène.
163
 La triple liaison est riche en e-. Le nuage électronique est très polarisable. Espèce de boudin avec beaucoup
d’e-, circulation diamagnétique et lignes de forces s’opposant au champ extérieur.
Ho

C
C

Quand la molécule est parallèle au champ, les e circulent perpendiculairement au champ. Il en résulte des
lignes de force qui s’opposent au champ appliqué  blindage des H.

Au champ extérieur, s’oppose un champ induit avec le résultat que bien que proton très acide, cet effet
d’anisotropie provoque un glissement vers la droite, donc un blindage.

si la triple liaison est perpendiculaire du champ extérieur, il ne se passe rien.

Hydrogène aldéhydique RCOH

On observe l’effet inverse. H aldéhydique n’est pas acide, mais il absorbe au dessous de 9-10 ppm (façon de
reconnaître un aldéhyde). Ce déplacement chimique s’explique aussi par une anisotropie du lien chimique. H
apparaît très déblindé.

2.3. Facteurs agissant sur le déplacement chimique.

164
Voir tables donnant les déplacements chimiques correspondant à divers types de protons :

remarques sur les tables qui accompagnent les exercices :

tableau I : protons sur carbone saturé (H sur carbone sp3)

CH3- alk : 0,9 ppm

-C=C- : 1,7 ppm

-CO : 2 – 2,10 ppm

-SH: 2,10 ppm

-NHR: 2,15 ppm

-I:2,16 ppm

-Phényl:2,34 ppm …

Si voisin de N, O : glissement vers la gauche car N, O électronégatif

Influence des substituants en  : petite influence, effet mais amoindri

CH3-CH2-CH2- Br :

1,05 1,9 3,4ppm (observé)

165
0,9 1,25 3,34 (en théorie)

Tableau II : 2 substituants sur le même C  règle d’additivité, règle de Shoolery

NC-CH2-Cl : 2 effets qui s’additionnent

CH2 = 1.25 +a1 +a2

= 1.25 + 2.0 + 1.2

= 4.45 ppm (approximatif mais donne une bonne indication)

Tableau III : carbones insaturés

H voisin de l’azote : effet inductif de l’azote

Noyau aromatique avec substituants :

Donneurs d’e- : densité électronique augmente, déplacement vers la droite (blindage)

Capteurs d’e- : densité électronique diminue, déplacement vers la gauche, déblindage

166
Cet effet ne se marque pas de la même façon pour les mésomères en o, m, p

Tableau IV : valeur de base pour le phényle : 7.27 ppm

NH2
o

m
p

o : 7.27 - 0.75 = ~6.5 ppm en réalité : 6.44 ppm

m :7.27- 0.25 =~7 ppm 6.99 ppm

p : 7.27 – 0.65=~6.6 ppm 6.59 ppm

effet NH2: donneur d’e-, o et p glissement vers la gauche, car densité électronique accrue.
OCH3

A
B

NO2

A : 7.27 - 0.5 + 0.25 = 7.02 ppm (en réalité : 6.9 ppm)

167
B : 7.27 - 0.1 + 0.95 = 8.15 ppm (en réalité : 8.1 ppm)

NO2

A A
B B

CHO

A : 7.27 + 0.95 + 0.15 = 8.37 en réalité : 8.39 ppm

B : 7.27 +0.26 + 0.60 = 8.13 8.09 ppm

glissements vers la gauche puisque NO2 est capteur inductif et mésomère

2.4. Intégration des signaux.

Dans un spectre RMN, l’énergie absorbée par une espèce donnée de protons est proportionnelle au nombre de
protons. C’est-à-dire que l’intensité du signal, qui est mesurée par sa surface, est proportionnelle au nombre de
protons. L’intégration des aires des signaux est obtenue directement et se présente sous la forme d’une série de
paliers (figure suivante). La hauteur de chaque palier est proportionnelle à l’aire intégrée du signal
correspondant.

168
Le spectre représenté ci-dessus est celui de l’alcool benzylique. La hauteur du palier correspondant aux protons
aromatiques est de 35 mm. Celle du palier correspondant au groupe –CH2– est de 14 mm, soit bien les 2/5 de 35
mm. Même raisonnement pour le proton de la fonction alcool.

Il est très important de noter que l’intégration ne fournit pas le nombre de protons en valeur absolue. On
pourrait tout aussi bien avoir un nombre de protons égal à 10, 4 et 2 pour le spectre ci-dessus.

Aspect du spectre

On a différents noyaux à différentes fréquences, il y a des déplacements chimiques différents. Si on augmente la

résolution, on peut voir la structure de chaque signal :

169
170
Chaque pic d’un signal est séparé d’un certain nombre de Hz (ou ppm).

Explication :

Un spin nucléaire n’est pas isolé.

X Y
R C C R'
HA HB

HA est influencé par HB et vica versa, 2 transitions de HA suivant que le spin HB est parallèle ou antiparallèle au
champ.

 HA apparaît sous forme de 2 lignes de même grandeur

A B

J J

HB est influencé aussi par HA, donc doublet

Chaque ligne du doublet est séparée par J qui est appelée constante de couplage (exprimée en Hz)

C’est un effet indépendant de B0 car HA et HB s’influencent toujours de la même manière

171
 X Hc
R C C R'
HA HB

HA : influencé par HB et HC (considérés comme ~=)

HB HC 4 possibilités de même probabilité

  25 %
 

  50%
  25%
A

HB et HC influencés par HA, donc 2 doublets

172
 X Hc
R C C HD
HA HB
(CH3)

HA est influencé par HB, HC et HD

HB HC HD

+ + +

+ + -

+ - +

- + +

+ - -

- + -

- - +

- - -

4 pics d’intensité 1, 3, 3, 1

173
Généralisation

H couplé à n hydrogènes voisins  (n+1) pics

CH3 CH3

CH3 : doublet

CH : 7 pics, septuplé dont l’intensité sera donnée par le triangle de Pascal

174
Intensité

1 1

1 2 1

1 3 3 1

1 4 6 4 1

1 5 10 10 5 1

1 6 15 20 15 6 1

on risque de ne pas toujours tout voir, par ex : 1 par rapport à 20

Il existe un autre type de raisonnement

175
HA avec 1 voisin
HA

HA avec 3 voisins (- CHA-CH3)

HA

5 A-B
1 1
5 A-C

1 2 1
5 A-D

1 3 3 1

Valeurs de J :

176
Tableau VI

Quand on a une molécule figée, on a différentes valeurs suivant l’angle dièdre

Détection facile des isomères cis-trans

Ha Hb

R Hc

on remarque que le proton Ha est plus déblindé que Hb et Hc.

177
178
On peut aussi observer les constantes de couplage avec le fluor

Rem :

1. Si des noyaux sont équivalents, la constante de couplage n’apparaît pas dans le spectre. (constante de
couplage GEM, H sur un même carbone)

CH4, éthane, benzène : les constantes n’apparaissent pas car les H sont équivalents

Cyclohexane : on a une valeur moyenne : positions équivalentes

Ether : CH3CH2OCH2CH3 : constante vic ~7Hz CH2-CH3

179
2. Si les H voisins ne sont pas équivalents, pas aussi simple

cas de l’isomèrie cis -trans

Ha Hb

R Hc

Ha –Hc : constante trans : 15 Hz

Ha-Hb : constante cis : 10 Hz

Hb-Hc : constante GEM : 3 Hz

On aura 3 parties avec 4 pics

3. Spectres du second ordre

Spectre du 1er ordre si J  /10 (J << ) et la règle des (n+1) pics est valable

Si J ~ , nous avons des spectres du second ordre (spectres complexes)

180
Aspect des massifs aromatiques

À 7.27 ppm : benzène

Intégration : nombre d’H

Positions des pics : calcul de la position relative avec les tableaux

Toluène : pic unique

Aniline : pics repartis sur une gamme de gliss vers la droite car NH2 donneur mésomère

Noyau substitué (même subsituant) en ortho : spectre symétrique

En méta : offset, gliss vers la gauche

En para : 1 seul pic

Si les substituants sont différents : en ortho et méta: spectres compliqués

En para : spectre symétrique

181
Phénomène de coalescence :

Phénomènes liés à la durée de vie

 h
Et  h 
2

si t= , on a un niveau énergétique bien défini

si t= 0, on a une indétermination sur l’énergie

en RMN, nous avons des pics assez étroits, durée de vie non infiniment longue, les pics s’élargissent ??

ex : diméthylformamide
(-)
O O
H C CH3 H C CH3
N
- N
CH3
(+) CH3

2 singulets et pas 1 doublet (puisque la rotation C-N n’est pas aisée)

lorsqu’on chauffe, la largeur des pics augmentent (la hauteur diminue)

quand on chauffe, ça tourne plus vite, le temps de vie diminue

on a coalescence : les 2 pics se rapprochent et deviennent un pic à une position moyenne

Parfois, selon le cas, il faut refroidir pour observer le phénomène

182
Ex : pour C6H12 (cyclohexane)

A temp ordinaire, un signal

A –60°C, on observe un élargissement

A –100°C, 2 pics

 A temp ordin, on a donc coalescence.

Hydrogènes fixés sur des hétéroéléments :

Sur un carbone : effet intramoléculaire qui fixe la position dans le spectre

X-H : effet intermoléculaire : si il y a des liens H, on a une perturbation de la position des protons

Positions différentes selon la concentration, le solvant, la température

 peu de renseignements structuraux

ex : pour R-OH : il n’y a pas de tables pour savoir comment varie le spectre en fonction de R par contre la
position dépend du solvant, de la concentration et de la température

Le OH peut se déplacer sur une large gamme de (pic mobile)

Tous les H sont relativement facilement « deutériable »

183
-OH -OD

-NH + D2O -> -ND  le pic disparaît

-SH -SD

Valeurs :

Acides associés très fort inter-moléculairement, la position bouge assez peu

 10 –13 ppm

les amines ont en général des pics relativement larges (surface du pic = nombre d’H)

ROH + solvant deutéré  ROD + solvant H

Échange très rapide

 coalescence des signaux : on aura un seul pic

CH3-CH2-OH : si H s’échange rapidement, le couplage CH2OH ne peut plus se marquer

184
En résumé, les déplacements chimiques selon le type de protons :

185
Séquence utilisée pour l’enregistrement d’un spectre RMN :

186
Rapport signal/bruit
La RMN est peu sensible, vu que peu de noyaux font la transition.
Il faut résoudre le problème du rapport « Signal/Bruit » (S/N).

Le signal dépend :
 De la concentration du produit en solution
 De l’abondance du noyau observé
Pour augmenter « S/N », on utilise la méthode de l’accumulation : on enregistre le même spectre plusieurs fois
et on cumule tous ces spectres.
Le bruit est aléatoire : il n’y aura jamais deux fois le même bruit au même endroit sur un même spectre. Donc,
en cumulant un grand nombre de spectres, la moyenne du bruit diminue.

 S/N augmente !
 Si on prend « n » spectres, S/N augmente selon n1/2
(Exemple : Si n = 100, S/N augmente de 10 et si S/N = 1 : avec 4 accumulations, S/N est doublé!).
187
La limite est évidemment le temps qu’il faut pour générer une quantité nécessaire de spectre pour que le spectre
final soit acceptable.

Les autres atomes utilisés en RMN

La théorie de la RMN a été précédemment développée autour de l’atome de 1H.
Cependant, la RMN est applicable à d’autres noyaux et les mêmes propriétés sont valables, avec quelques
variations selon la nature de l’atome envisagé.

188
Le Carbone 13 (13C)
a) Abondance et sensibilité
Le 13C a une abondance isotopique de 1,1% : il y a 1,1% de chance d’en avoir au sein d’une molécule. Dans de
pareilles conditions, la CRMN est 6000 fois moins sensible que la HRMN (peu de noyaux font la transition).
Pour résoudre ce problème, on enrichit la molécule en 13C pour augmenter le taux de 13C au sein de celle-ci : dès
lors, la sensibilité augmente 100 fois. Elle est toutefois toujours 60 fois moins sensible que la HRMN.
b) Moment magnétique
Le 13C a un spin de ½  parfait pour la RMN.

c) Gamme de déplacement chimique

La gamme de δ C est plus large que celle du δ H.
d) Signal et bruit
On utilise la méthode d’accumulation (décrite plus haut).
L’avantage est qu’il n’y aura pas de bruit de fond si le solvant utilisé est de l’eau ! En effet, H ne perturbe en
rien la C-RMN.
Si l’on étudie le spectre 13C d’un foie perfusé (solvant = eau), on ne verra que les pics des métabolites !
e) Couplage
Dans les spectres au carbone 13, on ne voit pas de couplage. De ce fait, chaque carbone distinctif
dans une molécule donne lieu à 1 pic.

Exemple :
Les cercles de même couleur désignent les C de même type.
Il y a 6 types distincts de C dans cette molécule
189
  On aura un spectre à 6 pics.

f) Exemple d’utilisation

On peut étudier le cycle de Krebs grâce à la C-RMN. Toutes les molécules impliquées sont carbonées.
On administre à un animal ou à un organe du glucose enrichit en carbone 13 au niveau du carbone 1 (on a acheté
du glucose enrichit en carbone 13 sur le carbone 1 à 50 %  au lieu d’avoir 1% de carbone 1 avec C13, on en a
50%  le pic sera 50 fois plus grand que ceux des autres C!).
Chaque transformation du glucose dans la voie biochimique va induire un déplacement sur le carbone 1(fin : C13
est sur le lactate). On va donc pouvoir suivre le carbone de proche en proche et réaliser une cinétique du
processus biochimique.
Spectre en abondance naturelle ≠ spectre en enrichissement.

190
Le Phosphore 31 (31P)
a) Quelques caractéristiques

Le phosphore 31 a le même avantage que le C13 : il n’y a en effet pas de signaux parasites puisque l’on ne voit
que les phosphores des molécules d’intérêt (métabolites de la chaîne énergétiques essentiellement en biologie).
La PRMN est une bonne méthode d’évaluation de l’état cellulaire.

Le phosphore 31 a:
 Un spin = ½ parfait pour la PRMN.
 Une abondance isotopique naturelle = 100 %
 Une sensibilité (intrinsèque) relative de 6,6 10-2  le phosphore est plus sensible que le carbone mais
moins que H.
 Un rapport gyromagnétique de 10 (2,5 fois plus petit que 13C) il résonne à 40 MHz.

191
b) Déplacement chimique

192
pH et déplacement chimique

Remarque : le phosphate inorganique vient de l’acide phosphorique H3PO4

Chaque « retrait » d’un H se fait à un pKa particulier.

pK = valeur du pH où on a 50 % de HA et 50 % de A- :
H-A  H+ + A-

193
Pour le phosphore 31 :

Le déplacement chimique se fait en fonction du pH pour le phosphore 31 : il se réalise à des valeurs de pH

proches du pKa.
Le pKa de l’une des réactions acide-base de l’acide phosphorique se trouve près de 7 (proche du pH
physiologique).
 si on a une petite variation de pH, on aura une grande variation des concentrations des 2 molécules  un
grand déplacement chimique

C’est une méthode utilisée pour mesurer l’acidose cellulaire : la mesure du pH se fait selon la valeur de
l’absorption (pic du Pi). (voir plus loin Ischémie – reperfusion d’un cœur)

194
 c) Couplage spin-spin

Il existe des couplages entre le P et différents atomes :

195
Voici le spectre de la molécule ci-dessous :

196
Voici le spectre de l’ATP, de PCr (phosphocréatine) et Pi :

L’ATP a 3 phosphates. Le Pβ est lié aux deux autres : selon la règle du « n+1 », son pic est un triplet ! C’est le
couplage P-P !

d) Utilisation de la PRMN

On peut réaliser différents spectres d’organes in vivo (humain ou animal) :

 HRMN tête  H2O
 HRMN muscle  graisse –CH2-
 CRMN  pas de parasite de l’eau
 PRMN idem + métabolites énergétiques

197
 Spectre PRMN d’un muscle de grenouille :

4 pics sont présents sur le spectre d’un muscle, ils proviennent :

 De l’ATP
 De la phosphocréatine
 Du phosphate inorganique

198
On a tout ce qu’il faut pour réaliser le métabolisme énergétique :
 on a la réserve de phosphore sous forme de phosphocréatine  régénère l’ATP
 on a le combustible sous forme d’ATP
 on a le sous-produit sous forme de phosphate inorganique

En médecine, on réalise un spectre du muscle in vivo au niveau du pied (on place celui-ci dans l’appareil RMN)
et on demande au patient de faire travailler son muscle pour évaluer les métabolites : cela évite de faire une
biopsie, notamment chez les patients atteints de dystrophie !

Imaginons que l’on fait un garrot pour bloquer l’arrivée de sang au niveau du
muscle. Si l’on effectue un travail, le pic de P-Cr diminue et le pic de Pi
augmente car il n’est pas réutilisé pour régénérer l’ATP. Le pic de ce dernier
se maintient au début et finit par diminuer lorsque son stock (ATP) est
épuisé.
De manière totalement non invasive, on a étudié le fonctionnement du
métabolisme énergétique du muscle !

Spectres de différents organes

1: PME, 2: Pi, 3: PDE, 4: PCr, 5,6,7 :ATP α, β et γ

199
Dans le foie, le pic de PCr n’est pas présent.

Dans un cerveau « vivant », c’est le pic d’ATP qui domine.

Dans un cerveau mort, c’est le pic de Pi qui est le plus important.

200
Cœur de rat isolé ou perfusé

Le dispositif est composé :

 d’un tube de RMN (2 cm de diamètre)
 d’un tube qui amène le liquide de perfusion au cœur
 d’une pompe qui élimine ce liquide pour garder un volume constant
 d’une tige dans le ventricule (avec un ballon) connectée à un capteur de pression
Dans de telles conditions, le cœur peut vivre 7 minutes.
NB : on peut réaliser ce système avec d’autres organes comme le foie ou le pancréas.
On va créer une ischémie – reperfusion :

201
202
On occasionne une ischémie, assez longue pour provoquer une lésion du tissu mais pas suffisamment pour
permettre une réversibilité du phénomène (reperfusion).
On observe :
 une acidification (lactate) et
 Le pic du phosphate inorganique est un excellent pH mètre (voir plus
haut)
 une diminution du pic de PCr de 20 %.
Lorsqu’on rétablit la situation, on observe :
 une récupération du pH de base après environ 1 heure
 une récupération de PCr (pas à 100%) qui peut être quasi-totale avec un traitement au Fantofarone
Cette technique est puissante pour la mise au point de médicaments comme des cardioprotecteurs, etc.

203
L’azote 14 (14N) et l’azote 15 (15N)
L’azote se retrouve dans l’urée, les biopolymères… ils sont donc identifiables si l’on dispose d’une NRMN !
Il y a 2 sortes d’azote :
 14N
 15N

a) L’azote 14

Le 14N est le plus abondant.

Cependant, les raies du spectre sont très larges  mauvais rapport signal/bruit (la largeur à mi-hauteur étant de
l’ordre du MégaHz)

b) L’azote 15

La quantité de 15N est très faible : c’est un isotope naturel stable (il est donc non radioactif) dont l’abondance
isotopique est très faible (= 0,37%).
Sa sensibilité est faible.
Le spin est de ½  ce noyau a 2 états de spin (vers le haut et vers le bas). Les raies sont fines.
Remarque : les noyaux ayant un spin supérieur à ½ ont un problème de largeur de raie.

L’azote 15 est donc un bon élément si on enrichit les molécules en azote 15.
Cependant, enrichir en azote 15 est très couteux.

204
Le sodium 23 (23Na)
a) Caractéristiques

 Le rapport gyromagnétique du sodium est 4 fois plus faible que celui de l’hydrogène à 4,7T  la
fréquence de résonance du sodium est plus basse que celle de l’hydrogène.
 L’abondance isotopique naturelle est de 100%
 La sensibilité est 100 fois plus faible que celle de l’hydrogène : il faut 100 fois plus de signal pour obtenir
un S/N équivalent.
 Le spin nucléaire est de 3/2 : les raies seront larges mais pas autant que celle du
14
N. Il n’y a pas de couplage spin-spin vu que ce sont des ions.
Un moment magnétique plus grand que ½ s’appelle un moment quadripolaire (4 niveaux
énergétiques).

205
 b) Déplacement chimique

La gamme de déplacement chimique est assez grande. La référence est NaCl 1M dans H 2O (0 ppm). Na a
toujours la même position dans l’eau.

Si Na est dans un autre solvant (ou un mélange eau + X), il y aura un déplacement chimique.

c) Applications

La connaissance de la concentration interne et externe en sodium est un bon paramètre pour voir l’état de santé
de la cellule (une cellule morte n’a plus ce gradient).
Le problème se situe au niveau de la séparation du sodium intra et extracellulaire vu que ce sont tous les 2 du
Na+ dans un milieu aqueux : cette séparation de la résonance du Na intra et extracellulaire est réalisée à l’aide
d’agents de shift.

206
Un agent de shift est une molécule qui a la particularité d’interagir avec l’ion en question et de décaler sa
fréquence de résonance.
Plus on a d’agents de shift, plus le déplacement est grand vu que l’on aura plus de possibilités que ces agents
soient en contact avec l’ion  le déplacement est proportionnel à la concentration de l’agent de shift.

Cependant, ces agents de shifts sont des molécules chargées et ont besoin d’un transporteur membranaire pour
rentrer dans la cellule. De ce fait, lorsque l’on infuse une solution contenant ces molécules à une culture
cellulaire par exemple, ces agents restent à l’extérieur. Ils vont donc « shifter » le Na extracellulaire.

Spectres au cours du temps, avant et après infusion avec du thulium :

Au départ, on a un seul pic de sodium correspondant à l’extracellulaire et

à l’intracellulaire.
Lorsque l’on infuse le composé au Thulium, on voit un shift du pic
extracellulaire (étant le plus important en abondance et donc en intensité).
Le pic restant à sa position étant le pic du sodium intracellulaire.

207
 Si à un certain moment, on ajoute un cytotoxique (par exemple), on voit un équilibrage des 2 intensités
correspondant à la mort cellulaire.

En pratique :

 Ce n’est pas beaucoup utilisé car cela ne détermine que la quantité de sodium.

 On peut utiliser le 23Na pour le cœur afin de voir des zones d’ischémie par exemple, où l’on verra dans ces
zones l’équilibrage des 2 concentrations.

 C’est un très bon système pour faire du suivi de l’état physiologique de l’état des cellules.

208
Le fluor 19 (19F)
Le fluor n’étant pas présent dans le corps, il n’y a donc pas de contamination par le fluor endogène. De ce fait, il
n’y a pas de bruit de fond.
 Si on donne un médicament couplé à un fluor (exemple : le 5-fluorouracile), on peut suivre son métabolisme.

Le fluor 19 a :
 un spin de ½
 une bonne sensibilité
 des pics fins
 n’a pas de bruit de fond de type fluor endogène
 des couplages avec l’hydrogène

 c’est une bonne sonde pour suivre le métabolisme.

Exemple :
En chimiothérapie, il faut savoir si le patient est réceptif ou non au traitement (par exemple : fluoro-uracile). On
étudie l’efficacité thérapeutique du traitement en suivant son métabolisme au niveau du foie du patient.
Le patient est placé dans un appareil d’IRM. On place à l’endroit du foie une bobine branchée au récepteur.
On réalise une spectroscopie : c’est ce que l’on appelle une spectroscopie avec une bobine de surface.
On repère les métabolites issus du fluoro-uracile. Celui-ci est dégradé par le foie à une vitesse variable selon les
patients :
 Certains patients dégradent très vite le fluoro-uracile :
 le pic du fluor des métabolites n’est pas au même endroit que celui du fluoro-uracile. On peut donc
suivre la cinétique du pic de fluor du fluoro-uracile et celui des métabolites.
Selon la réactivité du patient à la dégradation du fluoro-uracile, on arrête ou continue le traitement.
209
Remarque : les métabolites du fluoro-uracile sont toxiques : ça ne sert à rien de laisser un traitement qui est
dégradé tout de suite en produit toxique, cette rapidité ne permettant pas de tuer les cellules cancéreuse  le
traitement est agressif mais pas efficace  arrêt du traitement.
C’est ce que l’on appelle la médecine personnalisée.

210