Technique de

purification des
protéines :
Electrophorèse
Ben Hamed Hajer
 Plan

1) introduction
2)Définition
3)Principe de L’électrophorèse
4)Les différentes types de l’ électrophorèse :

Électrophorèse sur papier

Électrophorèse non dénaturante sur gel
Électrophorèse en SDS-page
Electrophorèse sur gradient de ph
5) Visualisation
6)Les application de l électrophorèse
 introduction

Les techniques d’étude et d’analyse d’une protéine

nécessite d’ abords son extraction et sa purification.
Ceci peut donc apparaître comme un problème
difficile
pour 2 raisons :
Elle n’existe qu’à très faible concentration
Elle est mélangée à des millier d’autres protéines
 Purification des protéines
Solution :
Tirer profit des différences de propriétés
physicochimiques et biochimiques des protéines:
solubilité,
taille
point isoélectrique,
charge
hydrophobicité
affinité pour certains ligands
 L’électrophorèse

 L'électrophorèse est une technique permettant

la séparation de molécules porteuses de charges
électriques comme les acides aminés, les protéines,
les acides nucléiques dont l'ADN..
L'origine de cette technique a été imaginée par S.E.
Linder et H. Picton en 1892.
 Principe

les molécules à séparer sont placées dans un champ

électrique créé par une tension continue.
Les molécules chargées négativement se déplacent vers
le pôle positif (= l'anode) et celles qui sont chargées
positivement se déplacent vers le pôle négatif (= la
cathode).
La vitesse de migration des constituants chimiques
dépend de leur charge électrique totale et de leur
masse moléculaire.
 Les types d’électrophorèse
Electrophorèse libre ( en veine
liquide )
est réalisée dans un tube en U de
section carrée(ceci afin de pouvoir
réaliser des mesures optiques au
travers du tube, comme avec une cuve
de spectrophotomètre)
L’électrophorèse sur
support ou électrophorèse de
zones
permet de stabiliser la phase liquide
grâce à l’utilisation d’un support
poreux imprégné d'un solvant
tamponné.
2 types de montage peuvent être mis
en place: soit horizontale soit verticale
 L'électrophorèse en veine liquide.
Vs
L'électrophorèse de zone.
L'électrophorèse en veine
liquide.
Avantages :
Permet une bonne détermination des
mobilités électrophorétiques.
Inconvénients :
Appareillage couteux.
La mise en oeuvre et longue et
délicate.
Les particules ne se séparent pas
complètement mais il se forme des
frontières mise en évidence par des
méthodes optiques telles que
l'absoption ultra-violette pour les
protéines.
L'électrophorèse de zone
Avantages :
Les fractions séparées migrent comme
des "zones" individuelles.
La taille des mailles pour les supports
en gel influencent la vitesse de
migration
Inconvénients :
appareillage coûteux
La mise en œuvre longue et délicate
elle ne permet pas de distinguer,
d'isoler, ni de caractériser les fractions
protéiques autrement que par leur
mobilité
 la méthode d’électrophorèse la plus
couramment utilisée est celle de
l’électrophorèse en zones
 Électrophorèse sur papier

 papier filtre ou acétate de Exemple :

cellulose
 Habituellement employé
dans un montage
horizontal il servait
surtout à séparer des
acides aminés ou d'autres
petites molécules
chargées. Le dépôt et la
migration des échantillons
se font en surface
 Électrophorèse sur gel

constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus

faciles à utiliser dans la séparation des macromolécules
- les gels d’usage commun, l’agarose et le poly acrylamide,
possèdent des pores de la taille des protéines à séparer
- la séparation moléculaire est basée non seulement sur la
mobilité électrophorètique des molécules, mais aussi sur
le principe de filtration sur gel
- les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille
plus grandes par rapport aux molécules plus petites
 1) Électrophorèse en gel de poly acrylamide

 aussi appelé PAGE (pour

PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis),
 - les gels sont fabriqués à
partir d’une polymérisation
radicalaire d’acrylamide et
N,N-
méthylènebisacrylamide
dans un tampon
 Gel de poly acrylamide

 Les échantillons sont déposés dans

des puits préformés au sommet du gel
 le tampon est le même dans les
réservoirs du haut et du bas
 un courant continu de 100 à 200
volts parcourt le gel pendant la durée
de migration
 les protéines migreront vers l’anode
(+) selon leur charge/masse
 après migration, le gel est retiré et les
bandes de protéine sont visualisées
 dans ce type de gel, plus le gel est
long, meilleure plus la résolution est
bonne
 2) Gel SDS-PAGE

 - la méthode la plus répandue parmi les techniques

biochimiques afin de déterminer la pureté d’une
protéine
 cette technique dépend du fait que certains savons
ou détergents, sont capables de dénaturer la
structure d’une protéine
 - le sodium dodecyl sulfate (SDS) représente un des
détergents les plus puissants à cet égard (formule
chimique du SDS:
 [CH3 - (CH2)10 – CH2 – O – SO3-]Na+ )
 la forte charge négative globale apportée par le SDS masque la charge
intrinsèque des protéines
 Les protéines sont chargés négativement ,de forme allongés , elles
migrent vers l’anodes en fonction de leur PM
 Sds page

 - cette méthode possède deux grands avantages par

rapport à l’électrophorèse ordinaire
 - 1) l’utilisation de SDS dissous les agrégats et les
particules insolubles qui peuvent -causer des
problèmes en bloquant les pores du gel
 2) la mobilité électrophorétique possède une
relation directe avec le poids moléculaire
 Electrophorese en pH discontinue

1) Electrofocalisation (IEF — IsoElectric Focussing)

 La migration est effectuée dans un gradient de pH qui peut
etre generé en ajoutant des ampholytes avec un gel
d’acrylamide , c’est un mélange d’espaces amphotères avec
une gamme de valeur PI
 Proprietes des ampholytes :
 Meme conductivité
 Grande cappacité d’effet tampon
 Soluble à son propre point isoélectrique
 Intéraction minimale avec les proteines électrofocalisés
 Dans cet exemple, l'échantillon protéique est déposé dans un
large puits au centre du gel. Évidemment, peu importe où
l'échantillon est déposé puisque les protéines migreront dans une
direction ou dans l'autre jusqu'à ce qu'elles rencontrent leur
point isoélectrique, point où elles cessent de migrer.
 L'électrofocalisation bidimensionnelle est
une méthode qui permet d'obtenir une courbe de
titrage d'une protéine donnée (charge = fonction
du pH). On prépare un gel dans lequel on établit le
gradient de pH, puis on dépose dans une rigole
centrale la solution de protéine, après quoi on
tourne la plaque de 90 ° et on fait à nouveau passer
un courant électrique.
 Visualisation des protéines dans les gels

 - une fois que la migration des protéines dans le gel

est terminée, il faut visualiser les bandes obtenues
par les protéines
 - les différentes approches sont:
 1)la coloration avec le bleu de Coomassie brillant
 Application

 2) la coloration au nitrate d’argent

 3) autoradiographie : si les protéines sont marquées
avec un isotope radioactif comme le S35 ou le C14
 Applications

électrophorèse permet la séparation de molécules chargées

: protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques et
nucléotides.
Elle permet dans certaines conditions (emploi de micelles
de détergents ioniques) de séparer des molécules non
ioniques, comme des hormones stéroïdes par exemple.
 Séparation des protéines sériques sur acétate de cellulose
 Immunoélectrophorèse :La révélation est basée sur une
réaction "antigène-anticorps«
 Séparation les molécules d’adn
 bibliographie

 http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/electropho
rese/E2.html
 http://biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrook
e.ca/5b1.html
https://www.webdepot.umontreal.ca/Usagers/.../3-
Electrophorèse.pdf
 http://chaveffi.free.fr/Cours/FasciculePCEM1electro
phorese.pdf
 http://chaveffi.free.fr/Cours/FasciculePCEM1electro
phorese.pdf