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I Introduction.
Lors du précédent TP vous avez démontré :
Que les acides aminés aromatiques comme la tyrosine pouvaient facilement être quantifiés par
spectrophotométrie à 280nm.
Que les protéines, car elles possédaient des acides aminés aromatiques, pouvaient également être
quantifiés à cette même longueur d'onde.
Mais les protéines contenant relativement peu d'acides aminés aromatiques, leurs absorbances
étaient faibles à 280nm ce qui était source d'imprécision quand au résultat.
De plus, beaucoup d'espèces chimiques souvent présentes comme contaminants comme les dérivés
phénoliques et les acides nucléiques sont susceptibles d'absorber vers 280 nm et faussent ainsi les
résultats de quantification des protéines.
Ceci explique que d'autres méthodes de sensibilité plus élevée et réagissant moins avec des
contaminants ont été développées.
Ainsi, la méthode de Bradford utilise la propriété d'un colorant le bleu de coomassie G250 à se fixer
sur les protéines cette fixation entraînant une modification du maximum d'absorption du pigment.
Le bleu de coomassie G250 est un colorant bleu qui à la propriété de se fixer selectivement sur les
protéines. Il est utilisé pour colorer les bandes d'électrophorèse sous sa forme R250 et pour doser les
protéines par spectrophotométrie sous sa forme G250. Le méthode de quantification par
colorimétrie à été mise au point par Bradford en 1976.
En milieu acide le bleu brillant de coomassie se fixe sur les protéines en établissant
des liaisons ioniques avec les molécules basiques comme l'arginine l'histidine et la lysine.
Des liaisons hydrophobes avec les acides aminés apolaires.
Molécule de bleu de coomassie G250.
Dans certaines limites de concentration on peu considérer que l'absorbance à 595nm est
proportionnelle à la concentration en protéines. La loi de Beer Lambert peut donc s'appliquer.
A = ε.l.c
Le réactif réagissant différemment selon les protéines la précision la meilleure sera obtenue si
solution inconnue et solution étalon sont de même nature.
La méthode de Bradford est beaucoup plus sensible qu'un dosage en UV à 280 nm.
Les contaminants qui absorbent en UV n'ont pas d'influence.
Les acides aminés aromatiques ne réagissent pas.
Par contre certains détergents habituellement utilisés pour extraire et purifier les protéines
réagissent avec le bleu de coomassie.
Les polyphénols comme les tannins fixent le bleu de coomassie : le réactif de Bradford peut même
être utilisé pour les doser.
Le pH à une influence sur la fixation du bleu de coomassie sur les protéines c'est pourquoi il faudra
toujours se trouver en milieu acide.
II Manipulation.
A- Réactifs.
Solution protéique de concentration inconnue de protéine.
Solution commerciale de bleu brillant de coomassie G250. (bleu de coomassie, acide phosphorique,
éthanol)
B- Mode opératoire.
1- Préparation de la solution étalon de sérum albumine.
Préparer par pesée 200 ou 250 ml de solution étalon de SAB à 100mg/l.
Dans 7 tubes à essai propres et secs effectuer des dilutions de la solution étalon avec de l'eau
distillée de façon à obtenir les concentrations en SAB suivantes.
Tubes N° 1 2 3 4 5 6 7
Concentration en SAB en mg/l 0 12,5 25 50 66,7 75 100
C'est à vous de déterminer les volumes d'eau et de SAB à introduire.
Le volume total des tubes doit être choisi de façon pertinente.
3- Dosage.
Vous disposez ainsi de 10 tubes à essai contenant chacun des dilutions de la solution étalon ou de la
solution inconnue.
Lire les absorbances au spectrophotomètre à 595nm. Le réglage à 0 étant réalisé avec le contenu du
premier tube (bleu de coomassie avec le tube 1).
Attention.
Les volumes à prélever sont faibles. Néanmoins ils doivent être prélevés avec le maximum de
précision.
Les pipettes doivent être bien rincées à chaque fois avec la solution à prélever.
Le bleu de coomassie est un colorant des protéines. TRAVAILLER PROPREMENT !
Les cuves sont à usage unique et le contenu de celles-ci ainsi que celui des tubes à essai doit être
jeté dans les bidons prévus à cet effet.
III Résultats.
Sur une feuille de papier millimétré, tracer la courbe de régression représentant la variation de
l'absorbance à 595nm en fonction des dilutions de la solution étalon.
Reporter les absorbances des solutions inconnues et en déduire la concentration des différentes
dilutions.
La loi de Beer Lambert vous semble t-elle respectée pour ce dosage ?
Dans un unique tableau récapitulatif, indiquer les volumes introduits dans les tubes, les
concentrations en SAB des dilutions de la solution étalon, les absorbances et les concentrations des
dilutions de la solution inconnue.