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Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Université Dr. Tahar Moulay Saida
Faculté des sciences
Département de Biologie Ain El Hadjar

Cours de :
Microbiologie industrielle

Réalisé par :

Mr. Ghellai Lotfi

2016-2017

2019-2020
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Sommaire

I. Introduction
I.1. Définitions
I.2. Domaines d’activité
I.3. Intérêt industriel des microorganismes
I.4. Produits commerciaux d’origine microbienne

II. Microorganismes utilisés

II.1. Rappel sur la taxonomie
II.2. Microorganismes d’intérêt industriel
II.3. Métabolisme énergétique
II.3.1. Généralités
II.3.2. Respiration
II.3.3. Photophosphorylation
II.3.4. Phosphorylation au niveau du substrat

III. Cinétique de la croissance microbienne

III.1. Croissance en milieu non renouvelé
III.2. Croissance en milieu renouvelé

IV. Fermentations industrielles

IV.1. Bioréacteurs (Fermenteurs)
IV.1.1. Paramètres exigibles
IV.1.2. Types de bioréacteurs
IV.1.3. Contrôle des paramètres de culture
IV.2. Inoculum microbien
IV.3. Milieux de cultures industriels
IV.4. Récupération des produits de la fermentation

V. Modalités de fermentation
V.1. Fermentation discontinue « Batch »
V.2. Fermentation discontinue alimentée « Fed-Batch »
V.3. Fermentation continue

VI. Principaux produits de fermentations industrielles

VI.1. Métabolites primaires
VI.2. Métabolites secondaires
VI.3. Enzymes

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I. Introduction
I.1.Définitions
La microbiologie industrielle correspond à l’ensemble des procédés de bioconversion ou
biosynthèse réalisés par un ou des microorganismes et appliqués dans des domaines aussi
variés que l’agriculture, l’alimentaire, médical, pharmaceutique, etc.
La bioconversion ou biosynthèse est l’application des principes de l’ingénierie à la
transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens et des
services (OCDE).
L’ingénierie : étude globale d’un projet industriel sous tous ses aspects (techniques,
économiques, financier, etc.).
Biotechnologie ou technologie de bioconversion
Bio=Vie, Techno=Outils, Logis=Maitrise « la maitrise des outils du vivant».

I.2. Domaines d’activité

• Agroalimentaire
-Fermentations : certaines denrées alimentaires comme le yaourt, boissons fermentées,
viandes fermentées, etc.
-Additifs alimentaires : toute substance qui n’est pas normalement consommée en tant
que denrée alimentaire en soi et n’est pas utilisée comme ingrédient caractéristique.
Les arômes sont parmi ces additifs et sont pour la plupart synthétisés par voie
chimique à partir d’hydrocarbures, néanmoins les microorganismes viennent de
révolutionner ce domaine en raison de leur capacité à produire des arômes par
fermentations à partir de matières premières végétales (figure1).

NB. Les arômes naturels sont 10 à 100 fois plus chers (1 000 fois pour l’arôme de
vanille) que les arômes de synthèse, ce qui justifie leur faible utilisation en industrie
agroalimentaire. Le coût de production pourrait devenir raisonnable alors qu’il était
prohibitif il y a 15 à 20 ans.

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Figure 1. Quelques composants aromatiques produits par fermentations microbiennes

Microorganismes Milieux solides Saveurs et arômes

Yarrowia lipolytica Éponge de Luffa γ-Decalactone 3-Hydroxy-

(courgette) Épi de maïs γdecalactone Dec-2-en-4-olide
Graines de ricin Dec-3-en-4-olide
(Try et al. 2018)
Saccharomyces cerevisiae épluchure d'orange Isoamyl acetate Phenyl ethyl
acetate Ethyl hexanoate Ethyl
octanoate Ethyl decanoate Ethyl
dodecanoate
(Mantzouridou et al. 2015)
Mélanges solides et ε-Pinene
liquides de l'industrie (Aggelopoulos et al. 2014)
alimentaire
(i.e. fromage, lactosérum,
mélasse, céréales de
brasserie, pulpe d’orange
et de pomme de terre)
Kluyveromyces marxianus Manioc Bagasse1 Ethyl acetate Ethanol
Acetaldehyde Propyl acetate
Butyl acetate Ethyl propionate
Ethyl isobutyrate Isoamylic
alcohol Isoamyl acetate
(Medeiros et al. 2001)
Candida utilis Son de blé, bagasse de Fruity aromas
canne à sucre (Christen et al. 1993)

Trichoderma viride bagasse de canne à sucre 6-Pentyl-α-pyrone δ-

Octalactone3 γ-Nonalactone4 γ-
Undecalactone2 γ-Dodecalactone
δ-Dodecalactone
(Fadel et al. 2015)

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Trichoderma harzianum bagasse de canne à sucre
Rhizopus oryzae Déchets solides de
l’agroalimentaire (bagasse
de manioc, pomme, soja,
grain d'amarante, huile de
soja)
Bjerkandera adusta Son de blé
Ceratocytis fimbriata Son de soja
Enveloppe de café
Son de blé, bagasse de
cane à sucre.
Aspergillus niger Noix de coco
Bacillus subtilis Soja moulu
1 Bagasse : résidu fibreux de obtenu pendant l’extraction de sucre, Manioc : fécule alimentaire, le
tapioca
2 Odeur forte, fruitée, pêche, âcre, moisi, terreux
3 noix de coco
4 anis, réglisse, amande…
• Agriculture
-phytosanitaire : herbicides, insecticides, bactéries stimulatrices de croissance
• Pharmaceutique
-antibiotiques, acides aminé, vitamines, hormones de croissance
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6-Pentyl-α-pyrone
(Da Penha et al. 2012)
Acetaldehyde Ethanol 1-
Propanol Ethyl acetate Ethyl
propionate 3-Methyl butanol
(Christen et al. 2000)
Benzaldehyde Benzyl alcohol
Benzoic acid
(Lapadatescu and Bonnarme
1999)
Ethyl acetate
Isoamyl acetate
Acetaldehyde
Ethanol
(Rossi et al. 2009)
Isopropyl acetate …
Fruity aromas
cheese notes
(Janssens et al. 1992)
2,5-Dimethylpyrazine
Tetramethylpyrazine
(Larroche et al. 1999)
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• Environnement
-épuration biologique des eaux
-bioremédiation des sites pollués (décontamination des sites pollués au moyen de
techniques chimiques ou microbiologiques)
-extraction de minerais (biolixiviation : extraction des métaux d’une roche)
• Autres
-production de : butanol, acétone, éthanol, méthane (CH4), etc.

I.3. Intérêt industriel des microorganismes

Les microorganismes ont un impact important sur la puissance économique d’un pays
(5% du produit intérieur brut du Japon repose sur les capacités diverses des microorganismes.
Généralement, les procédés sont lents mais les coûts sont parfois plus faibles par
comparaison avec les méthodes chimiques.
Certaines molécules ne peuvent être synthétisées que par voie microbienne (stéroïdes,
prostaglandines, etc.).
Spécificité des réactions et absence du risque de contamination par certains parasites
tels que les virus qui peuvent être présent lors de l’extraction par exemple l’hormone de
croissance de l’hypophyse des cadavres contaminés.

NB. Certains composés tels que les arômes ajoutés aux aliments peuvent provenir d’extraits
naturels (huiles essentielles, etc.) mais leur coût de revient est élevé, d’où l’utilisation des
produits obtenus par voie chimique. Cependant, depuis quelques années on s’intéresse de
plus en plus à l’utilisation des microorganismes.

I.4. Produits commerciaux d’origine microbienne

• Aliments, agents de sapidité, compléments alimentaires et boissons

Viandes fermentées (saucissons, salamis, saucisses sèches, jambons, etc.
Fromages et produits laitiers
Levure de boulangerie
Champignons comestibles (Geotricum candidum)
Pâtés de mycoprotéines (spc : single protein cell) (Fusarium graminearum)
Café

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Cornichons, olives, choucroute

vinaigre
acides aminés
vitamines
vins
bière, ale
whisky

• Acides organiques
Acide citrique, acide itaconique

• Enzymes commerciales
• Inhibiteurs
Biocides, antibiotiques
• Produits des microorganismes génétiquement modifiés
Insuline, hormone de croissance humaine

II. Microorganismes utilisés

II.1. Rappel sur la taxinomie (voir cours de systématique).
Les microorganismes se nourrissent généralement d’éléments chimiques simples (carbone,
azote, certains métaux…). En présence d’éléments complexes, les microorganismes doivent
d’abord les décomposer en éléments simples pour pouvoir les assimiler. Ils font la même
chose devant un élément toxique par exemple en le décomposant en éléments simples non
toxiques.

II.2. Microorganismes d’intérêt industriel

Les microorganismes sont considérés comme des usines à tout faire et des dépolluants par
excellence comme le montre les exemples suivants :

Shewanella oneidensis : capable de dégrader les métaux lourds.

Pseudomonas sp. : capable de dégrader les vapeurs toxiques dans l’air.

Micrococcus sp. : dégrade l’essence (C8H18) dans le sol.

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Streptothrix hyalina : débarasse l’eau des égouts de ses matières organiques.

Alcanivorax borkumensis : susceptible de dégrader le pétrole.

Desulfovibrio desulfuricans : dégrade le béton.

Thiobacillus concretivorus : dégrade le béton.

Streptomyces sp. : producteur d’antibiotiques.

Saccharomyces cerevisiae : produit l’éthanol.

Microorganismes (OGM) : insuline.

Porphyridium cruentum (microalgue marine rouge, on leur doit entre autre le pétrole,
l’O2…elles contribuent pour plus de la moitié de la photosynthèse de la planète et donc à la
biofixation du CO2) : cette algue est utilisée pour sa capacité à produire des polysaccharides.

Bactéries lactiques génétiquement modifiées.

II.3. Métabolisme énergétique

II.3.1. Généralités

Chez les eubactéries et les archées, la source d’énergie est, dans de nombreux cas, différente
du substrat carboné utilisé pour la synthèse des matériaux cellulaires. Il s’agit d’une
différence fondamentale entre le monde microbien et le monde animal.

Dans tous les systèmes vivants la source d’énergie biochimique universelle est l’ATP
(Adénosine-5-Triphosphate) formée à partir d’adénosine-5-diphosphate (ADP) et de
phosphate inorganique (Pi).

La séparation de charges ou pototentiel électrochimique à travers la membrane cytoplasmique

permet la production d’énergie (ATP) (figures 1 et 2).

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Figure 1. Transport d’électrons et synthèse d’ATP. Chaine de transport d’électrons

avec translocation des protons vers la surface externe de la cellule. La réaction globale
est NADH+H++½02>>>>NAD++H2O

Figure 2. Chaîne de transport d’électrons chez une bactérie sulfureuse

(Thiobacillus ferrooxidans) qui utilise Fe2+ comme source d’énergie

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• Type trophique (Tableau 2)

Deux catégories de microorganismes sont reconnues selon le type d’énergie utilisée :

1-Phototrophes : la source d’énergie est la lumière.

minérale (photolithotrophes=photoautotrophes)
source
d’électrons source de carbone est CO2
organique (photoorganotrophe=photohétérotrophes
source de carbone est autre que CO2

2-Chimiotrophes : la source d’énergie est un composé organique ou inorganique.

minérale (chimiolithotrophes=chimioautotrophes)
source
d’électrons source de carbone est CO2
organique (chimioorganotrophe=chimiohétérotrophes
source de carbone est autre que CO2

pour générer l’ATP les bactéries et les archées utilisent un ou plusieurs des mécanismes
suivants : la respiration, la photophosphorylation et la phosphorylation au niveau du substrat.

II.3.2. Respiration

La production d’ATP par l’oxydation de composés réduits organiques ou inorganiques

(donneurs d’électrons) couplée avec la réduction d’accepteurs d’électrons organiques ou
inorganiques.

-2H+-2é
Oxydation : AH2 (donneurd’H) A (produit oxydé)
+2H++2
Réduction : B (accepteur d’H) BH2 (produit oxydé)
é
AH2+B A+BH2+ Energie

Chez un organisme, la respiration correspond à la possession d’une chaine de transport

électronique :

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Située au niveau de la membrane cytoplasmique chez les procaryotes

Située au niveau de la membrane interne mitochondriale chez les eucaryotes.

Tableau 2. Principaux types trophiques impliqués dans la production d’énergie et dans la

biosynthèse

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La respiration se caractérise par la nature de l’accepteur final d’électrons qui peut être :
l’oxygène moléculaire, un composé minéral oxygéné ou un composé organique non
fermentescible.

II.3.2.1. l’oxygène moléculaire

Phosphorylation oxydative aérobie (voie des cytochromes indirects).

Au cours de cette respiration aérobie, les électrons et protons issus des substrats dégradés dans
le cytoplasme (glycolyse…décarboxylation oxydative…cycle de krebs…chaine de transport
d’électrons) sont pris en charge par le NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) pour etre
transportés jusqu’à la membrane au niveau d’une chaine respiratoire.
NB. Les cytochromes sont de nature uniforme (chez les organismes supérieurs) ou diverse
(chez les bactéries). Les cytochromes sont présents chez toutes les bactéries aérobies strictes,
chez la majorité des bactéries anaérobies facultatives et chez certaines bactéries anaérobies
strictes.

II.3.2.2. Composé minéral oxygéné ou un composé organique non fermentescible

Dans ce cas on parle de respiration anaérobie « respiration nitrate, fumarate » (figure 3)

Composés minéraux oxygénés : Nitrates (NO3-), sulfates (SO4-), carbonates,

tétrthionates, etc.
Composé organiques non fermentescibles : fumarate, formiate, acétate, etc.
Transport transmembranaire d’électrons et de protons jusqu’à un accepteur final.
Les produits générés peuvent être : NH4+, H2S, CH4, acide succinique, Fe3+, etc.
Une bactérie anaérobie peut donc présenter une chaine respiratoire très proche de celle
d’un organisme aérobie strict.
NB. Certains microorganismes possèdent plusieurs types de chaines de transport
électronique qui fonctionnent soit en parallèle soit en fonction des conditions de
culture :
Exemple : Escherichia coli possède :
-une chaine couplée avec l’O2 (en aérobiose)
-une chaine pour respiration des nitrates (en anaérobiose)
- une chaine pour respiration des fumarates (en anaérobiose)
-peut aussi réaliser la fermentation.

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Figure 3. Respiration fumarate chez Wolinella succinogenes

II.3.3. Photophosphorylation
Correspond à la transformation de l’énergie lumineuse en énergie chimique
Se produit chez les microorganismes photoautotrophes qui génèrent l’ATP en utilisant
la lumière solaire pour créer une séparation de charge.
Ressemble beaucoup à la phosphorylation oxydative (respiration).
Au cours de la photosynthèse, le glucose produit représente une source de protons H+
qui réagissent avec l’O2 pendant la phosphorylation oxydative pour produire l’énergie, l’eau
et le dioxyde de carbone (CO2).
Lors de la photophosphorylation, l’énergie lumineuse est utilisée pour extraire les
électrons (et H+) à partir de l’eau (ou autres substrats réduits). Quelques exemples sont
regropés dans le tableau 3.

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Tableau 3. Source de protons et d’électrons, source de carbone et produit d’oxydation

chez les bactéries photosynthétiques.
Source de H+ et é Source de carbone Produit d’oxydation
Cyanobactéries H2O CO2
Bactéries non H2, composé CO2 ou composé composé organique
sulfureuses pourpres organique réduit organique oxydé
Bactéries sulfureuses H2S CO2 SO4-2
pourpres
Bactéries sulfureuses H2S CO2 SO4-2
vertes
Héliobactéries Lactate, composé Lactate, pyruvate composé organique
organique oxydé

II.3.4. Phosphorylation au niveau du substrat

Réactions anaérobies qui fournissent de l’énergie pour la croissance en absence

d’oxygène.

C’est aussi un processus d’oxydoréduction mais les accepteurs finaux d’électrons sont
des composés organiques et non pas l’oxygène.

L’énergie libérée au cours de la fermentation est moins importante que celle produite
par respiration anaérobie et encore moins que la respiration aérobie.

Oxydation complète
Glucose (Respiration) CO2 et H2O 2875 Kjoules 38ATP 35%

Glucose Acide lactique 94 Kjoules 2ATP 1-3%

(Fermentation)
Absence de transfert d’électrons par le biais des cytochromes.

Synthèse d’ATP par le transfert direct d’un groupement phosphate riche en énergie d’un
composé organique à l’ADP pour former l’ATP.

Un composé organique comme donneur d’électrons et un autre composé organique

comme accepteur.

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Les produits finaux dépendent des substrats qui peuvent être : sucres, acides organiques,
acides aminés, purine, pyrimidine, etc.

La fermetation est un système fermé : un substrat est oxydé et le produit du substrat est
réduit.

C6H12O6 2CH3-CO-COOH 2CH3-CHOH-COOH

2NADH 2NADH
Glucose Acide pyruvique Acide lactique

• Different types de fermentations

1- Fermentation alcoolique:
Bactéries/levures
Glucides Ethanol+CO2
2- Fermentation lactique :
Bactéries
Glucides lactate
Cellules animales

3- Fermentation acétique (ou acétification) :

+O2
CH3CH2OH CH3COOH+H2O
Bactéries acétiques :
Ethanol Acide acétique
Gluconobacter oxydans
Acetobacter aceti

4- Fermentation malolactique :

Oenococus oeni
C4H6O5 C3H6O3+CO2
(bactérie lactique)
Acide malique Acide lactique

III. Cinétique de la croissance microbienne

La croissance chez les organismes pluricellulaires aboutit à une augmentation de taille ou
masse. Chez les procaryotes et eucaryotes unicellulaires, la croissance correspond à
l’accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme.

L’étude de la croissance chez les microorganismes se fait par plusieurs méthodes :

1-Mesure du nombre des cellules :

-Microscope : hématimètre (cellule de Thomas, de Malassez)

-Compteur de particules

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-Epifluorescence

-Culture sur gélose

2-Mesure de la biomasse

-Détermination du poids sec

-Mesure du trouble

3-Mesure des constituants cellulaires

Mesure de l’activité cellulaire

III.1. croissance en milieu non renouvelé

Quantité limité et précise des nutriments/volume limité de milieu

Epuisement du milieu au bout d’un temps défini

Si la vitesse de croissance est constante continuellement et maximale : masse microbienne

obtenue en 48h est 4000 fois la masse du globe terrestre.

Exemple : Escherichia coli / temps de génération est 20min :

une cellule au bout de 24h donne : 4722366478574681194496 cellules

c.-à-d. 4722366478 gramme ce qui correspond à 4722 tonne de masse produite

L’équivalent de 65010 individus (si l’on considère la masse moyenne 72,6Kg/adulte).

Si une cellule mesure 2µ, placées bout à bout, se forme une chaine de 9444732957149km
(=243988935 fois la circonférence de la terre ou 12459009 aller-retour de la terre à la lune).

La croissance d’une bactérie est définie par deux constantes (figure 4)

Le taux de croissance ou vitesse spécifique de croissance (µ) et Le temps de génération (G).

Taux de croissance

Est le nombre de divisions par unité de temps : µ (h-1 ou min-1). Il pourrait être
graphiquement défini (courbe de croissance) (figure 4).

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Temps de génération (G)

La croissance suit une progression géométrique : 1cellule>>>2cellules (n=1)>>>4cellules

(n=2)…2n.

Le G est l’intervalle de temps entre deux divisions successives ou entre deux générations
pendant la phase exponentielle : µ est constante, atteint sa valeur maximale.

1ère génération : X1=2X0

2ème génération :X2=2.2X0=22X0 Xn=2nX0

µ=n/t n=µt X=2nX0 X=2µtX0

InX=In2µtX0=In2µt+InX0=µtIn2+InX0 µ=(InX-InX0)/tIn2

µ=(InX2-InX1)/(t2-t1)In2

µ=1/G G=1/µ=t/n

G s’exprime en h ou en min

Exemple :

Supposons que X1=6000 cellules, X2=38000000 cellules

Le temps écoulé entre X1 et X2 est de 5h (300min)

Calculer µ, n (nombre de générations) et G ?

Soit le logarithme népérien Ln soit décimal log

µ=(17,453-8,699)/(300.0,693) µ= 0,042min-1

µ=n/t n=300.0,042 n=12,6 générations

G=t/n =300/12,6 G=23,8 min

Espèces G (min) µ (h-1)

Escherichia coli 20 3
Staphylococus aureus 30 2
Mycobacterium tuberculosis 800 0,075

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• Croissance cryptique (figure 5)

Dans certains cas en fin de la phase stationnaire, les bactéries survivantes peuvent
amorcer une nouvelle multiplication aux dépens des substances libérées lors de la lyse
cellulaire.

• Phénomène de diauxie (Figure 6)

E. coli dans un milieu contenant fructose et arabinose comme source de carbone, peut
engendrer deux phases de croissances alternées par une latence.
Pendant la 1ère phase seul le fructose est utilisé, la 2ème phase l’arabinose est
métabolisé.
Seul les G1 et G2 donneront la diauxie
G1 : glucose, saccharose, fructose, manose.
G2 : maltose, sorbitol, arabinose, inositol.

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III.2. Croissance en milieu renouvelé

Le principe est de maintenir les microorganismes indéfiniment en phase exponentielle

de croissance.

Prolonger la phase exponentielle, milieu constamment renouvelé et les produits du

métabolisme sont éliminés.

Ce type de croissance a un intérêt industriel major.

Certains dispositifs sont utilisés tels que : Chémostat, Bactogène, Turbidostat (figure 7)

Figure 7. Culture continue en chémostat

Dans un tel système :

Culture mirobienne sous un volume constant (V ml)

En recevant un débit (d=V.t-1) de milieu neuf.

La concentration cellulaire varie en fonction de µ en phase exponentielle.

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dX/dt=(µexp-D).X

X : biomasse initiale

D : taux de dilution (rapport d du débit d’entrée sur le volume du milieu : V. t-1/V) exprimé en
t-1

t : le temps

si D> µexp X=0 dx/dt=0

si D= µexp dx/dt=0

le D est calculé pour que X reste constantes et maximale

si D< µexp dx/dt>0 donc il va exister un facteur limitant et µexp< µexp max

donc la biomasse tend à augmenter (peut être autorégulée), ceci peut être obtenu dans des
dispositif précités.

IV. Fermentations industrielles

Dans l’industrie le terme ‘fermentation’ se réfère à la production à grand échelle de

molécules biologiques dans des fermenteurs ou dans des cuves.
Ceci est possible grace à la capacité des microorganismes à produire des molécules utiles.
Chaque microorganisme utilisé est spécifique et sélectionné (Stabilité génétique).
Les souches dites ‘spécialistes’ hautement sélectionnées ne survivraient probablement pas
dans des conditions naturelles.
Les microorganismes utilisés ne sont généralement pas nuisibles pour l’homme et
l’environnement.
Amélioration des souches se fait par : mutation et sélection (agents mutagènes>>>sélection
des souches les plus prolifiques dans la descendance)
Exemple : Penicillium chrysogenum (souche originale) produisait 1,2mg/l pénicilline tandis
que la même souche génétiquement manipulée peut produire plus de 50000 mg/l.

IV.1. Bioréacteurs (fermenteurs)

Les fermenteurs appartiennent au groupe de ce que l’on appelle les bioréacteurs enceintes
permettant la culture de tout type de cellules (animales, végétales, microorganismes).

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IV.1.1. paramètres exigibles

Les fermenteurs doivent :

Etre hermétiquement clos.

Permettre une stérilisation facile.

Maintenir l’asepsie pendant toute la durée de la culture.

Résister aux vibrations (lors de l’agitation), aux surpressions et à la corrosion.

Le volume utile représente 4/5 du volume total de la cuve.

Pour les petits volumes (<10 litres), les cuves sont en verre.

Pour les volumes supérieurs (jusqu’à 100 000 L), les cuves sont en métal inoxydable ave
hublots permettant un contrôle visuel de la culture.

Toutes les entrées et sorties (substrats, antimousse, inoculum, aération, etc.) sont pourvues de
filtres stérilisables.

IV.1.2. types de bioréacteurs

Il existe plusieurs types de bioréacteurs et divers procédés de fermentations, et ce, selon que
l’on travaille en milieu liquide, solide ou encore avec des systèmes immobilisés.

1- Système en phase liquide Culture en discontinue

(figure 8) Culture en discontinue alimentée
Culture continue
Fabrication des antibiotiques, levure de boulangerie, etc.
Risque de contamination diminué
Travail en très grand volume
Coût élevé
2- Système en phase solide (figure 9)
Substrats non solubilisés, simplement humidifiés
Fabrication du vin de riz (en Asie)
Forte productivité et peu d’énergie exigée
Contamination facilement possible

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3- Système immobilisé (figure 10)

Fabrication du vinaigre, d’acide citrique, enzymes, etc.
Matériel biologique réutilisable pour d’autres cycles
Récupération du produit facile (la souche n’est pas dispersée)
Substrats d’immobilisation :
-copeaux de bois (méthode ancienne)
-Billes de PVC
-Alginate de sodium
-polyacrylamide

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Figure 8. Schéma d’un fermenteur et ses accessoires. Fermentation en milieu liquide

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Figure 9. Bioréacteur. Système en phase solide

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Figure 10. Bioréacteur. Système immobilisé

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IV.1.3. Contrôle des paramètres de culture

Au cours des fermentations industrielles, un ensemble de paramètres physicochimiques et

biochimique (ou biologiques), est mesuré afin de contrôler le procédé permettant une
optimisation et une modélisation.

- Les mesures sont faites :

Soit par capteurs spécifiques ou sondes
Soit par techniques externes (prélèvement d’un aliquote de culture)
- L’utilisation in situ de ces sondes est : complexe et coûteux
On s’oriente actuellement vers les systèmes de mesure après prélèvement
Paramètres physicochimiques (Tableau 4)
Paramètres biochimiques (Tableau 5)

Figure 4. Contrôle des paramètres physicochimiques de culture

Paramètres Capteurs Régulations éventuelle
Température Thermomètre à résistance en Résistance plongeante ou double
platine enceinte à circulation d’eau
chaude. Circuit d’eau froide
commandé par électro-vanne.
Agitation Capteurs de proximité (électrique) Moteur électrique/axe/pale
ou de positionnement (optique)
Volume de milieu Piézo résistance Vidange
Mousse Sonde à résistance électrique Injection d’anti-mousse
Viscosité Viscosimètre
pH Electrode Injection acide ou base par pompe
péristaltique
O2 dissout Electrode Aération
CO2 dissout Electrode
Ions Electrodes sélectives
Gaz à la sortie Analyseur paramagnétique (O2)
analyse infrarouge (CO2)

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Figure 5. Contrôle des paramètres biochimiques de culture.

Systèmes de mesure Paramètres mesurés

Electrodes spécifiques à enzyme immobilisée Glucose (glucose oxydase), urée (uréase),
acide aminé (décarboxylase),
acétylcholine (estérase)
Fluorimétrie en sortie sur prélèvement NADH, NADPH
Bioluminescence en sortie sur prélèvement ATP
Chromatographie en phase gazeuse (CPG) en Composés volatiles (éthanol, arômes),
sortie lipides
Chromatographie à haute pression en phase Molécules organiques en solution
liquide (HPLC) en sortie
Examen microscopique en sortie sur un Etat de la souche, éventuels contaminants
prélèvement (modification par addition éventuelle
d’antibiotiques)
Dénombrement des microorganismes en sortie Hématimètre, dénombrement en milieu
sur un prélèvement solide
Biomasse en sortie sur un prélèvement Absorbance, poids sec

IV.2. Inoculum microbien

Il existe des biomasses microbiennes et commercialisées pour servir d’inoculum comme les
bactéries lactiques.
Pour réussir une culture microbiologique lors des productions industrielles, le matériel vivant
doit répondre aux critères suivants :

• Qualité
-Capacité maximale de production
-Homogénéité morphologique
-Génotype stable pendant tous le processus
-L’inoculum de base doit être soigneusement conservé car le nombre de spores
valables par exemple peut diminuer, les métabolites aussi.

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NB. La conservation des souches peut se faire dans le milieu de production sous azote
liquide (-196°C). Les milieux de protection : glycérol, DMSO (dimethylsulfoxyde),
sérum, lait ou polyéthylèneglycol.

-les transferts répétés sur milieu gélosé offrent le risque d’une dégénérescence (perte
de capacité de synthèse de certains métabolites)
• Quantité
La quantité de l’inoculum peut largement influencer la productivité. Pour chaque
souche et chaque procédé, la quantité optimale d’inoculum doit être déterminée.
• Axénie
La contamination doit être évitée tout au long du procédé de fabrication.
Tests de stérilité : des prélèvements sont ensemencés sur milieux favorables au
développement des divers groupes de microorganismes, ces analyses sont complétées
par des analyses microscopiques.

IV.3. Milieux de culture industriels

Les critères exigés pour qu’un milieu de culture soit convenable aux procédés industriels sont
les suivants :

-approprié pour la croissance et assurer -dans le cas des métabolites- une production
maximale.

-le milieu doit être complet et fournir : une source de carbone et d’énergie (glucose, amidon,
mélasses*, huiles), une source d’azote (farine de soja, peptone, extrait de levure, acides
aminés, etc.), sels minéraux, oligoéléments (Fe, Zn, Mn, etc.) et souvent les facteurs de
croissance indispensables.

-laqualité de l’eau est un élément important.

-ajout des antimousses** en cours de fermentation. Ces agents ne doivent gêner ni la

croissance ni l’extraction du métabolite recherché.

-les éléments du milieu peuvent constituer jusqu’à 15-20% des coûts de production.

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-lors des cultures en bioréacteurs, les matières naturelles sont souvent employées dont les
éléments suivants sont déterminants en plus des critères précités :

Prix d’acquisition et de stockage

Disponibilité et constance de qualité

Coût de stérilisation

Caractéristiques rhéologiques

Absence de substances toxiques et des substances compliquant l’extraction.

-dans les fermentations industrielles, on utilise comme milieux de base les sous produits*** et
résidus agroalimentaires :

Source de carbone :

Farine de céréales

Farine de soja

Farine de pomme de terre

Farine de riz

Farine de son

Mélasse

Amidon

Petit lait

Source d’azote :

Farine de poisson

Gélatine

Peptones

Facteurs de croissance :

Extrait de levure
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‘corn steep’

*Mélasse :résulte du raffinage du sucre extrait de la betterave sucrière ou canne à sucre. Moins
calorique que le saccharose, contient la vitamine B, sels minéraux, etc. Cette substance est utilisée :
pour produire le bioéthanol, en parfumerie, en pharmacie, etc.

**Antimoussants : mono et diglycérides d’acides gras alimentaires (E471) et le diméthicone (E900)

sont couramment utilisés en alimentaire.

***sous-produits1 et co-produits2 :

1
:produit résidu apparait durant la fabrication ou la distribution du produit fini

Non intentionnel, imprévisible ou accidentel

Ne contribue que très secondairement aux bénifices

Exemple : abattoirs :os, raffinage minerai de Zn ou pb : métaux, terres rares.

2
:au cours du processus de fabrication et au même temps que le produit principal.

Intentionnel et inévitable

Economiquement valorisé

Exemple : farine animale, fromage, beurre, lactosérum, crème, mélasse.

IV.4. Récupération des produits de la fermentation industrielle

-les coûts des processus de séparation, extraction et purification varient généralement entre 20
et 50%.

-filtration ou centrifugation : cas de la production de biomasse (cellules)

-extraction et purification : cas des métabolites.

-les effluents !

Ces derniers sont formés d’une dizaine ou centaine de m3 de liquides contenant des composés
biodégradables : cellules et débris, protéines, vitamines, gluides, lipides, composés
inorganiques, après centrifugation ou séchage ces matières sont utilisées comme aliments de
bétail ou fertilisants. La digestion sur lits bactériens des stations d’épuration ou l’incinération
est possible.
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V. Modalités de fermentation
V.1. culture discontinue ‘Batch’ ou ‘fermé’

-généralement au laboratoire les microorganismes (bactéries, levures et moisissures) sont

cultivés en ‘batch’.

-le fermenteur rempli de milieu de culture est stérilisé (la stérilisation peut aussi être faite
avant le remplissage).

-l’inoculum est ajouté et la culture est faite sans ajout de milieu de culture au cours du cycle
de fermentation.

-le volume (V) est constant, la biomasse (X) augmente, le substrat (S) diminue et le produit
(P) recherché apparait.

-le produit (P) n’est récupéré qu’après le cycle de fermentation.

-la biomasse (X) évolue en fonction de la formule suivante :

dX=Rx.dt-Rd.dt………..(1)

Rx: vitesse de croissance

Rd: vitesse de destruction

La Rd est négligeable au cours de la croissance donc :

(1)….> >>dx=Rx.dt

-la fermentation peut être modifiée en agissant sur : aération, pH, ajout d’arômes,
conservateurs, etc.

-les principales caractéristiques de la culture discontinue sont regroupées dans le tableau 4.

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Tableau 4. Caractéristiques de la fermentation discontinue ‘Batch’

Système de culture Fermé

Addition des nutriments* Non
Volume de la culture* Constant
Elimination des déchets* Non
Contamination Minimum
Phases de croissance Toutes les phases ( Lag, Log, stationnaire et déclin)
Phase exponentielle Plus courte (par rapport aux autres types de cultures)
Densité bactérienne* Change avec le temps
Taux de production Faible

*en cours de la culture

V.2. Culture discontinue alimentée ‘Feed Batch’ ou ‘semi-fermé’

Ce type de culture commence dans un petit volume (pied de cuve) de milieu de culture (avec
le même inoculum utilisé précédemment), la fermentation démarre et la biomasse augmente
rapidement. Lorsque les microorganismes sont en phase exponentielle on introduit le milieu
de culture stérile avec un débit réglé.

En cours de la fermentation certains composants sont ajoutés sous contrôle. Le volume de la

culture augmente au fur et à mesure que la fermentation se déroule.

La biomasse augmente (substrat diminue) si le débit d’alimentation est faible (figure 11).
Cependant, si ce débit est constant (ou élevé), la biomasse est constante (ou augmente).

Ce type de fermentation est très utilisé à cause de la forte productivité et le gain de temps.

Exemple : production de la pénicilline par fermentation discontinue alimentée.

-les principales caractéristiques de la culture discontinue alimentée sont regroupées dans le

tableau 5.

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Tableau 5. Caractéristiques de la fermentation discontinue alimentée ‘Fed-Batch’

Système de culture Semi-Fermé

Addition des nutriments* Oui
Volume de la culture* Augmente
Elimination des déchets* Non
Contamination Intermédiaire
Phases de croissance Toutes les phases ( Lag, Log, stationnaire et déclin)
Phase exponentielle Plus longue (par rapport aux autres types de cultures)
Densité bactérienne* Change avec le temps
Taux de production Médium

*en cours de la culture

V.3. Culture continue

C’est un système ouvert, les conditions de culture sont maintenues constantes par apport
continu de nutriments et élimination continue des déchets.

Au cours de la phase exponentielle (figure 12):

-Le milieu de culture (S) s’appauvrit

-Les produits du métabolisme s’accumulent (P)

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Figure 11.

Figure12.

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En apportant du milieu neuf avec un débit (F) et soutirant les déchets avec le même débit (F),
la culture reste en phase exponentielle, c’est la culture continue.

A l’heure actuelle, les systèmes en discontinu sont les plus flexibles, d’une conception simple
et sécuritaire. Cependant, les systèmes en continu sont plus rentables (coût élevé).

Les mêmes inconvénients et avantages que le système en phase liquide précédemment cité.

-les principales caractéristiques de la culture continue sont regroupées dans le tableau 6.

Tableau 6. Caractéristiques de la fermentation continue

Système de culture Ouvert

Addition des nutriments* Oui
Volume de la culture* Constante
Elimination des déchets* Oui
Contamination Maximum
Phases de croissance Deux phases : latence, exponentielle
Phase exponentielle La plus longue et continue
Densité bactérienne* Reste la même
Taux de production élevé

*en cours de la culture

VI. Principaux produits de fermentations industrielles

Comme indiqué plus haut (chapitre précédent), les microorganismes sont une source
innépuisable de molécules utilisées dans plusieurs secteurs, l’agroalimentaire,
pharmaceutique, médical, agricol, etc.

VI.1. Métabolites primaires

Sont des composés qui sont synthétisés au cours de la phase de croissance dite trophophase
(figure 13A). La biosynthèse de ces molécules est généralement simple.

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VI.1.1. Acides aminés

-Sont des produits industriels majeurs (>400 000 tonnes/an).

-ces acides sont utilisés pour améliorer la qualité des aliments, en médecine ou en synthèse
chimique, etc.

-l’aide glutamique est produit en plus grande quantité (80% de production totale)

-le glutamate de sodium (E621) est communément utilisé en industrie alimentaire, c’est un
exhausteur de goût (augmente l’intensité de la perception olfacto-gustative.

Exemples :

Corynebacterium glutamicum

Escherichia coli K12 (L-thréonine).

VI.1.2. Alcools (éthanol)

Saccharomyces cerevisiae et le germe le plus souvent employé pour produire l’éthanol.

VI.1.3. Nucléotides

Au Japon, les algues séchées et les poissons séchées constituaient une source d’agents de
sapidité tel que l’acide inosinique (E630)
(5’GMP : 5’guanosine monophosphate), cet acide est
un exhausteur de goût.

Exemple :

Bacillus megaterium

VI.1.4. Vitamines

Quasiment, toutes les vitamines B peuvent être synthétisées par voie microbienne.
Cependant, seules la riboflavine (B2) et la cobalamine (B12) sont produites par fermentation
car la synthèse chimique des autres vitamines est moins couteuse.

Exemple : microorganismes impliqués dans la production de vitamines

Vitamine B12 : Propionibacterium shermanii, Pseudomonas denitrificans.

Vitamine B2: Ashbya gossypii

Vitamine C (acide ascorbique): Acetobacter suboxydans

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VI.1.5. Acides organiques

Dans le passé, l’acide citrique était extrait à partir du citron (1 citron donne 7-9%
d’acide citrique) mais sont prix était onéreux. En 1923, grâce aux procédés de fermentations
microbiennes, l’industrie a commencé à produire des quantités énormes d’acide citrique.
Actuellement, cet acide se vend beaucoup moins cher. Chaque année une quantité de 130 000
tonnes est produite dans le monde.

D’autres acides sont aussi produits par des fermentations microbiennes tels que l’acide
acétique, l’acide lactique, l’acide gluconique, l’acide itaconique, etc.

Exemples : souches intervenant dans la production des acides organiques

Aspergillus niger

Acetobacter aceti

VI. 2. Métabolites secondaires

Ces métabolites qui sont produites pendant la phase de croissance dite iodophase (figure 13B)
ne sont pas indispensables aux processus vitaux de la cellule. Elles ont un rôle écologique
important. Les microorganismes peuvent synthétiser certaines métabolites antagonistes
(biocides, antibiotiques).

VI. 2.1. Biocides

Les protéines synthétisées par Bacillus thuringiensis sont parmi les biocides les plus utilisés.
Cette bactérie n’est pas toxique mais sa protéine tue les insectes lépidoptères.

La fermentation dure environ 30 heures pour la synthèse de cette protéine insecticide.

VI. 2.2. Antibiotiques

Actuellement, 10 000 antibiotiques sont caractérisés mais seulement environ 160 antibiotiques
sont commercialisés.

Les antibiotiques sont produits principalement par les champignons et bactéries.

Les antibiotiques utiles sont généralement produits par les bactéries filamenteuses
(Actinomycètes).

Généralement, les milieux utilisés sont : liqueur de maïs, substrat de type mélasse ou autres.

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La durée de la fermentation est généralement 4 jours.

Exemples :

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