UNIVERSITE MARIEN NGOUABI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUE

Domaine : Biologie
Parcours : Sciences Biologiques
Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire
THEME

ELECTROPHORESE SUR
GEL D’AGAROSE

Présenté par :
1-NZILA Divin

2-MOUZITA Gloire Sous la responsabilité de :

3-GOMA Belle trich

4- BOUKETTE Perpetue
Dr Aimé Christian KAYATH
5- KITSORO Geya

6- KOUA-BOUNA Rejaudry

7-MAHOUNGOU Dan

8- MAKAYA Celeste

9- MIANGUE Theresea

10- BANZOUNZI Djovel

Sommaire :

I. Introduction…………………………………………………………….3
II. But……………………………………………………………………..4
III. Principe……………………………………………….……………...4
VI. Outils……………………………………………………………........4-5
V. Caractéristiques………………………………………………..…......5-6
VI. Protocole……………………………………………………..………6-9
VII. Lois physiques. ……………………………………………………
VIII. Facteurs affectant l’électrophorèse et avantages……………..…10
INTRODUCTRION :

Les multiples applications scientifiques et technologiques impliquant l’étude de

l’ADN font appel à différentes techniques, parmi elles figurent l’électrophorèse
sur gel d’agarose ; qui est un technique communément utilisé parce qu’elle
permet de séparer des molécules en fonction de leur taille, en les faisant migrer à
travers un gel par application d’un champ électrique.
 I. BUT : L’électrophorèse est utilisée pour contrôler la PCR, en effet le
produit de la PCR qui est analyser par l’électrophorèse pour s’assurer qu’il
y’a bien eu de l’amplification, et que le fragment d’ADN amplifié à la
bonne taille.
II. PRINCIPE : c’est une technique qui permet aux molécules de traverser
une couche de gel sous l’impulsion d’un champ électrique en fonction de
leur taille : Les molécules de petites tailles se déplacent plus rapidement et
migreront plus loin que des molécules de taille inférieur en fonction des
paramètres physico-chimiques.
III. OUTILS :
 MATERIELS :
- La cuve
- Le peigne
- Le générateur électrique
- ADN marqueur
 PRODUITS :
- Le tampon
- L’agarose
- Le BET
- Les fragments d’ADN
- L’ADN marqueur
IV. PARAMETRES :
• Taille : Les fragments d’ADN doivent-être comprise entre 50Pb et
20KPb.
• Concentration du gel : Le gel d’agarose est généralement utilisé à
une concentration comprise entre 0,7% et 3% : c’est-à-dire que le
fragment d’ADN d’une taille donnée migre plus vite lorsque la
concentration de gel d’agarose est faible.
 • Température : Elle dépend du gel d’agarose, lorsque la température
est supérieure à 40,45° le gel est liquide et lorsqu’il est en dessous de
40° il se solidifie et devient un gel polymérisé.
• Tension du courant : Les appareils d’électrophorèses sont branchés
à une source de courant continue direct. Les molécules chargées
pénètrent le gel à travers des capillaires a faible tension (5v) : la
migration est grande
• PH : A titre d’exemple, lorsqu’un champ électrique traverse un gel
de PH neutre, les groupes phosphates chargées négativement de
l’ADN provoquent la migration de celui-ci vers l’anode
• Vitesse : L’augmentation de la concentration d’agarose dans un gel
réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment
d’ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important plus la
vitesse de migration augmente.
V. CARACTERISTIQUES : L’électrophorèse permet théoriquement :
- La séparation de fragment d’ADN d’une taille allant de 50pb à
plusieurs millions, cependant elle est généralement utilisée pour la
séparation de fragment d’une taille allant de 100pb à 20kpb. la durée
moyenne de migration est d’une heure.
- Description des matériaux et produits :
1. TAMPON : c’est l’article principale de l’électrophorèse. Il
permet de maintenir les paramètres physico-chimiques : nous
comptons plusieurs types de tampon, dont les tampons les plus
utilisées sont le TAE (tris acétate EDTA à PH=7,8) et le TBE (tris
borate EDTA à PH=8,2). Dans les gels identiques et intensité
constante, la migration est plus rapide dans le TBE que dans le TAE.
Le TBE est le plus souvent utilisée pour le contrôler rapidement,
mais l’ADN s’élue difficilement dans ce type de gel. Pour la
récupération du fragment d’ADN on utilise de préférence le TBE.
 2. BET : le bromure d’ethidium est un agent intercalant qui va
s’intercaler entre les deux brins d’ADN. Lorsqu’il est exposé au
rayon UV, il émet la fluorescence ROUGE-ORANGE.
3. Peigne : jouant le rôle dans la formation du puit.
4. ADN marqueur : encore appelé marqueur de taille moléculaire, est
un mélange de fragment de taille connue qui servira de repère pour
estimer la taille des fragments d’ADN.
5. Cuve à électrophorèse : Appareil permettant de faire migrer l’ADN
VI. PROTOCOLE :
EXEMPLE : Cas de l’électrophorèse utilisée suite à la séparation des
fragments d’ADN produit au cours de la digestion d’un plasmide par des
enzymes de restriction.
Pour réaliser une électrophorèse d’un mélange de fragment d’ADN, issu
d’une digestion enzymatique :
a) On prépare d’abord un gel d’agarose, en solubilisant l’agarose en
poudre dans un tampon TAE, et en chauffant dans un bain marie ou
dans un micro-onde pour que la solubilisation de l’agarose soit
complet. Le tampon TAE est aussi utilisé comme tampon de
migration. En effet le tampon TAE, maintien le PH de la solution et
permet la migration de l’ADN, il protège également les acides
nucléiques de la dégradation par des DNASES
b) Après avoir solubilisé l’agarose dans le TAE, on fait couler la
préparation dans une moule pour donner la forme du gel et on place
un peigne en haut du gel afin de donner la forme du puit de dépôt.
Il y’a plusieurs types de peigne dont les dents sont plus ou moins
large ou plus ou moins nombreuses. Le choix de la largeur des dents
du peigne dépend du volume de nos échantillons. Si on a des
échantillons de petit volume, on choisit un peigne avec des petites
dents qui dépend du nombre de nos échantillons.

c) On laisse refroidir en température ambiante jusqu’à ce que le gel

polymérise. Lorsque le gel polymérise, on retire le peigne puis les
puits du dépôt se forme.
Lorsque le gel polymérise, il va se former des mailles comme des
mailles d’un filet. Ces mailles sont plus ou moins serré en
fonction de la concentration en agarose. Plus la préparation du gel
est concentrée, plus les mailles sont serrées.
Le choix de la concentration en gel dépend de la taille des
fragments à séparer, un gel concentré permet une concentration
fine de petit fragment d’acide nucléique. Plus les fragments
séparer sont de grandes tailles moins le gel est concentré, pour
que les grands fragments puissent migrer à travers les mailles du
gel. Pour séparer les fragments dont la taille est de 1 à 2kpb, on
prépare un gel à 2%
 d) On place ensuite le gel dans une cuve de migration remplie de
tampon de migration de TAE. Cette cuve est polarisée, i.e. : elle a un
pôle positif et négatif.

On place l’ADN dans puits du dépôt du

côté négatif de la cuve, on dépose sur le
gel après avoir mélange avec un colorant
afin de suivre le sens de migration sur le
gel. On dépose également un marqueur de
taille dans le premier puit, et on applique
un champ électrique sur le gel en allumant la cuve afin de lancer la migration.
Les Acides Nucléiques chargés négativement à cause du groupement phosphate,
ils migrent du pôle négatif vers le pôle positif avec des vitesses de migrations
différentes selon la taille du
fragment. Les petits fragments
migrent plus vite dans le gel.
 A la fin de la migration, on plonge le gel dans le
BET (le BET est toxique et mutagène), pour
l’utiliser avec plus de sécurité, il est préférable de
l’ajouter directement dans la préparation du gel,
plutôt que plonger le gel dans le BET à la fin de la
migration.

Enfin, après la révélation du gel sur une plaque U.V, les bandes obtenues va
correspondre aux fragments migrés dans le gel. On peut identifier leurs tailles
par comparaison avec le marqueur de taille. Dans le premier puit, Les fragments
les plus petits migrent facilement à travers les mailles du gel et parcours donc
une longue distance de migration : on les trouve en bas du gel . Les grands
fragments sont ralentis par le gel et parcours une faible distance : on les trouve
en haut du gel.

L’intensité d’une bande indique la quantité d’acide nucléique, plus la bande est
intense, plus on a le matériel nucléique. On peut couper la bande correspondant
a un fragment d’intérêt d’acide nucléique afin de l’utiliser pour d’autre
expérience. Par exemple, pour cloner un plasmide.
 VII. Lois physiques : La mobilité électrophorétique U, qui est en fonction de
la charge et de la géométrie de la particule. Une particule de charge
électrique Q, placée dans un champ électrique E est soumise à une force F
qui l’entraîne vers l’électrode de signe opposé : F=Q.E
Les forces de frottement f, dues à la viscosité du milieu, s’opposent à la
migration de la particule et ce d’autant plus que la particule est grosse(r=rayon)
et que la vitesse de migration est grande f=6πnrv
Il arrive un moment où ces deux forces s’équilibrent et la particule se déplace
alors à une vitesse constante, on peut alors écrire QE=6πnvr soit v=QE/6πnr
On définit pour chaque particule sa mobilité µ de matière indépendante du
champ électrique par relation µ=v/E
VIII. FACTEUR AFFECTANT LA MIGRATION
Le facteur le plus important est la longueur de la molécule d’ADN :la séparation
se fait en fonction de la masse moléculaire, donc de la taille de l’ADN.
Toutefois, la conformation de l’ADN est aussi un facteur important.
Ainsi, pour éviter les problèmes liés à cette conformation, n’est séparé que sur
gel d’agarose uniquement que l’ADN linéaire (fragment d’ADN issu d’une
digestion, l’ADN amplifié par PCR ou encore de l’ADN complémentaire) .
L’augmentation de la concentration d’agarose dans un gel réduit la vitesse de
migration et permet la séparation de fragment d’ADN de plus petite taille. Plus
le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente. Toutefois le
voltage est limité en intensité, effectivement un fort voltage induit une
augmentation de température ce qui peut faire fondre le gel.
- La conformation, d’ADN plasmique non digéré par les enzymes de
restriction migre à différentes vitesses (de plus lent au plus rapide) :
ADN circulaire, ADN linéaire, ADN super enroulé.
- Avantages : préparation aisée, rapide et peu couteuse des gels
d’agarose. Pas de dénaturation des échantillons
L’agarose plus fermer et moins toxique