UNIVERSITE MARIEN NGOUABI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

LA CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE

NIVEAU : L3 BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE

Présenté par le groupe 7 :
BONGOWA MOBENZA
DIATOULOU ALFRIDE GLOIRDIE
BIONGUET GUYDELA DOREICH
DINGA IVOUTOUGHI RIBERKA SIMONET
FOUKA ADELIA
MALIKI AYRTON BELTRANDO
MIETE MARCELLE
MAMPASSI BERLAND ROMARIC
NGAKOSSO MILANDOU NIVI-FILS
BOUSSEM BENI ELYSA MAGDALA

Responsable du cours : Dr Aimé Christian KAYATH

Année académique : 2020-2021
Table des matières
I-Définitions ............................................................................................................................................. 3
II-But ........................................................................................................................................................ 3
III-Principe................................................................................................................................................ 3
IV-Caractéristiques .................................................................................................................................. 3
V-Appareillage ......................................................................................................................................... 4
1.La phase stationnaire ....................................................................................................................... 4
2.La phase mobile................................................................................................................................ 4
VI-Etapes de chromatographie d’affinité ................................................................................................ 4
a. Etape de fixation.............................................................................................................................. 4
b. Etape de purification ....................................................................................................................... 4
c. Etape d’élution................................................................................................................................. 5
VII-Avantages et inconvénients ............................................................................................................... 5
CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE

I-Définitions
La chromatographie d’affinité est une technique qui permet de séparer un composé
en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique (greffé sur une
matrice macromoléculaire) et son substrat.
La chromatographie d’affinité est une méthode de séparation où la molécule d’intérêt
présente dans un mélange biochimique se lie spécifiquement à l’effecteur (ligand,
enzyme …) qui se lie à une matrice.
C’est une technique de séparation basé sur la haute affinité des protéines pour son
ligand lié de manière covalente à un support inerte qui constitue la phase
stationnaire.

II-But
Cette chromatographie permet la purification des molécules :
-des protéines
-des acides nucléique
-des anticorps dans le sérum sanguin

III-Principe
Le principe de cette chromatographie est basé sur l’affinité qui existe entre une
macromolécule (protéine, acides nucléiques,) et son ligand. C’est une propriété qui
est liée aux phénomènes de reconnaissance spatiale avec des interactions faibles.

IV-Caractéristiques
Cette chromatographie nécessité deux phases
-une phase stationnaires
-une phase mobile
V-Appareillage

-Le dispositif est constitué par une colonne de résine généralement une matrice de
sepharose.
-La colonne est connecté à un détecteur d’acides aminés
-le détecteur à absorption UV est à un détecteur à son tour connecté à un système
informatique qui affiche des pics des acides aminés quelconques quand ils traversent
la colonne.

1.La phase stationnaire

La phase stationnaire est un support macromoléculaire inerte qui porte un effecteur.
Cet effecteur, présente une affinité biologique avec notre protéines d’intérêt
présentes dans l’échantillon tel que, l’affinité enzyme substrat ; ligand-récepteur ;
anticorps-antigène.

2.La phase mobile

La phase mobile est une phase liquide qui contient la molécule d’intérêt à purifier et
les contaminants.

VI-Etapes de chromatographie d’affinité

Cette chromatographie se fait en 3 étapes qui peut être résumée comme suit :
- une étape de fixation
- une étape de purification
- une étape d’élution

a. Etape de fixation
Le mélange de molécules contenant le composé à purifier est coulé sur la colonne.
d’affinité par les liaisons faibles. Seule la molécule présentant une affinité pour
l’effecteur greffé sur la phase stationnaire.
Remarque : l’effecteur peut être de la sépharose ou du gel polyacrylamide et il doit
disposer d’un groupement réactif permettant de se fixer au ligand.

b. Etape de purification
Elle consiste en un lavage par passage du tampon ou du mélange dans la colonne,
toutes les molécules qui ne se lient pas de façon spécifique au ligand ou à l’enzyme
sont élués.
c. Etape d’élution
Elle consiste au décrochage des molécules qui se sont fixées de façon spécifique à
l’enzyme ou au ligand. On peut pour cela utiliser un tampon de migration de PH
diffèrent permettant de briser les liaisons faibles entre l’effecteur et la molécule
d’intérêt, on peut également utiliser une autre protéine pour éluer celle qui s’est fixée
entrainant donc une compétition. On peut également utiliser des solutions salines.
NB : si le groupement de fixation à la colonne (enzyme ou ligand) est mal positionné
la molécule à purifier aura également du mal à se fixer

Figure illustrant les différentes étapes de la chromatographie d’affinité

VII-Avantages et inconvénients
L’avantage de cette technique est sa très grande sélectivité potentielle, à tel point
que son utilisation peut parfois permettre une purification suffisante en une seule
étape, qui est rarement le cas avec les autres types de chromatographie.
L’inconvénient de cette technique est que La chromatographie d'affinité est une
méthode coûteuse et délicate à mettre en œuvre