Analyse fonctionnelle

par colorimétrie et fluorimétrie

par Gwenola BURGOT

Professeur à l’Université de Rennes I
et Fernand PELLERIN
Professeur honoraire à l’Université Paris XI

Actualisation du document rédigé par Maurice PESEZ, ancien Directeur du Service

Analytique du groupe Roussel-Uclaf, ancien Expert à l’Organisation Mondiale de la Santé
et auprès de la Pharmacopée européenne.

1. Présentation des techniques ................................................................ P 3 255 — 2

2. Analyse fonctionnelle ............................................................................. — 2
2.1 Alcools .......................................................................................................... — 2
2.2 Phénols ......................................................................................................... — 3
2.3 Composés carbonyles ................................................................................. — 5
2.4 Acides carboxyliques et dérivés................................................................. — 5
2.5 Groupements fonctionnels azotés ............................................................. — 6
3. Développements récents ....................................................................... — 7
3.1 Acide barbiturique ....................................................................................... — 7
3.2 Malondialdéhyde ......................................................................................... — 8
3.3 Mises au point de sondes colorimétriques pour la détection d’oses...... — 8
3.4 Test de cytotoxicité ou MTT........................................................................ — 8
4. Conclusion ................................................................................................. — 8
Références bibliographiques ......................................................................... — 9

es réactions colorées, autrefois décrites pour des espèces chimiques

L particulières, étaient généralement d’origine empirique, parfois découvertes
fortuitement et n’étaient souvent ni sensibles ni même sélectives. Bénéficiant du
développement de la synthèse organique et des méthodes instrumentales, des
études exhaustives ont permis d’isoler et d’identifier les produits formés. Les
preuves ainsi apportées aux schémas réactionnels ont offert des points d’appui
à la recherche, et la connaissance d’autres réactions de la chimie organique a,
dès lors, permis de concevoir des méthodes analytiques nouvelles. Ainsi, l’ana-
lyse organique ne procède pas seulement par clivage sinon destruction de la
matière puisque, au niveau des éléments de structure carbonée, on pratique
aussi des cyclisations, duplications, cycloadditions, etc.
En analyse fonctionnelle, tout procédé dont le mécanisme a été établi devrait
être applicable, toutes choses égales, à tous les composés bénéficiant de la fonc-
tion cible. Mais la réactivité de celle-ci n’est pas indépendante ; elle est liée à la
structure de l’ensemble de la molécule et cette corrélation peut aller jusqu’à
empêcher toute réactivité.
Sur le plan pratique, il s’avère ainsi que, avec les techniques d’analyse fonction-
nelle par spectrométrie dans le visible et l’ultraviolet ou par fluorimétrie, la valeur
relative des résultats n’est pas identique pour toutes les substances qui possèdent

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la même fonction à doser. Toutefois, dans des limites bien déterminées, la loi de
Lambert-Beer, relation linéaire entre l’absorbance et la quantité de substance mise
en œuvre, demeure satisfaisante. Elle autorise les essais quantitatifs à condition
de pratiquer l’étalonnage à l’aide de l’espèce chimique elle-même.
M. Pesez et J. Bartos ont développé dans des ouvrages de portée internatio-
nale de nombreuses applications de la colorimétrie, de la fluorimétrie et éga-
lement de la spectrophotométrie ultraviolette en indiquant les valeurs des
longueurs d’ondes et le domaine de concentrations appropriés.
En analyse organique, l’usage des méthodes colorimétriques dans le visible et
des méthodes fluorimétriques diminue au profit de méthodes instrumentales
directes ne faisant pas appel à des réactions préalables comme la spectrométrie
de masse, la résonance magnétique nucléaire ou l’infrarouge qui fournissent
une image de l’ensemble de la molécule. Cependant, l’analyse fonctionnelle par
colorimétrie ou fluorimétrie continue à être utilisée pour une identification
rapide des molécules sans recourir à un appareillage sophistiqué avec éventuel-
lement une extraction par un solvant non miscible.
La mise en œuvre de ces réactions chimiques conserve aussi l’avantage de
matérialiser la réactivité des groupements fonctionnels. La connaissance de
celle-ci permet souvent de prévoir la stabilité des molécules organiques, les
incompatibilités dans le cas de mélanges et éventuellement la perte d’activité ou
la formation de produits toxiques.
Enfin, ces dernières années, un champ d’application est nouvellement apparu
avec le développement de la biologie moléculaire qui exploite largement ces
techniques pour mettre en évidence des composants cellulaires. Des exemples
seront présentés dans le paragraphe 3.

1. Présentation 2. Analyse fonctionnelle

des techniques
Dans le présent article, nous avons choisi de présenter des techni-
ques sélectionnées pour leur caractère de généralité et destinées à
identifier les fonctions les plus courantes de la chimie organique.
Des références bibliographiques viennent compléter ces exemples
et élargissent le champ d’application à d’autres groupements fonc-
tionnels. Une dernière partie est consacrée à des applications
récentes de ces techniques.
D’une façon générale, chaque technique est présentée comme
suit. Le principe de la réaction est exposé avec ses éventuelles
séquences et suivi de l’indication de la coloration ou de la fluores-
cence obtenues.
Dans la majorité des cas, le schéma réactionnel est connu et
accompagne l’énoncé de la réaction. L’indication de la longueur
d’onde au maximum d’absorption en colorimétrie ou spectrométrie
ultraviolette est suivie d’une indication de prise d’essai optimale.
Celles-ci ont été établies à partir de résultats obtenus au laboratoire
de M. Pesez pour que l’absorbance, avec le mode opératoire décrit,
soit de l’ordre de 0,1. Si la sanction du dosage est une fluorimétrie,
les données spectrales mentionnent la longueur d’onde optimale et
celle correspondant au maximum pour l’émission.
Quant à la prise d’essai optimale, elle est exprimée entre deux
valeurs de prise d’essai pour lesquelles la relation entre l’intensité
de fluorescence et la concentration est linéaire. Comme en colori-
métrie, ces limites comprennent la masse de produit à mettre en
œuvre pour que l’absorbance soit voisine de 0,10.
2.1 Alcools
Les réactions suivantes sont applicables aux alcools primaires,
secondaires et tertiaires. L’hydroxyle de ces trois types d’alcools
peut être quantifié par formation de complexe avec l’ion hexanitra-
tocérate (coloration brun orangé). Toutefois, la méthode n’est appli-
cable que pour des prises d’essai de l’ordre du milligramme [8].
Une réaction sensible est obtenue par condensation avec l’acide
di(8-hydroxylequinolyl) orthovanadique, souvent appelé oxine
vanadique ou très improprement, oxinate de vanadium, dont la
structure est donnée à la figure 1.
La coloration du réactif, bleue en solution chloroformique, vire au
rouge en présence d’un alcool. La nature du produit de réaction est
mal connue. Trois hypothèses ont été proposées : formation d’un
complexe d’addition [14], estérification [15] ou isomérisation stéri-
que de l’oxine vanadique [16]. L’hypothèse d’une estérification sem-
ble maintenant démontrée [204], mais l’existence d’une
isomérisation demeure parallèlement possible [205].
Après condensation puis élimination de l’excès de réactif par
lavage alcalin, quatre techniques de dosage sont applicables.
■ Spectrométrie de la phase organique à 248 nm [9]
Prise d’essai optimale : 10 à 100 µg.

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2.2 Phénols
O
O O

V Les groupements phénoliques sont largement présents dans la

N N structure des composés antioxydants utilisés dans l’agroalimentaire
OH
et les matières plastiques. En tant que méthodes générales, les phé-
nols bénéficient de trois types de réactions en vue de leur photo-
métrie.
Figure 1 – Structure de l’oxine vanadique
■ Formation d’un complexe coloré avec l’ion ferrique
Cette réaction est fort simple et classique. Elle est pourtant peu
sensible et il n’existe pas de règle générale permettant de prévoir les
colorations qui se développent. Une étude portant sur 60 phénols a
pourtant permis de dégager quelques conclusions pour les dérivés
HO +
+ O2N C6H4 N N
de structure simple [44].
N ■ Mise à profit des propriétés réductrices
Le ferricyanure ferrique préparé extemporanément, est aisément
N N
réduit en bleu de Prusse, la spectrophotométrie étant effectuée à
HO C6H4 NO2
720 nm [31].
N La sensibilité est grande : 1 à 10 µg, mais de nombreux composés
interfèrent : arylamines, dérivés indoliques, vitamines A, C et D,
ergostérol.
Figure 2 – Réaction de la 8-hydroxyquinoléine avec l’ion Les phénols réduisent également les hétéropolyacides dérivés de
4-nitrophényldiazonium l’acide molybdique, en particulier les réactifs de Wavelet [32] ou de
Folin-Ciocalteu [33]. Il y a, dans ce cas, formation d’un « bleu de
molybdène ».
Diverses variantes de cette technique ont été proposées : rempla- Spectrophotométrie à 750 nm.
cement du chloroforme par le benzène [17] ou le nitrobenzène [18] La méthode a une bonne sensibilité (prise d’essai optimale : 5 à
emploi du sel de pipéridinium de l’oxine vanadique [19] ou de com- 15 µg) mais elle est peu spécifique. En effet, de nombreux autres
plexes du vanadium V avec des dérivés de la 8-hydroxyquinoléine composés réducteurs, tant minéraux qu’organiques, réagissent
[17]. également [32].

■ Acidification de la phase chloroformique ■ Réaction de diazocopulation

Elle fait virer la coloration au bleu stable, autorisant la lecture à
600 nm [10].
Prise d’essai optimale : 100 à 1 000 µg.
■ Après élimination de l’excès de réactif, hydrolyse acide du
complexe
La 8-hydroxyquinoléine libérée est dosée par diazocopulation
avec l’ion 4-nitrophényldiazonium (figure 2).
Spectrophotométrie de la coloration bleue obtenue à 580 nm [11].
Prise d’essai optimale : 10 à 100 µg.
■ Formation d’un complexe avec l’ion magnésium
Après élimination de l’excès de réactif, la 8-hydroxyquinoléine
libérée est révélée par formation d’un complexe avec l’ion magné-
sium autorisant une spectrofluorimétrie avec excitation à 366 nm et
émission à 520 nm [12].
Prise d’essai optimale : 100 à 500 µg.
■ Ces techniques autorisent aussi le dosage des hydroxystéroïdes,
mais avec une sensibilité très variable, la réactivité de ces molécules
étant étroitement liée à l’ensemble de leur structure. Contrairement
à l’hydroxyle tertiaire en C17, l’hydroxyle primaire en C21 des
corticostéroïdes ne réagit pas [13].
■ Le lecteur pourra consulter les références bibliographiques sui-
vantes, pour des réactions plus spécifiques concernant les :
— alcools primaires et secondaires [20], [21], [22] ;
— alcools primaires [23], [24] ;
— alcools secondaires [26] ;
— alcools tertiaires [27], [28] ;
— 1,2 diols [9], [25], [29], [30].
Les phénols bénéficient de cette réaction avec formation d’oxya-
zoïques intensément colorés en milieu alcalin. Cette méthode de
dosage a fait l’objet de nombreux travaux [43]. Toutefois, avec les
réactifs les plus classiques : acide p-sulfanilique diazoté et fluobo-
rate de 4-nitrophényldiazonium, le domaine d’application d’un
mode opératoire est restreint. Le développement de la coloration et
la sensibilité sont sous la dépendance de facteurs tels que la nature
et la localisation des substituants du noyau phénolique, le pH, la
température et le solvant. Deux réactifs n’offrent pas cet inconvé-
nient.
● Le 2-aminobenzothiazole diazoté, préparé extemporanément,
développe en milieu alcalin des colorations différentes avec les phé-
nols, la lecture au maximum d’absorption doit donc être fixée entre
380 nm et 580 nm [34] avec une prise d’essai optimale de 1 à 10 µg
(figure 3 a).
La méthode est également applicable aux arylamines et à certains
dérivés nitro-aliphatiques.
● La formation d’oxyazoïques est également obtenue avec la 3-
méthyl 2-benzothiazolinonehydrazone (MBTH) que l’on oxyde au
préalable in situ à l’aide de l’ion cérium IV (figure 3 b).
Les colorations obtenues varient de l’orangé au violet et les spec-
trophotométries sont fixées de 460 à 540 nm [36].
La sensibilité est bonne ; prise d’essai optimale : 5 à 12 µg.
Bien que le développement de la coloration soit sensible à la
lumière et à la température, la diazocopulation des phénols avec
l’ion 4-nitrophényldiazonium a fait l’objet de nombreuses applica-
tions [43]. Le réactif présente maintenant l’avantage d’être commer-
cialement accessible sous forme de fluoborate. Les colorations
obtenues sont différentes, suivant les phénols, du jaune au rouge, et
la spectrophotométrie est prévue entre 440 et 510 nm.
La prise d’essai optimale est de l’ordre de 5 à 20 µg.
Il convient de rappeler l’emploi proposé du phénitrazole [35] ou 3-
phényl 5-nitrosamino 1,2,4-thiadiazole dont la transposition en

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N +
C N N + OH H3C
S
N NH2 + OH
N
H3C
C N N OH
S H3C
3–
a diazocopulation avec 2-aminobenzothiazole diazoté Fe(CN)6
N N O

CH3 H3C

a avec la 4-diméthylaminoaniline
N
C N NH2 + OH
CH3 NH2
S
CH3
H3C N O + OH
N
Oxydation N
C N N O
S C6H5

CH3 CH3 N O

N+ Fe(CN)63–
H3C N O
C N N O– –
OH N
S
b diazocopulation avec la MBTH C6H5

b avec la 4-aminoantipyrine
Figure 3 – Diazocopulation des phénols

CH3
milieu acide en sel de diazonium hétérocyclique autorise la copula-
tion avec les phénols. Malheureusement, le réactif n’est pas com- H3C N H3C NH2
mercialisé. CH3
Oxydation
■ Formation d’indophénols H3C N O H3 C N O
N N
La formation de quinone-imines substituées à l’azote (indophé-
nols) colorées en bleu, violet ou rouge, peut être obtenue à l’aide de C6H5 C6H5
plusieurs réactifs [37].
● Avec la 4-diméthylaminoaniline [38], [39] en présence d’ions c avec la diméthylamino-antipyrine
ferricyanure (figure 4 a), la spectrophotométrie est effectuée entre
400 et 670 nm. Br
Prise d’essai optimale : 10 à 100 µg.
L’acide salicylique et la vanilline ne réagissent que faiblement. O N Cl + OH

● Avec la 4-aminoantipyrine et l’ion ferricyanure, le dérivé formé

est un indophénol lié à la structure de la pyrazolone (figure 4 b). Br
Br
La méthode a reçu de très nombreuses applications autorisant la
colorimétrie des phénols en solution aqueuse très diluée [40], [48].
La coloration rouge orangé obtenue permet la spectrophotométrie à O N OH
470 nm, la prise d’essai optimale étant comprise entre 100 et 200 µg.
Des règles de réactivité des phénols, suivant les substituants du Br
cycle, ont pu être énoncées : à noter que le p-crésol, l’acide salicyli- d avec la 2,6-dibromoquinone 4-chlorimine
que, les p-hydroxybenzoates et la vanilline ne sont pas réactifs.
● La réaction mettant en œuvre la diméthylamino-antipyrine et
l’ion ferricyanure s’apparente à la précédente [41]. Il y a, dans un Figure 4 – Formation d’indophénols
premier temps, oxydation du réactif en 4-aminoantipyrine puis con-
densation sur le phénol fournissant le même indophénol hétérocy-
clique [49] (figure 4 c).
● Suivant un autre principe réactionnel, la condensation en
La 4-diméthylaminoantipyrine présente sur la 4-aminoantipyrine milieu alcalin des phénols avec la 2,6-dibromoquinone 4-chlorimine
l’avantage d’être un composé très stable qu’il est aisé de se procurer conduit à la formation de N-aryl quinone-imines, de couleur bleue à
à l’état très pur. Par ailleurs, la réaction est pratiquée en solution rouge violet [42] (figure 4 d).
aqueuse ne nécessitant pas l’extraction par le chloroforme requise
pour la méthode à la 4-aminoantipyrine. Ici la coloration obtenue est Les spectrophotométries sont effectuées entre 540 nm et 630 nm
rouge avec spectrophotométrie à 500 nm. avec des prises d’essai optimales de 20 à 50 µg de composé phéno-
Prise d’essai optimale : 10 à 20 µg. lique.

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■ Réaction avec l’acide nitreux

Il convient enfin de citer pour mémoire la réaction avec l’acide
nitreux qui forme des dérivés nitrés jaunes en milieu alcalin [45], R
mais qui n’a pas de caractère général. Quant au réactif de Millon,
solution acide complexe d’ions nitrite, nitrate, mercureux et mercu- C O + H2N NH CO CO NH NH2
rique, il développe avec de nombreux phénols des colorations jaune
à rouge par nitrosation et formation d’un chélate mercuriel. Toute- R
R
fois, la sensibilité des réactions varie avec divers paramètres :
temps, température [46], [47]. C N NH CO CO NH NH2
■ Le lecteur pourra consulter les références bibliographiques sui- R
vantes, pour des réactions plus spécifiques concernant les : R
— phénols p-substitués [50] et [51] ; Cu2+
— 1,2-diphénols [52] ; C N N C C NH NH2
— 1,3-diphénols [53] ;
R O O
— 1,2,3-triphénols ([37] p. 46), [54].
Cu
2
2.3 Composés carbonyles a avec l'oxalyldihydrazide

Les principales méthodes générales de colorimétrie des aldé- C O + H2N NH NO2

hydes et des cétones sont fondées sur la formation d’hydrazones.
Divers dérivés de l’hydrazine ont été proposés [55]. Les techniques
suivantes [21], [56] à [58] présentent l’avantage de ne pas nécessiter
la séparation de l’excès de réactif avant la lecture spectrophotomé-
trique. D’une façon générale, l’empêchement stérique au voisinage C N NH NO2
du groupement carbonyle peut gêner les réactions, plus particuliè-
rement dans le cas des cétones. O
■ L’oxalyldihydrazide se condense avec les dérivés carbonylés pour OH–
former une hydrazone dont le complexe cuivrique est coloré en bleu C N N N
[56] (figure 5 a).
O–
Les mesures différentielles effectuées à des pH convenables auto-
b avec la 4-nitrophénylhydrazine
risent quelques dosages sélectifs. Les spectrophotométries sont tou-
tes effectuées entre 590 et 610 nm, mais les prises d’essai optimales,
NO2
différentes suivant le composé dosé, sont particulièrement faibles
pour le formaldéhyde (7 µg) et l’acétaldéhyde (11 µg). Par contre, la
réaction est négative avec le cinnamaldéhyde, le salicylaldéhyde, le C O + H2N NH NO2
furfural, le glyoxal, l’acétophénone, le glucose et le fructose.
■ La formation de 4-nitrophénylhydrazones en milieu acide dilué NO2
est révélée par action de l’hydroxyde de benzyltriméthylammonium
dans le diméthylformamide [21] (figure 5 b). C N NH NO2
Les colorations obtenues sont rouges ou violettes et la spec-
trophotométrie est effectuée entre 510 et 590 nm. La méthode est
d’une grande sensibilité et très générale. c avec la dinitrophénylhydrazine

Prise d’essai optimale : 5 à 30 µg.

La même formation de 4-nitrophénylhydrazones, réalisée dans les
acides acétique et chlorhydrique, fournit des colorations jaunes per-
mettant les mesures de 400 à 410 nm. La sensibilité de la réaction
est la même qu’en milieu alcalin ([37] p. 130).
■ C’est également en milieux acides acétique et chlorhydrique que
la 2,4-dinitrophénylhydrazine forme les hydrazones correspondan-
tes colorées en jaune orangé [57] (figure 5 c).
Spectrophotométrie à 412 nm.
Les prises d’essai optimales varient également avec la structure
liée au groupement carbonyle.
Le lecteur pourra consulter les références bibliographiques sui-
vantes, pour des réactions plus spécifiques concernant les :
— aldéhydes aliphatiques [25], [59], [60], [61], [62], [213] ;
— aldéhydes α-méthyléniques [25] ;
— aldéhydes α,β-éthyléniques [67] ;
— aldéhydes aromatiques [62], [64] ;
— cétones [65] ;
— cétones α-méthyléniques [7], [66] ;
— dicétones [69] ;
— 1,4-quinones [70], [71].
Figure 5 – Formation d’hydrazones
2.4 Acides carboxyliques et dérivés
Les colorimétries des acides carboxyliques sont principalement
obtenues suivant deux voies : la formation d’esters colorés ou celle
d’acides hydroxamiques révélés par l’ion ferrique.
■ Formation d’esters colorés
Lors de la formation d’esters, des conditions opératoires conve-
nables permettent de les quantifier sélectivement, sans interférence
de l’excès de réactif.
● Par condensation d’un sel de sodium d’acide carboxylique sur
le bromure de p-nitrophénacyle ou 2-bromo (4-nitrophényl) 1-étha-
none dans l’acétonitrile, l’ester formé est révélé par la diéthylamine
dans le diméthylsulfoxyde [72] (figure 6 a).
Spectrophotométrie à 550 nm.
Prise d’essai optimale : 7 à 90 µg.

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R COONa + Br CH2 CO NO2 Ni2+

R COOH + NH2OH R CO NHOH

R C NH
R COO CH2 CO NO2

O O
a avec le bromure de p-nitrophénacyle
Fe3+ O Fe O R

R COOH + HO NO2 HN O O C

C NH
NO2

+ C6H11 N C N C6H11 R
a en présence de chlorure de nickel
R COO NO2
R COOH + NH2OH + C6H11 N C N C6H11
NO2

+ C6H11 NH CO NH C6H11 R CO NHOH + OC(NH C6H11)2

KBH4
Fe3+
R CO NHOH Complexe ferrique
Dérivé coloré
b en présence de dicyclohexylcarbodiimide
b avec le 2,4-dinitrophénol

Figure 7 – Formation d’acides hydroxamiques

Figure 6 – Formation d’esters colorés

● Les esters, amides et lactones ne réagissent pas. À titre d’exem-

● En présence de dicyclohexylcarbodiimide, les acides carboxyli-
ques sont estérifiés par le 2,4-dinitrophénol. L’ester formé est
ensuite réduit par le borohydrure de potassium qui développe une
coloration rouge-violet [73] (figure 6 b).
Spectrophotométrie à 560 nm.
Prise d’essai optimale : 20 à 100 µg.
La coloration finale pourrait être due à la réduction du noyau aro-
matique avec formation d’un ion dérivé du dinitrocyclohexène [78].
La réaction ne se produit pas avec l’acide formique.
■ Formation d’acides hydroxamiques révélés par l’ion
ferrique
Il a longtemps été admis que l’hydroxamation des acides carboxy-
liques libres ne pouvait être obtenue directement par action de
l’hydroxylamine. Dès lors, les techniques proposées faisaient appel
à la transformation préalable en esters par l’éthylèneglycol en pré-
sence d’acide sulfurique [74] ou par le méthanol en présence de
dicyclohexylcarbodiimide [75]. Plus récemment, il est apparu que la
substitution hydroxamique était possible directement, en milieu
légèrement acide et en présence d’un catalyseur convenable.
● À pH 6,3 et à chaud, le chlorure de nickel permet l’hydroxama-
tion des acides carboxyliques. La révélation par l’ion ferrique déve-
loppe des colorations brunes [76] (figure 7 a).
Spectrophotométrie à 530 nm.
Les prises d’essai optimales des monoacides aliphatiques sont
comparables et de l’ordre de 100 µg ; elles sont très variables avec
les diacides.
● Par son action déshydratante, le dicyclohexylcarbodiimide con-
duit également aux acides hydroxamiques révélés par l’ion ferrique
[77] (figure 7 b).
Les colorations obtenues sont brun-violet.
Spectrophotométrie entre 510 et 550 nm.
Prise d’essai optimale : 100 à 500 µg.
ple, la méthode permet la recherche de 0,1 % (en masse) d’acide
acétique dans l’acétate de butyle [77]. La réaction hydroxamique a
fait l’objet de très nombreuses applications, plusieurs centaines de
produits ayant été dosés par cette méthode [79], [83].
Il est à noter que, seuls, les acides carboxyliques aliphatiques
supérieurs forment avec la rosaniline un sel coloré en rouge orangé,
soluble dans le benzène [80].
■ Le lecteur pourra consulter les références bibliographiques sui-
vantes, pour des réactions plus spécifiques concernant les :
— acides α,β-dihydroxylés [25], [82], [86], [87] ;
— acides 2-oxo 1-carboxyliques [9], [88] ;
— chlorures et anhydrides d’acides [83] ;
— esters, lactones et amides [83] à [85].
2.5 Groupements fonctionnels azotés
Les réactions communes aux trois classes d’alkylamines et aux
ammoniums quaternaires sont fondées sur leur caractère basique.
Elles ne sont donc applicables qu’en l’absence d’autres composés à
réaction alcaline.
■ Un réactif composé de sulfate de manganèse et de nitrate
d’argent soumis à l’action d’un composé alcalin fournit un précipité
noir d’argent colloïdal (figure 8 a).
Cette réaction peut être rendue semi-quantitative pour les compo-
sés à azote basique par utilisation de leur volatilité pour les déplacer
de leur solution, rendue alcaline, vers un papier réactif Ag-Mn. L’éta-
lonnage est réalisé à l’aide de témoins préparés à partir de quantités
connues de la base volatile [90].
Prise d’essai optimale : 4 à 20 µg.
■ Avec un réactif sulfate ferreux-nitrate d’argent, il se forme éga-
lement un précipité noir et la réaction peut être réalisée en phase
aqueuse [91] (figure 8 b).

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MnSO4 + 2 AgNO3 + 4( N) + 2 H2O

O N O
C C
MnO2 + 2 Ag + H2SO4 ( N)2 + 2 HNO3 ( N)
+ NaNO2 + CH3COOH
a avec du sulfate de manganèse et du nitrate d'argent H C N
H C H
2 FeSO4 + 2 AgNO3 + 6( N) + 3 H2O
O
Fe2O3 + 2 Ag + 2 H2SO4 ( N)2 + 2 HNO3 ( N) Acide barbiturique
H
b avec du sulfate ferreux et du nitrate d'argent
O N O
O 2N NO2 C C
+ H 2O + CH3COONa
+ CH3 NO2 + N
C N
H O N C H
NO2
O
H CH2 NO2
Acide violurique
O2N NO2
+
Figure 9 – Formation d’acide violurique
NH

NO2 • hydrazines mono et N,N-disubstitués [157], [158],

c avec du nitrométhane et du 1,3,5-trinitrobenzène
Figure 8 – Réactions alcalines des groupements fonctionnels azotés
Spectrophotométrie à 450 nm.
Prise d’essai optimale : 25 à 75 µg.
■ En présence d’un composé basique, le nitrométhane se condense
sur le 1,3,5-trinitrobenzène, formant un complexe de coloration
rouge (figure 8 c).
Ce complexe de type Meisenheimer peut, avec des modes opéra-
toires différents, être obtenu aussi bien avec les amines libres et les
hydroxydes d’ammonium qu’avec les chlorhydrates et les halogé-
nures [95].
Spectrophotométrie à 565 nm.
Prise d’essai optimale : 5 à 30 µg.
■ Le lecteur pourra consulter les références bibliographiques sui-
vantes, pour des réactions plus spécifiques concernant :
— les alkylamines :
• alkylamines primaires, secondaires et tertiaires [97] à [99],
• alkylamines primaires et secondaires [5], [9], [96], [100] à [109],
• alkylamines secondaires et tertiaires, ammoniums quaternai-
res [37], [111] à [117], [119], [120],
• alkylamines primaires [21], [25], [121] à [124], [126], [127],
[138],
• alkylamines secondaires [128] à [130], [131],
• alkylamines tertiaires [24], [37], [108], [132], [133],
• alcools primaires α-aminés [134],
• acides α-aminés [125], [135] à [137], [139] ;
— les arylamines :
• arylamines primaires, secondaires et tertiaires [31], [34], [63],
[140] et [141],
• arylamines primaires et secondaires [13],
• arylamines primaires ([37] p. 105), [142], [144] à [146], [149] ;
— les substances à groupements azotés divers :
• guanidines et urées [206] à [211],
• composés nitrés [25], [34], [38], [147], [148], [150], [152] à
[156] ;
— les substances hétérocycliques azotés :
• indoles et carbazoles non substitués à l’azote [31] et [190],
• indoles non substitués en position 2 ou 3 [191], [192],
• composés pyridiniques [194] à [199],
• composés imidazoliques non substitués à l’azote [200],
• dérivés phénothiazines [201] à [203], [212].
3. Développements récents
3.1 Acide barbiturique
L’acide barbiturique (2,4,6-trihydroxypyrimidine, malonylurée) est
nitrosé en position 5 en milieu acide en acide violurique de couleur
rouge-violet [214], [215]. La réaction réalisée à température
ambiante est rapide (< 1 min) et la couleur reste stable pendant 24 h
(figure 9).
Spectrophotométrie de la coloration rouge-violet obtenue à
530 nm.
La relation est linéaire sur le domaine de concentration 0,018 75 à
2,25 mg/mL d’acide barbiturique avec une limite de détection de
18,75 µg/mL.
Cette méthode a la même sensibilité que les classiques réactions
colorées utilisant la p-benzoquinone [216] ou la p-diméthylamino-
benzaldéhyde [217], mais ces dernières nécessitent de longues
périodes d’incubation.
Les barbituriques substitués en 5 par des groupements alkyl et
aromatiques ne réagiront pas avec l’acide nitreux.
La spécificité de la réaction vis-à-vis de différents composés orga-
niques (acides carboxyliques, groupements éther, hydroxyles, ami-
nes, amides et cycles aromatiques) a été testée. Seules les
substances qui présentent des groupements amines primaires et
secondaires réagissent avec l’acide nitreux pour produire respecti-
vement des alcènes et des alcools ou des N-nitrosoamines.

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B(OH)2
N N
R H
N N+ N N
Ph Ph R NO2
R
CH3 CH3 (1) (2)

Figure 10 – Produit de condensation du MDA avec le 1-méthyl-2- N

phénylindole

3.2 Malondialdéhyde N

O OH N
La peroxydation des acides gras polyinsaturés, constituants fon- HO
damentaux des membranes, produit du malondialdéhyde (MDA) et
HO OH
du 4-hydroxy-2(E)-nonenal (4-HNE) toxiques pour les cellules. De
nombreuses réactions colorées ont été mises au point pour évaluer N
OH
ces composés. La plus utilisée est la réaction de condensation avec (1) + (2)
de l’acide 2-thiobarbiturique (TBA) avec le MDA qui fournit un pro- B
duit stable de constante d’absorption élevée à 532 nm. Toutefois, O
cette réaction est peu spécifique [218], [219]. Parmi les autres
méthodes spectrophotométriques, les 1-méthylpyrrole et indole O
O
sont les seuls réactifs qui n’imposent pas de chauffage prolongé. R
Mais, les produits de réaction du malondialdéhyde avec les 1- OH
méthylpyrrole [220], indole [220] ou 2-méthylindole [221] ne sont
pas stables et ne présentent pas de coefficients d’absorption HO HO
molaire très élevés.
Cependant, la réaction du 1-méthyl-2-phénylindole avec le MDA Figure 11 – Détection d’oses à l’aide de sondes colorimétriques
donne un chromophore stable (figure 10) avec une absorbance éle-
vée à 586 nm [222] (coefficient d’absorption molaire de l’ordre de cellulaire est largement utilisé en immunologie, cancérologie, viro-
110 000 M−1 · cm−1). La limite de détection est de 0,1 µM. logie et bactériologie [224].
Conduite en présence d’acide méthanesulfonique, cette réaction
colorée permet d’apprécier les deux composés malondialdéhyde et Les cellules cultivées dans une plaque de 96 puits sont incubées
du 4-hydroxyaldenal. Par contre, en présence d’acide chlorhydrique, avec la solution de MTT pendant plusieurs heures. Les cristaux vio-
la réaction devient plus lente avec le MDA et quasi imperceptible lets de formazan se forment durant cette période d’incubation. Inso-
avec le 4-HNE. lubles en solution aqueuse, ils sont solubilisés dans un solvant
adapté [DMSO (diméthylsulfoxyde), isopropanol]. La solubilisation
arrête la réaction colorimétrique. La solution colorée résultante est
quantifiée spectrophotométriquement à 540 nm en utilisant un lec-
3.3 Mises au point de sondes teur de plaque ELISA avec un filtre adéquat.
colorimétriques pour la détection La quantité de formazan formé en un temps donné est proportion-
d’oses nelle à la quantité de cellules métaboliquement actives. Le spectre
d’absorption du formazan dépend du nombre de cellules et du pH
du solvant.
L’interaction de l’acide 3-nitrophényl-boronique (1) avec l’azote Le premier essai a été décrit par Mosmann en 1983 et, depuis, a
pyridiné du 4-(4-diméthyl-aminophényl-azo) pyridine (2) dans le fait l’objet de modification pour améliorer la sensibilité de l’essai, en
méthanol se traduit par un changement de couleur du jaune à particulier sur les durées d’incubation qui varient selon le domaine
l’orange (figure 11). La présence de sucres réducteurs qui forment d’application (15 min à 4 h) ou la nature du solvant (DMSO, iso-
un complexe avec (1) augmente l’acidité de l’acide boronique et propanol acidifié, sodium dodécylsulfate).
favorise le transfert de charge intra-moléculaire. Ce phénomène se
traduit par l’apparition d’une coloration rouge [223].
La méthode a été appliquée à la détection du D-fructose et du D-
arabinose avec une mesure spectrophotométrique à 540 nm. Cette
méthode permet de détecter des concentrations d’oses de l’ordre de 4. Conclusion
1,00 × 10−5 M.

L’usage des réactions colorées autrefois réservé à l’identification

3.4 Test de cytotoxicité ou MTT
Le (3[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényl-tétrazolium) ou MTT
qui peut être réduit chimiquement en formazan présente la particu-
larité d’être également transformé en formazan par les deshydrogé-
nases mitochondriales des cellules vivantes. Ce test de viabilité
de molécules organiques s’est étendu à d’autres domaines. De plus,
la technologie a évolué ces dernières années et facilite la mise en
œuvre de ces réactions colorées avec l’usage de fibres optiques
pour les mesures spectrophotométriques à distance. Ces systèmes
s’avèrent intéressants pour contrôler sur site des matières premiè-
res, travailler dans des atmosphères explosives ou des environne-
ments très contaminés ou enfin pour surveiller en ligne les procédés
de fabrications.

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De même, dans le domaine de la bioanalyse, l’évolution de la
technologie a permis de nouvelles applications comme, par exem-
ple, le couplage d’un marqueur de fluorescence ou fluorophore à
des molécules d’acides nucléiques afin de réaliser des sondes biolo-
giques. Celles-ci sont exploitées dans les laboratoires de cytologie
génétique pour détecter des anomalies biochimiques responsables
de malformations ou de cancers. Les marqueurs de fluorescence
sont de petites molécules qui subissent des changements de leurs
paramètres de fluorescence par suite de leur interaction avec des
macromolécules [225].

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