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Concours CAPET Externe

Section Biotechnologies
Option Biochimie Génie Biologique
Session 2010

ANALYSES BACTÉRIOLOGIQUES
D’EAU MINÉRALE NATURELLE ET
D’EAU DE SOURCE
EMBOUTEILLÉES

Candidat n°07
SOMMAIRE

ABRÉVIATIONS ...................................................................................................................... 3
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 4
ETUDE TECHNIQUE ............................................................................................................... 5
1. L’eau embouteillée ............................................................................................................. 6
1.1. Flore naturelle de l’eau .................................................................................................... 6
1.2. Les différentes sortes d’eau embouteillée ....................................................................... 6
1.2.1. Les eaux de source ................................................................................................... 6
1.2.2. Les eaux minérales naturelles .................................................................................. 7
1.2.3. Les eaux rendues potables par traitement................................................................. 7
1.3. Les normes françaises actuelles ...................................................................................... 7
1.3.1. Les normes microbiologiques .................................................................................. 7
1.3.2. Les autres critères ..................................................................................................... 8
1.4. Les biocontaminations en industrie agroalimentaire ....................................................... 8
1.4.1. Les origines .............................................................................................................. 8
1.4.2. Les pathogènes et leurs effets ................................................................................. 10
2. Les analyses effectuées .................................................................................................... 11
2.1. Le site de production ..................................................................................................... 11
2.2. Les points de contrôle ................................................................................................... 13
2.3. Les techniques d’analyse ............................................................................................... 14
2.3.1. Types d'analyse ...................................................................................................... 14
2.3.2. Prélèvement des échantillons ................................................................................. 15
2.3.3. Analyse microbiologique des échantillons ............................................................. 15
2.3.4. Analyse physico-chimique des échantillons .......................................................... 18
2.4. Exemples de résultats et conséquences sur l’exploitation ............................................. 19
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE ....................................................................................................... 21
1. Introduction ...................................................................................................................... 22
2. Présentation des différents niveaux d’exploitation possibles ........................................... 22
2.1 Application en enseignement d’exploration en classe de seconde ............................ 22
2.2 Application en biochimie en classe de première STL-BGB...................................... 23
2.3 Application en microbiologie en classe de terminale STL-BGB .............................. 23
2.4 Application en microbiologie en STS ....................................................................... 23
3. Présentation de la séquence détaillée ............................................................................... 24
3.1 Modalités d’enseignement ......................................................................................... 24

1
3.2 Contenu du programme concerné .............................................................................. 24
3.3 Objectifs de la séquence et prérequis ........................................................................ 25
3.4 Préparation préalable ................................................................................................. 26
3.4.1 Par le professeur ................................................................................................. 26
Protocole……………………………………………………………………………………...27
Fiche technique Filtration………………………………………………………………..…...29
Fiche technique Milieux……………………………………………………………………...30
3.4.2 Par le personnel technique.................................................................................. 31
3.5 Organisation détaillée de la séquence :...................................................................... 32
3.5.1 Supports et consignes ......................................................................................... 32
3.5.2 Déroulement détaillé de la séquence .................................................................. 32
3.6 Modalités d’évaluation .............................................................................................. 34
BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………………36
Annexe 1 : critères de qualité microbiologique du décret du 14 mars 2007 ............................ 37
Annexe 2 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse à la source et aux
points critiques de contrôle ...................................................................................................... 38
Annexe 3 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse du produit fini et en
cours de commercialisation ...................................................................................................... 39
Annexe 4 : Formules des milieux de culture40Annexe 5 : fiche technique du Dosage des ions
ammonium ................................................................................................................................ 41
Annexe 6 : fiche technique du Dosage du fer ........................................................................ 402
Annexe 7 : fiche technique du Dosage des ions manganèse .................................................. 413
Annexe 8: fiche technique du dosage des nitrites…………………………………………….44

2
ABRÉVIATIONS

BAC : bioanalyses et contrôles


BEA : bile esculine azide
BGB : biochimie génie biologique
BLP : biologie de laboratoire et paramédicale
DLUO : date limite d’utilisation optimale
EMB : éosine bleu de méthylène
EPEC : Escherichia coli entéropathogènes
NPP : nombre le plus probable
PCA : plate count agar
PET : polyéthylène tétraphtalate
QIABI : qualité dans les industries agroalimentaires et les bioindustries
STL : sciences et techniques de laboratoire
STS : section de technicien supérieur
Tergitol 7 : heptadécylsulfate de sodium
TTC : Triphényl-2,3,5-Tétrazolium Chlorure
UFC : unités formant colonies

3
INTRODUCTION
L’eau constitue 60% de notre organisme et une consommation de 1,5 litre par jour est
conseillée pour compenser les pertes hydriques. En raison de son caractère vital, l’eau
consommée doit être de bonne qualité sanitaire, afin d’éviter la survenue de pathologies
d’origine hydrique.
Le consommateur a aujourd’hui le choix entre l’eau du réseau de distribution, qui provient
majoritairement de captages d’eaux superficielles (rivières, lacs, canaux) et d’eau
embouteillée provenant de ressources profondes (nappes souterraines). Dans tous les cas, ces
eaux brutes doivent subir des traitements plus ou moins complexes selon leur qualité initiale.
Le produit distribué au consommateur doit répondre à des exigences de qualité
microbiologique et physico-chimique. Il subit donc un grand nombre de contrôles lors de sa
production.

Le travail présenté ici a été effectué dans une usine d’embouteillage lors d’une mission
d’intérim en tant que technicienne de laboratoire. J’ai pendant quatre mois réalisé les analyses
de qualité de l’usine : analyses microbiologiques sur le produit fini (eau minérale gazéifiée ou
non et eau de source embouteillées), qualité microbiologique de l’environnement, analyse de
l’eau aux différentes étapes de la mise en bouteilles. Ce travail est plus un contrôle qualité de
la production en routine qu’une analyse poussée du produit fini, cette dernière étant réalisée
par un laboratoire mieux équipé centralisant les analyses complètes des produits de toutes les
usines du groupe. Il s’agissait plus de contrôler certains points critiques afin de pouvoir réagir
rapidement en cas de problème. Ainsi les analyses qui sont effectuées doivent répondre à une
triple contrainte : elles doivent avoir un coût réduit, être réalisables facilement et donner des
résultats rapidement.

Dans l’étude technique, quelques rappels sur la réglementation et sur les précautions sanitaires
en agroalimentaire seront présentés. Ensuite, le fonctionnement de l’usine et les principaux
points de contrôle ainsi que les protocoles d’analyses seront décrits.
Dans l’application pédagogique, ce travail a été adapté pour être proposé en travaux pratiques
de microbiologie à une classe de terminale STL-BGB. Le but est à la fois de présenter une
nouvelle technique (la filtration de l’eau) et de donner une vision intégrée des analyses
microbiologiques dans une situation de travail, ici dans une usine agroalimentaire.

4
ÉTUDE TECHNIQUE

5
ÉTUDE TECHNIQUE

1. L’eau embouteillée
L’eau est un produit alimentaire particulier à bien des égards. C’est un milieu pauvre qui ne
permet pas le développement des micro-organismes, et s’il est sensible à des contaminations
microbiennes au même titre que les autres aliments, les conséquences sont plus limitées car
ces contaminants ne pourront pas se multiplier. L’eau de source et l’eau minérale ne
nécessitent pas de stérilisation, mais doivent répondre à des critères de qualité comme les
autres aliments. Si le producteur a une obligation de résultats, il n’a cependant pas
d’obligation de moyens. Le producteur peut donc effectuer les analyses qu’il décide avec les
milieux de culture de son choix, afin de s’adapter au mieux aux risques réels de la production
dans son usine.

1.1. Flore naturelle de l’eau


L’eau, quelque soit son origine (souterraine ou superficielle), constitue un écosystème. Elle
contient des sels minéraux, des molécules organiques, des particules colloïdales, et des
organismes vivants qui utilisent ces composés pour leur métabolisme afin de se multiplier.

Les bactéries rencontrées dans l’eau peuvent avoir trois origines différentes :
- une origine purement aquatique : germes aquicoles adaptés aux conditions de
température et à la disponibilité des substrats minéraux et organiques de ce milieu,
- une origine terrestre : leurs propriétés d’adaptation leur permettent de survivre et
éventuellement de se développer,
- une origine humaine ou animale : germes de contamination appelés germes fécaux,
dont la température normale de développement est de 37°C. Ils survivent dans ce
milieu mais ne peuvent pas y croître.

Les eaux souterraines ont pour origine l’eau de pluie ou les eaux de ruissellement qui
s’infiltrent dans le sol. Lors de cette infiltration, l’eau se charge en polluants, particules de
matière organique et microorganismes. Le passage dans le sol s’apparente à une filtration à
travers un milieu poreux dont les pores seraient de très petite taille. La matière organique
particulaire ainsi que les bactéries qui y sont fixées sont ainsi majoritairement éliminées. En
parallèle, l'eau se charge en composants des sols et des roches mères et peut acquérir des sels
minéraux en grande quantité (calcium, magnésium, sulfates...).

L’eau des nappes profondes ne contient pas de microorganismes phototrophes du fait de


l’obscurité qui y règne, pas de microorganismes aérobies du fait de l’absence d’oxygène et la
pauvreté en matière organique rend ce milieu très défavorable au développement des autres
microorganismes. De fait, l’autoépuration de l’eau profonde est presque complète, et ce
d’autant plus que la percolation aura été longue. La population bactérienne des eaux
profondes est donc extrêmement réduite aussi bien en nombre d’espèces qu’en quantité de
microorganismes. Cette eau est naturellement d’une qualité hygiénique excellente et sa
consommation a toujours été préférée à celle des eaux de surface quand cela était possible.

1.2. Les différentes sortes d’eau embouteillée


1.2.1. Les eaux de source
Les eaux de source sont d’origine souterraine, microbiologiquement saines et protégées contre
les risques de pollution, elles sont naturellement propres à la consommation humaine. Les

6
ÉTUDE TECHNIQUE

seuls traitements autorisés sont la décantation ou filtration et l’incorporation de dioxyde de


carbone. L’eau de source commercialisée sous un même nom peut provenir de sources
différentes. L’exploitation d’une source nécessite une autorisation préfectorale et un avis
favorable du Conseil Départemental d’Hygiène.

Les mentions obligatoires de l’étiquetage sont le nom de la source, son lieu d’exploitation et
les traitements de séparation des composés instables, tels le fer ou le manganèse, par
décantation ou filtration ; en mention facultative, l’utilisation pour l’alimentation des
nourrissons peut être signalée (c’est la seule allégation nutritionnelle autorisée pouvant
apparaître sur l’étiquette).

1.2.2. Les eaux minérales naturelles


Les eaux minérales naturelles sont d’origine souterraine. En France, une eau ne peut être
qualifiée de minérale que si elle a une composition en minéraux stable dans le temps. Sa
composition est donc garantie, ainsi que la constance de l’ensemble des critères de qualité.
Elle est naturellement propre à la consommation humaine. Elle est commercialisée sous un
seul nom et ne peut provenir que d’une seule source. L’exploitation d’une source nécessite
une autorisation préfectorale et un avis favorable du Conseil Départemental d’Hygiène. L'eau
minérale gazeuse ne doit subir aucun traitement chimique. La loi française autorise
uniquement deux types de traitement : le retrait du fer et la regazéification. Les valeurs
thérapeutiques de certaines eaux minérales sont utilisées en cure thermale, elles nécessitent
une Autorisation du Ministère chargé de la Santé après avis de l'Académie Nationale de
Médecine.

1.2.3. Les eaux rendues potables par traitement.


Elles respectent les limites applicables aux eaux du robinet. Elles peuvent être traitées suivant
tous les traitements autorisés pour l'eau du robinet, y compris la désinfection. Elles sont peu
commercialisées en France.

1.3. Les normes françaises actuelles


Les critères de qualité des eaux conditionnées (eau minérale naturelle, eau de source et eau
rendue potable par traitement), leurs traitements et les mentions d’étiquetage sont précisés
dans le décret du 14 mars 2007.

1.3.1. Les normes microbiologiques


Pour éviter les intoxications alimentaires, l'eau destinée à la consommation humaine ne doit
contenir aucun microorganisme pathogène. Pour s’en assurer, on recherche essentiellement
deux types de bactéries :

- La flore aérobie mésophile totale (à 20°C, en 72 heures). Ce sont principalement des


bactéries naturelles de l’eau. Ce dénombrement permet de mesurer le degré de
pollution de l’eau.

- La flore fécale (à 37°C, en 24 heures). La présence de ces bactéries reflète une


contamination par des matières fécales et une possible présence de bactéries
pathogènes (en particulier Shigella). Dans ce cas, des mesures doivent être prises pour
interdire la consommation de l'eau qui ne répond plus aux normes sanitaires des eaux
conditionnées (voir tableau 1).

7
ÉTUDE TECHNIQUE

Tableau 1 : critères de qualité microbiologique des eaux conditionnées


Limites de
Paramètres Unités Notes
qualité
A l’émergence et au cours de la
Escherichia coli 0 250 mL
commercialisation
A l’émergence et au cours de la
Entérocoques 0 250 mL
commercialisation
Bactéries sulfito-réductrices y A l’émergence et au cours de la
0 50 mL
compris les spores commercialisation
A l’émergence et au cours de la
Pseudomonas aeruginosa 0 250 mL
commercialisation
A l’émergence et au cours de la
Coliformes totaux 0 250 mL
commercialisation
0 Par mL A l’émergence
Numération de germes aérobies
Dans le produit fini 12 heures
revivifiables à 22°C 100 Par mL
maximum après l’embouteillage
0 Par mL A l’émergence
Numération de germes aérobies
Dans le produit fini 12 heures
revivifiables à 37°C 20 Par mL
maximum après l’embouteillage
A l’émergence et au cours de la
Microorganismes pathogènes : Variable
commercialisation
Cryptosporidium, Gardia, 0 selon les
Recherche uniquement en cas de
Legionella souches
contamination.

1.3.2. Les autres critères


Les eaux destinées à la consommation humaine doivent, outre la qualité microbiologique,
répondre à d’autres paramètres de qualité :
- des paramètres organoleptiques (incolore, limpide, inodore, sans saveur),
- des paramètres physico-chimiques (température, pH, teneurs en minéraux, quantité de
résidus secs, radioactivité),
- le taux de certains produits chimiques potentiellement toxiques comme les pesticides est
limité.

1.4. Les biocontaminations en industrie agroalimentaire


1.4.1. Les origines
La matière première alimentaire est toujours porteuse d’une flore spécifique. Les
contaminations de la matière première sont appelées contaminations primaires.
Lors de la préparation de l’aliment, des contaminants sont apportés qui peuvent accroître la
charge microbienne globale. Ce sont des contaminations secondaires, apportées par l’air, le
matériel au contact de l’aliment, et par les manipulateurs. Dans le pire des cas, l’introduction
de bactéries pathogènes est également possible. Cette flore prolifère dans l’aliment, causant
éventuellement sa dégradation et risquant de causer une toxi-infection alimentaire lors de son
ingestion (figure 1).

8
ÉTUDE TECHNIQUE

Figure 1 : origines diverses de la flore d’un aliment transformé

L’eau d’origine profonde est un cas particulier car c’est un milieu nutritif très pauvre, la
plupart des bactéries ne peuvent s’y multiplier. L’absence de matière organique implique
également qu’elle ne peut être altérée par les micro-organismes, une contamination
importante sera donc moins facilement détectable par le consommateur. Enfin, l’eau profonde
est quasiment exempte de microorganismes lorsqu’elle est pompée dans le sous-sol, la flore
retrouvée dans le produit fini provient donc exclusivement des opérations technologiques
réalisées lors de l’embouteillage (contaminations secondaires). Toutes les précautions
d’hygiène sont prises pour limiter ces biocontaminations (voir tableau 2).

Tableau 2 : possibilités de biocontaminations de l’eau lors de l’embouteillage et moyens


de prévention
Origine des biocontaminations Moyens de prévention
Flore Flore oropharyngée Port de masque à usage unique
humaine Flore intestinale
Lavage des mains, formation du personnel
manuportée
Flore des cheveux Port de la charlotte à usage unique
Flore de Salle à empoussièrement contrôlé (filtration de l’air
Atmosphère des salles
l’air entrant, légère surpression, sas à l’entrée)
Désinfection après chaque cycle de production de toute la
Machines et matériel salle et du matériel, élimination des premières bouteilles
produites (rinçage des canalisations par l’eau circulante)
Flore de Eau technique pour le
Chloration
l’eau lavage
Flore du Chaussures du Pédiluves à l’entrée des salles, surchaussures à usage
sol personnel unique
Toutes les Contrôle microbiologique des produits, du matériel, et de
flores l’air ambiant des zones critiques

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ÉTUDE TECHNIQUE

1.4.2. Les pathogènes et leurs effets


Dans le Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire de l’institut de veille sanitaire n° 51-52 du
26 décembre 2006, seulement 58 cas d’infections alimentaires collectives entre 1996 et 2005
ont pu être attribuées à la consommation de boissons, le plus souvent (33 cas) l’eau de
distribution en est la cause. Le plus souvent, la contamination de cette eau résulte d’un bref
dysfonctionnement du système de traitement ou d’une désinfection insuffisante (par exemple
par saturation des installations lors de fortes pluies). Aucun cas dû à la contamination d’eau
embouteillée n’est cité depuis plusieurs décennies en Europe.

Les microorganismes pathogènes responsables d’infections d’origine hydrique sont très


nombreux et de nature variée : on trouve des bactéries, des virus mais aussi des protozoaires.
Nous nous limiterons à citer les plus courants :
● Parmi les bactéries : les Salmonelles, Yersinia enterocolitica, les Shigella, les
Vibrio, EPEC.
● Parmi les virus : le virus de l’hépatite A, les rotavirus, les adenovirus, et le virus de
Norwalk.
● Parmi les parasites : les cryptosporidies, les Giardia et des helminthes.

Tableau 3 : caractéristiques de quelques pathogènes responsables de gastro-entérites


d’origine hydrique
Micro- Salmonella EPEC Hépatite A Rotavirus Giardia
organismes spp intestinalis
Type de bactérie bactérie Virus virus protozoaire
micro-
organisme
Dose 100-1 000 109 bactéries 10-100 virions inconnue 1 à 10 kystes
infectieuse organismes chez l’adulte
Résistance Plusieurs mois Plusieurs mois Plusieurs mois Plusieurs mois 3 mois
dans l’eau
Réservoir Humain, Humain et Humain humain Humain,
animaux autres animaux
sauvages et mammifères sauvages et
domestiques domestiques
Incubation 12 à 36 H 12-72 H 28 à 30 jours 24 à 72 H 7 à 10 jours
moyenne
Public touché nourrissons et Nourrissons de nourrissons et Nourrissons de nourrissons et
jeunes enfants moins de 1 an jeunes enfants moins de 1 an jeunes enfants
Pathogénicité gastro-entérite affection fièvre, fièvre et apparition
aiguë : intestinale sensation de vomissements, subite de
douleurs accompagnée malaise, suivis d'une diarrhées
abdominales, de diarrhée d'anorexie, de diarrhée nauséabondes,
diarrhée, liquide, de nausées et de aqueuse, graisseuses
nausées et fièvre, de gêne parfois accompagnées
vomissements; crampes et de abdominale associée à une de crampes
la vomissements, suivies après déshydratation abdominales,
déshydratation selles quelques jours sévère et létale de
peut être grave sanguinolentes d'un ictère chez l'enfant ballonnements,
chez les dans certains anorexie et
nourrissons et cas, maladie nausées. Pas
les personnes grave chez les de fièvre.
âgées nourrissons

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ÉTUDE TECHNIQUE

Malgré leur nature extrêmement différente, les agents pathogènes partagent (ainsi que les
infections qu’ils causent) plusieurs caractéristiques (voir tableau 3).
Ils sont résistants et peuvent survivre plusieurs mois dans l’eau et conserver leur potentiel
pathogène. Ils induisent après ingestion des symptômes gastro-intestinaux tels que diarrhées
et/ou vomissements. La gravité de l’infection est variable selon la quantité de pathogènes
ingérée, selon sa virulence, et selon l’état physiologique de la personne infectée. La plupart
sont des pathogènes opportunistes ou causent des infections asymptomatiques ou sans gravité.
Cependant, chez les personnes âgées, immunodéprimées et les jeunes enfants la maladie peut
être grave, voire fatale. Quelques uns sont aussi des pathogènes stricts, comme Salmonella ou
Vibrio.
Leur mode de transmission (oro-fécal) est le même : les aliments ou l'eau sont contaminés par
les matières fécales de personnes ou d’animaux infectés ou porteurs sains (les porteurs sains
de Salmonella peuvent éliminer de l’ordre de 107 Salmonelles/g de selles toute leur vie). Si
l’homme est le seul réservoir, la prévention est plus simple. Le traitement de l’eau pour
éliminer les microorganismes et l’hygiène individuelle (lavage des mains avant toute
manipulation d’aliments, lavage des fruits et légumes crus, …) peuvent permettre d’éradiquer
le pathogène. Par exemple, le choléra et la dysenterie bactérienne ne causent plus d’épidémies
en Europe et en Amérique du nord depuis la mise en place des systèmes de traitement de l’eau
de distribution. Le problème est plus délicat si le pathogène est présent chez des animaux
domestiques ou sauvages. L’éradication est alors impossible et le risque de contamination
fécale par ces réservoirs est plus fréquent. Cependant, grâce aux mesures préventives, les cas
d’intoxications alimentaires d’origine hydrique sont extrêmement rares (58 cas en 10 ans en
France).

2. Les analyses effectuées


2.1. Le site de production
Le forage permet de pomper l’eau directement dans la nappe (50 ou 70m de profondeur) et
cela avec un débit fixé par les autorités afin de ne pas dépasser la capacité de renouvellement
de la source. Cette eau est riche en minéraux et nécessite une filtration pour éliminer le fer et
le manganèse qui donnent un goût ferrugineux très prononcé à l’eau et peuvent être toxiques
aux concentrations initiales.

L’eau pompée est stockée dans une première cuve, permettant le fonctionnement des chaînes
d’embouteillage même si le pompage doit être arrêté pour des opérations de maintenance.
Cette eau est ensuite traitée. De l’ozone y est injectée pour oxyder le fer et le manganèse qui
forment des particules de décantation, ces particules sont ensuite éliminées par filtration.
L’eau déferrisée est stockée dans une deuxième cuve permettant aussi de faire une réserve
d’eau prête à être embouteillée.

En parallèle, les bouteilles sont préparées dans la salle de soufflage. Des préformes en PET
passent dans une machine où elles sont chauffées puis soufflées dans un moule afin d’obtenir
la forme de la bouteille. Le soufflage est effectué dans une salle blanche, car les bouteilles
doivent être exemptes de microorganismes. Les accès sont tous équipés d’un pédiluve et d’un
poste de lavage des mains. Le personnel ne peut entrer que s’il porte une charlotte et des
surchaussures. L’intervention dans les machines nécessite en plus le port d’un masque. Les
bouteilles sont ensuite transportées jusqu’à la salle de soutirage par un rail protégé par un flux
laminaire.

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ÉTUDE TECHNIQUE

Figure 2 : organisation schématique de la chaîne d’embouteillage

La salle d’embouteillage est également une salle blanche. L’eau y est distribuée dans les
bouteilles qui sont immédiatement bouchées. Cette étape peut être précédée d’une adjonction
de CO2 pour obtenir de l’eau gazeuse. La soutireuse est un point sensible car c’est le seul
endroit où l’eau sort des canalisations et peut donc être contaminée par les opérateurs, l’air
ambiant ou les machines. Ces machines sont dans une enceinte close et sous flux laminaire
(voir figure 3). Les bouteilles sont ensuite étiquetées et le code produit, la date et l’heure
d’embouteillage, ainsi que la DLUO y sont gravés.
Le produit fini quitte ensuite les salles blanches pour une zone moins critique où les bouteilles
sont assemblées en pack, puis en palettes, avant d’être déplacées dans une zone de stockage.

Le site comprend deux forages et trois lignes d’embouteillage (le schéma a été simplifié et ne
comporte qu’un forage et une ligne d’embouteillage) qui peuvent fonctionner en parallèle de
manière continue pendant toute la semaine, grâce à des équipes d’opérateurs travaillant en
3x8H. Lorsque les lignes fonctionnent au maximum de leur capacité, elles produisent environ
20000 bouteilles de 1,5 L ou 2L par heure pour les deux premières lignes et environ 60000
bouteilles de 0,5L par heure pour la troisième.

A la fin de chaque semaine de production, l’usine est intégralement nettoyée, en particulier les
salles blanches dont les machines sont désinfectées au canon à mousse.

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ÉTUDE TECHNIQUE

Figure 3 : Schéma de la zone d’embouteillage

2.2. Les points de contrôle


Des contrôles sont réalisés quotidiennement à tous les niveaux de la chaîne de production, de
la sortie de l'eau au forage, jusqu'au produit fini embouteillé. L'objectif de ces tests est de
s'assurer de la qualité de l'eau.
Deux types de tests sont pratiqués sur l'eau :
- le contrôle bactériologique : teste la présence de micro-organismes et vérifie l'absence de
contaminants ;
- le contrôle physico-chimique : analyse la composition de l'eau en certains minéraux au
niveau du forage et après filtration.

Il faut aussi vérifier les matières premières, soit l'ensemble des éléments qui entrent dans la
composition de la bouteille comme les matériaux en contact avec l'eau (bouchons,
plastique…) ainsi que la qualité du produit final : niveau de remplissage, étiquette bien collée,
DLUO lisible, couple de vissage des bouchons, pression de CO2, …. Le produit fini est
contrôlé lors du démarrage de la ligne de production, puis à chaque changement d’équipe soit
toutes les 8 heures. Des prélèvements de surface sont effectués dans la soutireuse pour vérifier
si la désinfection a été efficace.
Sur la figure 2, les points de prélèvement de l’eau sont marqués par les flèches rouges
(analyses microbiologiques) et violettes (analyses physico-chimiques). Sur la figure 3, les
prélèvements de matières premières et les prélèvements de surface sont indiqués
respectivement par les flèches vertes et oranges.

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ÉTUDE TECHNIQUE

2.3. Les techniques d’analyse


2.3.1. Types d'analyse
Trois niveaux d’analyses bactériologiques de l’eau sont définis : analyse réduite, analyse
sommaire et analyse complète (voir tableau ci-dessous).

Tableau 4 : les 3 types d’analyses microbiologiques effectuées sur l’eau potable


Analyses bactériologiques
Réduite (type B1) Sommaire (type B2) Complète (B3)
Coliformes thermotolérants Coliformes thermotolérants Coliformes thermotolérants
Entérocoques Entérocoques Entérocoques
Dénombrement des bactéries Dénombrement des bactéries
aérobies revivifiables à 22°C et aérobies revivifiables à 22°C et
à 37°C à 37°C
Spores de bactéries anaérobies
sulfito-réductrices

En suivi de production d’eau embouteillée, seule l’analyse sommaire est requise. Le produit
fini devrait subir une analyse complète. Dans l’usine, une analyse de type B2, une recherche
de Pseudomonas aeruginosa ainsi qu’un dénombrement des moisissures et levures sont
réalisés quotidiennement sur les produits finis et dans les cuves de stockage de l’eau après
traitement. Ces deux dernières analyses ne sont pas obligatoires mais sont réalisées car l’usine
est très ancienne (elle date des années cinnquante) et quelques défauts de conception induisent
des contaminations récurrentes par les moisissures. De même, la recherche de Pseudomonas
aeruginosa est réalisée quotidiennement car cette bactérie peut former des biofilms dans les
canalisations.

La recherche des spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices n’est pas réalisée car le
laboratoire ne dispose pas d’étuve anaérobie pour les analyses par filtration et la technique
d’ensemencement en tubes demande beaucoup plus de temps. De plus, les anaérobies sulfito-
réducteurs sont des indicateurs de contamination fécale ancienne. Or la source est pure, donc
toute contamination fécale sera récente et sera très bien détectée par une recherche des autres
bactéries de la flore fécale (coliformes et entérocoques).

Une analyse microbiologique plus complète (prenant en compte tous les pathogènes et les
indicateurs de contamination fécale comme les spores de bactéries sulfito-réductrices, les
légionelles, …) et les analyses biochimiques complètes sont réalisées par un laboratoire gérant
toutes les sources du groupe une fois par mois. Une analyse trimestrielle est également
réalisée par un laboratoire indépendant agréé par l’état. La recherche de contaminants dans
l’atmosphère, sur les contenants (bouteilles et bouchons), sur les machines dans les salles
blanches (écouvillons), et sur les mains des opérateurs sont réalisées une fois par semaine. En
parallèle, chaque jour l’eau est analysée pour mesurer la concentration de quatre ions dont la
teneur est règlementée : fer, manganèse, ammonium et nitrites.

Ce travail a été réalisé en 2006, les normes d’analyse ont évolué depuis et les méthodes
d’échantillonnage et de contrôle microbiologique sont aujourd’hui fixées par le codex
alimentarius (CODEX STAN 108-1981) et dans le code d’usage international pour
l’exploitation et la commercialisation des eaux minérales naturelles (CCAC/RCP 33-1985).
Elles sont identiques pour l’eau de source. Elles sont présentées dans les annexes 2 et 3.

14
ÉTUDE TECHNIQUE

2.3.2. Prélèvement des échantillons


Pour tous les prélèvements destinés à une analyse microbiologique, le port du masque et de la
charlotte est requis, un lavage des mains est également nécessaire. Les échantillons sont
prélevés le matin et analysés l’après midi.
Les prélèvements d’eau se font en flacon de plastique stérile de 1 L. Le prélèvement doit être
réalisé en conditions stériles également pour ne pas fausser les résultats. Un certain nombre de
robinets de prélèvement sont répartis sur les canalisations de l’usine pour contrôler la qualité
de l’eau tout au long de son trajet (voir figure 2).
Le robinet est aspergé d’éthanol, flambé, puis porté au rouge à l’aide d’un chalumeau
portable. Le chalumeau allumé est maintenu à côté du robinet pour créer une zone de stérilité.
Le robinet est ouvert, il faut laisser couler l’eau quelques secondes pour refroidir le robinet.
Le flacon stérile est ouvert, rempli, puis refermé toujours dans la zone de stérilité.

Pour les prélèvements de surface, on utilise des écouvillons en tube contenant un milieu de
culture stérile. Le dispositif d’écouvillonnage est ouvert rapidement, frotté sur la surface à
analyser et refermé immédiatement. Le prélèvement n’est pas réalisé en conditions de
stérilité, mais les machines sont toutes sous flux laminaire et l’atmosphère doit y être très peu
contaminée. Chaque prélèvement est réalisé en double.
L’analyse de l’ambiance consiste à rechercher la présence de levures et moisissures dans
l’atmosphère des salles d’embouteillage, de soufflage et dans la salle des bouchons. Une boîte
de Pétri de 12,5 cm de diamètre est ouverte et disposée en hauteur dans la salle pendant une
heure. Elle est ensuite fermée, retournée et incubée 48 heures à 22°C.
Le contrôle de l’hygiène des mains du personnel est réalisé par apposition des doigts sur le
milieu de culture en boîtes de Pétri. Sur une main sont recherchés les entérocoques et sur
l’autre les coliformes thermotolérants.

2.3.3. Analyse microbiologique des échantillons

Filtration sur membrane


Un volume important d'eau est aseptiquement filtré sur une membrane qui retient les germes
contenus dans l'eau. La membrane est ensuite aseptiquement transférée sur une boîte de Pétri
contenant un milieu nutritif sur lequel cultivent les germes retenus sur la membrane. Après
incubation, les UFC (unités formants colonies) sont comptées pour évaluer la qualité
microbiologique de l'eau. Selon le milieu de culture (sélectif) où est déposé le filtre, on met en
évidence la présence de différents microorganismes. C’est de plus une méthode avantageuse
car rapide et peu coûteuse.

Matériel
Figure 4 :
appareillage
de filtration
de l’eau
(photo
matériel
Sartorius)

15
ÉTUDE TECHNIQUE

La filtration est réalisée sur une rampe de filtration sous vide contenant trois systèmes de
filtration afin de gagner du temps lors de la réalisation des analyses (trois échantillons sont
filtrés en même temps). Voir figure 4

Mode opératoire
1) Stériliser le dispositif, en versant de l’éthanol dans l’entonnoir, flamber au bec bunsen.
Rincer à l’eau distillée stérile pour enlever les dernières traces d’éthanol et refroidir le
dispositif.
2) Enlever l’entonnoir, placer la membrane stérile (Sartorius, acétate de cellulose) quadrillage
vers le haut bien centrée sur le fritté grâce à une pince préalablement flambée puis refroidie,
remettre l’entonnoir.
3) Verser l’échantillon à analyser jusqu’au repère (graduation de volume). Ouvrir la vanne à
vide. Quand le filtre paraît sec, casser le vide et enlever l’entonnoir.
4) Enlever la membrane et la déposer sur une boîte de Pétri de 5 cm de diamètre contenant le
milieu de culture adéquat, quadrillage vers le haut. Faire attention à ce qu’il n’y ait pas de
bulles d’air pour que toute la membrane soit au contact du milieu de culture. Les boîtes sont
retournées et incubées le temps nécessaire (voir tableau 5).
L’analyse d’un même échantillon (six boîtes de Pétri sont réalisées) ne nécessite pas de
stériliser le dispositif de filtration entre chaque filtration.

Tableau 5 : Milieux de culture et incubation pour les analyses microbiologiques réalisées


dans l’usine
Micro-organismes Méthode utilisée Volume Milieu de Incubation
recherchés d’eau filtré culture
Coliformes Filtration sur 250 mL Tergitol TTC 48H à 44°C
thermotolérants membrane (0,45µm
de porosité)
Entérocoques Filtration sur 250 mL Slanetz TTC 48H à 37°C
membrane (0,45µm
de porosité)
Pseudomonas Filtration sur 250 mL Cétrimide 48H à 37°C
aeruginosa membrane (0,45µm
de porosité)
Micro-organismes Filtration sur 100 mL PCA 72H à 22°C
revivifiables (l) à membrane (0,45µm
22°C de porosité)
Micro-organismes Filtration sur 100 mL PCA 48H à 37°C
revivifiables (l) à membrane (0,45µm
37°C de porosité)
Moisissures et Filtration sur 100 mL Sabouraud 72H à 22°C
levures membrane (0,8µm
de porosité)
(1) Bactéries, levures et moisissures se développant en aérobiose dans les conditions opératoires.

Le produit fini et les échantillons d’eau prélevés en différents points de la production


subissent toutes les analyses présentées dans le tableau 5. L’analyse des consommables
(bouteilles et bouchons) est réalisée de la façon suivante. Pour les bouteilles, on les remplit
avec environ 250 mL d’eau distillée stérile, on les bouche avec des bouchons préalablement
stérilisés dans de l’éthanol puis séchés. La bouteille est bien agitée, puis l’eau est filtrée. Pour
les bouchons, on en dispose cinq dans un pot de plastique stérile, on ajoute 100 mL d’eau

16
ÉTUDE TECHNIQUE

stérile environ. Le flacon est bien agité puis l’eau est filtrée. Pour le contrôle de l’hygiène des
mains du personnel et les prélèvements de surface, seuls les flores indicatrices de la présence
de pathogènes sont recherchées (entérocoques et coliformes thermotolérants). Dans ce dernier
cas, le milieu de culture contenu dans le tube de l’écouvillon est bien homogénéisé, puis versé
sur le filtre avec le même mode opératoire.

Milieux de culture
La composition des milieux de culture est présentée en annexe 4.

PCA :
Principe : La gélose P.C.A. Standard dénombrement, encore appelée « Plate Count Agar »,
est utilisée pour le dénombrement des germes aérobies totaux dans le lait, les eaux, les
viandes, les produits à base de viande, les autres produits alimentaires, ainsi que pour
l'analyse des produits pharmaceutiques, des produits cosmétiques et de leur matière
premières.
Lecture : Chaque colonie est considérée comme ayant été engendrée par une bactérie.
Dénombrer sur les boîtes de Pétri présentant entre 30 et 300 UFC. Pour l’analyse de l’eau, la
flore se développant à 20°C doit être plus importante que la flore se développant à 37°C.

Tergitol 7 TTC :
Principe : la gélose lactosée au T.T.C. et Tergitol 7 est utilisée pour les recherches et
dénombrements des coliformes et coliformes thermotolérants des eaux par la méthode des
membranes filtrantes.
Le Tergitol 7 inhibe la pousse des germes à gram positif, réduit l'envahissement du milieu par
les Protéus et favorise le recouvrement des coliformes.
Autre additif, le T.T.C est réduit très rapidement par la majorité des bactéries coliformes et
forme un formazan de couleur rose ou rouge.
Enfin, les micro-organismes capables de fermenter le lactose présent dans le milieu, donnent
des colonies cernées de halos jaunes, coloration due au virage de l'indicateur de pH, le bleu de
bromothymol.
Lecture : colonies bleues ou vertes : lactose -, colonies jaunes : lactose +. La réduction du
TTC en composé rouge est faible avec Escherichia coli et Enterobacter aerogenes qui
donnent donc des colonies jaunes alors que celles des autres coliformes seront rose-rouges et
entourées d'un halo jaune. Une colonie avec un halo jaune est identifiée par galerie Api 20E.

Slanetz et Bartley :
Principe : la gélose de Slanetz est un milieu solide qui permet la recherche et le
dénombrement des entérocoques dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.
Lecture : Les Enterococcus donnent des colonies moyennes roses ou rouges. Une
confirmation d’identification est réalisée par ensemencement d’une gélose BEA incubée 4H à
44°C.

Cétrimide :
Principe : la gélose au cétrimide est utilisée pour l’isolement sélectif et l’identification
présomptive de Pseudomonas aeruginosa. Sur ce milieu de très nombreuses bactéries sont
inhibées de par la présence de l'antiseptique cétrimide (bromure de N-cétyl-N, N, N-
triméthylammonium), ainsi que par la présence de l'antibiotique acide nalidixique (inhibiteur
de nombreuses bactéries à Gram négatif). Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi
la production de pigments par P. aeruginosa.

17
ÉTUDE TECHNIQUE

Lecture : l'obtention de colonies présentant une pigmentation caractéristique bleue ou bleue-


verte et une fluorescence sous rayonnements ultra-violet à 254 nm oriente vers Pseudomonas
aeruginosa. Les colonies suspectes sont identifiées par une galerie Api 20NE.

Sabouraud :
Principe : La gélose Sabouraud est un milieu d'utilisation générale, permettant la croissance et
l’isolement d'une grande variété de levures et moisissures. Il est additionné de chloramphénicol
pour inhiber la croissance des bactéries Gram positif et Gram négatif. Il permet l’isolement
sélectif des levures et moisissures dans un produit contenant des bactéries.
Lecture : Chaque colonie ou thalle est considéré comme ayant été engendré par une levure ou
une moisissure.

2.3.4. Analyse physico-chimique des échantillons


Le dosage des ions ammonium, nitrites, fer et manganèse se font par colorimétrie grâce à des
kits. La réalisation nécessite peu de matériel et est rapide de mise en œuvre pour un coût
relativement réduit.

Dosage des ions ammonium (annexe 5)


Le principe est la réaction de Berthelot. L’ammonium est déplacé en ammoniaque en milieu
alcalin. Il réagit ensuite avec de l’hypochlorite pour former une monochloramine. Cette
dernière se condense avec deux molécules de thymol pour donner le bleu d’indophénol. La
réaction nécessite un catalyseur pour accroître la sensibilité du dosage. L’absorbance est
mesurée à 625nm. La concentration maximale autorisée est de 0,1 mg d’ammonium par litre.
NH3 + 3ClO- + 2C6H5O- → O=C6H4=N-C6H4O- + 2H2O + OH- + 3Cl-

Dosage du fer (annexe 6)


On utilise la méthode à l’acide thioglycolique. En milieu alcalin, le fer ferreux se complexe
avec le thioglycolate et donne une coloration rouge. L’absorbance est mesurée à 530nm
contre un témoin réalisé avec de l’eau distillée. La concentration maximale autorisée est de
0,2 mg de fer par litre.
Fe2+ + 2 SH-CH2-COOH → Fe (S-CH2-COOH)2

Dosages des ions manganèse (annexe 7)


On utilise la méthode à la Formaldoxime. L’addition d’une solution de Formaldoxime à une
prise d’essai puis la mesure spectrométrique du complexe rouge orangé obtenu à une longueur
d’onde d’environ 450 nm contre un témoin réalisé avec de l’eau distillée permet d’estimer la
concentration en manganèse de l’eau. La concentration maximale autorisée est de 0,5 mg de
manganèse par litre.

Dosage des nitrites, méthode de Shinn normalisée ISO 6777 (annexe 8)


Les nitrites réagissent avec le Sulfanilamide en milieu acide pour former un composé
diazoïque. Ce composé est ensuite couplé à une amine aromatique (N1
Naphtyléthylènediamine) pour donner un colorant azoïque rose. L’absorbance est mesurée à
543nm contre un témoin réalisé avec de l’eau distillée. La concentration maximale autorisée
est de 0,1 mg de nitrites par litre.

1) NH2SO2C6H4-NH2 + NO2- + 2 H+ → (NH2SO2C6H4-N≡N)+ + 2 H2O


2) (NH2SO2C6H4-N≡N)+ + C10H7-NH-(CH2)2-NH2 →
NH2SO2C6H4-N=N-C10H6-NH-(CH2)2-NH2 + H+

18
ÉTUDE TECHNIQUE

2.4. Exemples de résultats et conséquences sur l’exploitation


Le suivi journalier des paramètres microbiologiques et biochimiques permet de produire une
eau répondant à tous les critères de qualité, en adaptant certaines opérations (nettoyage,
maintenance) aux besoins de la production. Par exemple, dans le tableau 6, on voit les
résultats obtenus pour une production normale.

Tableau 6 : exemples de résultats d’une journée de production


Analyse effectuée

thermotolérants

Moisissures et
revivifiables à

revivifiables à
Entérocoques

Pseudomonas

organismes

organismes
Coliformes

aeruginosa

levures
Micro-

Micro-
22°C

37°C

Fer
Forage
0/250mL 0/250mL 0/250mL 0/100mL 0/100mL 0/100mL 0,5 mg/L
Cuve de
110/100 40/100m 0,05
stockage 0/250mL 0/250mL 0/250mL 1/100mL
mL L mg/L
Produit fini
200/100 15/100m
au 0/250mL 0/250mL 0/250mL INC -
mL L
démarrage
Produit fini
200/100 120/100
en cours de 0/250mL 0/250mL 0/250mL 3/100mL -
mL mL
production
Soutireuse
0 0 - - - - -
Bouchons
Bouteilles 0 0 - - - - -

Ambiance 12
- - - - - -
colonies
Mains du
personnel 2 0 - - - - -

● On ne détecte pas de micro-organismes dans la matière première. L’eau prélevée au forage


est exempte de micro-organismes ce qui répond aux normes imposées par la réglementation
actuelle.

● Les concentrations en fer et manganèse sont suivies chaque jour. Dans le cas présenté, on
atteint la valeur limite de 0,05 mg/L, le nettoyage des filtres doit être programmé à la fin de la
semaine de production,

● Lors du passage dans les canalisations de l’usine, l’eau se charge en microorganismes


aérobies (110 UFC/100mL à 22°C dans la cuve de stockage puis plus de 300 UFC/100 mL à
22°C dans une bouteille en début de production). Elle acquiert une flore principalement
constituée de bactéries psychrophiles car l’eau circulante est à une dizaine de degrés
maximum. La flore revivifiable à 22°C est donc toujours supérieure à la flore revivifiable à

19
ÉTUDE TECHNIQUE

37°C. Si ce n’est pas le cas, ce peut être le signe d’une contamination fécale. Les résultats
obtenus pour la flore fécale et les pathogènes doivent toujours être négatifs.

● Au cours de la production, les canalisations sont rincées par l’eau et la contamination


diminue (200 UFC/100 mL). Lors du démarrage de la chaîne de production, le niveau de
contamination est toujours un peu élevé, car la flore se développe dans l’eau qui stagne dans
les canalisations. Les premières bouteilles fabriquées sont donc éliminées à chaque
démarrage, ce qui équivaut à un rinçage de la ligne. Comme l’usine fonctionne toute la
semaine (3x8H) et qu’on prélève l’eau à chaque changement d’équipe, on suit la décroissance
progressive de la flore aérobie totale.
On peut noter que la flore aérobie totale dénombrée est très en dessous de la valeur maximale
autorisée (par exemple ici 200 UFC/100mL quand il en faut moins de 100/mL). Une
augmentation de la flore aérobie peut donc être détectée sans pour autant atteindre les limites
réglementaires, et le nettoyage de la cuve ou de la canalisation peut être rapidement entrepris
sans nécessiter un arrêt de production qui est toujours coûteux.
Par exemple, au cours des quatre mois, une augmentation importante de la flore aérobie totale
a été détectée dans une cuve de stockage. L’eau a été dérivée vers une autre cuve
temporairement, et en fin de semaine, lors du nettoyage de fin de production, cette cuve a été
désinfectée ce qui a permis de retrouver des valeurs plus acceptables la semaine suivante.

● Le contrôle de l’atmosphère donne 12 levures ou moisissures dénombrées après une


exposition d’une heure. Ce résultat est correct, c’est le signe que le nettoyage précédent a été
bien effectué.

● Les contrôles de surface dans les machines ne doivent montrer aucune UFC. Si c’était le
cas, la production serait immédiatement arrêtée pour lancer une désinfection complète car le
risque de contamination du produit serait bien trop élevé.

● L’analyse de la flore sur les mains du personnel permet de vérifier le respect des consignes
d’hygiène. Le résultat obtenu ici est correct, c’est aussi l’occasion de faire un rappel des
consignes au personnel intervenant aux points critiques de l’embouteillage.

En conclusion, on peut noter que toutes les précautions prises lors de la production portent
leurs fruits puisqu’aucun incident n’a eu lieu dans l’usine depuis plusieurs années. Le contrôle
aux différentes étapes de l’embouteillage assure une réaction rapide en cas de problème et
permet d’améliorer les procédés de fabrication en identifiant les éventuels points critiques.

20
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

21
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

1. Introduction
Les techniques utilisées principalement lors de cette expérience professionnelle sont d’une
part l’analyse microbiologique d’eau par filtration, et d’autre part l’analyse de
l’environnement de production par des prélèvements de surface. Elles correspondent
parfaitement aux enseignements en lycée technologique et ne nécessitent pas de matériel
particulier ou coûteux que les lycées ne pourraient se fournir. Elle est de plus au programme
de plusieurs cursus. Cette séquence est donc parfaitement adaptable à plusieurs niveaux aussi
bien en seconde en enseignement d’exploration de biotechnologies qu’en terminale STL-BGB
ou dans certaines sections de technicien supérieur.
La transposition de cette expérience professionnelle peut être utilisée pour susciter un intérêt
particulier de l’élève en lui montrant une application réelle dans la vie professionnelle de ses
apprentissages en travaux pratiques. De plus, cette activité permet d’intégrer l’analyse d’un
produit alimentaire et les prélèvements de surface en montrant leurs liens dans la pratique
industrielle. Cela permet également aux élèves d’appréhender le travail en industries
agroalimentaires et les aider à faire leur choix d’orientation post-baccalauréat puisqu’ils
voient lors des travaux pratiques des applications correspondant aux différents métiers qu’ils
seront susceptibles d’exercer par la suite.

2. Présentation des différents niveaux d’exploitation


possibles
2.1 Application en enseignement d’exploration en classe de
seconde
Les anciens programmes de l’option BLP en seconde générale sont actuellement modifiés
dans le cadre de la réforme du Lycée. Il est mis en place pour la rentrée 2010 un enseignement
technologique d’exploration en biotechnologies dont le programme est paru au BO n°4 du 29
avril 2010.
La vocation de cet enseignement est de permettre aux élèves de tester leurs goûts et leurs
aptitudes en vue de l'orientation vers une série de première déterminée. Il s’agit donc de leur
montrer les domaines d’application dans la vie professionnelle des activités qu’ils réalisent.
On peut par exemple envisager d’adapter ce travail à la partie environnement du programme
sur trois points différents.
Tout d’abord on peut décrire les contrôles de surface en utilisant deux techniques (écouvillon
et gélose contact). Cela permet d’aborder les notions de flores de l’environnement et de
visualiser directement leur diversité par des observations microscopiques et macroscopiques
après isolement.
Il est également possible de réaliser un contrôle microbiologique sur une eau de rivière en
recherchant la flore témoin de contamination fécale. On pourra alors aborder les conséquences
de cette pollution sur la santé.
Enfin on peut utiliser un échantillon d’eau pour ensemencer différents milieux de culture
sélectifs et non sélectifs. Dans ce cas, on peut réaliser un dénombrement de la flore totale et
de la flore potentiellement pathogène en utilisant plusieurs milieux de culture différents : une
gélose ordinaire non sélective, une gélose BEA et une gélose EMB. Les micro-organismes
isolés sur ces milieux peuvent ensuite être observés au microscope à l’état frais et après
coloration de Gram pour les préidentifier. Un dénombrement est ensuite réalisé puis comparé
à une valeur de référence pour aborder la notion de norme. Dans tous les cas, l’utilisation de

22
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

ce travail en seconde demande une adaptation importante des techniques et des milieux
utilisés.

2.2 Application en biochimie en classe de première STL-BGB


Lors de ce travail, des analyses biochimiques sur l’eau ont également été réalisées. L’analyse
biochimique de l’eau est au programme de travaux pratiques de biochimie en terminale STL.
Les élèves doivent réaliser le dosage du phosphore, des nitrates et des nitrites. Le dosage des
nitrites est réalisé par la méthode utilisée au laboratoire, c’est un dosage colorimétrique par le
sulfanilamide. L’analyse d’une eau peut être réalisée avec préparation en parallèle d’une
gamme étalon à partir d’une solution de concentration connue.
Cette application correspond bien au programme mais elle ne représente qu’une partie minime
du travail réalisé pendant ces quatre mois, j’ai préféré adapter l’analyse microbiologique.

2.3 Application en microbiologie en classe de terminale STL-BGB


La correspondance est plus importante avec les attendus de la formation en microbiologie en
terminale STL-BGB, c’est pourquoi ce niveau a été choisi pour développer une séance de TP.
Elle sera présentée en détail dans la partie 3.

2.4 Application en microbiologie en STS


L’analyse microbiologique telle qu’elle est développée pour les terminales STL peut
également être proposée à différentes classes de STS, par exemple en BAC. Les élèves ne
doivent pas réaliser l’analyse complète de tous les aliments, le but est qu’ils aient un aperçu
de toutes les techniques d’analyse.
Une application un peu différente pourrait être proposée en STS QIABI. Le BTS obtenu
permet d’occuper des fonctions qui concourent à la réalisation de l’objectif qualité : assistant
qualité, responsable qualité, technicien dans des entreprises agroalimentaires, cosmétiques, et
dans les laboratoires de contrôle. Il vérifie les matières premières, les éléments de
conditionnement, contrôle l’application des procédés, propose des actions correctrices après
avoir identifié les causes de non-conformité, vérifie le niveau de qualité des produits, défini

23
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

les mesures à effectuer et leur fréquence. Dans le programme de techniques microbiologiques,


deux points correspondent au travail d’analyse effectué en usine.

4. Contrôles microbiologiques - Les études méthodologiques conduites précédemment


de bioproduits selon les normes seront appliquées à l’analyse complète d’un produit solide
en vigueur homogène et hétérogène et d’un produit liquide : flore
- Prélèvement, échantillonnage, totale, coliformes, streptocoques fécaux, anaérobies sulfito-
préparation de l’échantillon, réducteurs, Salmonella, Staphylocoques et autres
étude des dilutions limites, recherches particulières aux produits choisis.
discussion des milieux sélectifs,
analyse et interprétation des
résultats Différentes techniques seront mises en œuvre : cellophane
adhésive test, boîtes contact, technique Pétrifilm,
5. Hygiène des milieux de écouvillonnage.
travail et du personnel On pourra pratiquer une analyse de l’air des locaux.
- Contrôle de pollution des On mettra en évidence l’importance du lavage des mains
locaux et du matériel par l’analyse comparée de la flore cutanée avant et après
- Hygiène du personnel lavage des mains selon les procédures définies. On
soulignera l’importance de la recherche de porteurs
asymptomatiques (Staphylocoques, Salmonella)

Dans ce cas, les élèves doivent réaliser une analyse complète du produit, c'est-à-dire
rechercher l’ensemble des bactéries pour lesquelles une valeur limite est donnée dans la
réglementation, ce qui peut être réalisé lors d’une séance de travaux pratiques.
L’analyse de la pollution de l’environnement par les différentes techniques utilisées en
laboratoire peut être l’objet d’une autre séance de TP, en y ajoutant la recherche de la flore
cutanée avant et après lavage des mains (simple, antiseptique, chirurgical).

3. Présentation de la séquence détaillée


3.1 Modalités d’enseignement
Les travaux pratiques de microbiologie en terminale sont organisés en deux séances de deux
heures par semaine, à un ou deux jours d’intervalle pour permettre la croissance des micro-
organismes étudiés. Le premier jour permet de présenter le sujet étudié, les nouvelles
techniques, et de réaliser les ensemencements. Le deuxième jour est consacré à la lecture des
milieux de culture et à l’interprétation des résultats et à la rédaction d’un compte-rendu. Les
élèves sont en groupe d’atelier de 15 élèves au maximum.

3.2 Contenu du programme concerné


Le programme de TP microbiologie en terminale STL BGB se découpe en 4 parties
principales : la mycologie (3 semaines), les techniques d’analyse en microbiologie médicale
(12 semaines), les techniques d’analyses et de contrôle dans les industries alimentaires et
pharmaceutiques (12 semaines), et les techniques de production industrielle (3 semaines).
La troisième partie qui nous concerne plus particulièrement dans le cadre de ce travail est
présentée comme suit :

24
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

2.2 Dans les industries


agro-alimentaires:
contrôles d'hygiène
2.2.1 Méthodologie
générale: techniques de
dénombrement, choix Réaliser tout ou partie de l'analyse bactériologique d'une eau, et/ou
des milieux, expression du lait, et/ou d'un produit laitier, et/ou d'un plat cuisiné à l'avance
et interprétation des selon les protocoles imposés par la réglementation
résultats. Réaliser par une technique d'écouvillonnage ou avec une boîte
2.2.2 Contrôles au contact, un dénombrement de la microflore totale d'une surface
niveau de la Justifier les temps opératoires, les modes de calcul et d'expression
production: des résultats.
Contrôles alimentaires
analyse bactériologique
des eaux, et/ou du lait,
et produit laitier, et/ou
de plats cuisinés à
l'avance
2.2.3 Contrôles au
niveau des locaux-
dénombrement des
micro-organismes
totaux sur une surface
inerte

L’analyse de l’eau par filtration peut être facilement réalisée en lycée technologique. Le
matériel est présent dans tous les lycées. De même, la recherche de la flore de surface par
différentes techniques est au programme des terminales STL-BGB, ainsi que les différentes
techniques de dénombrement dans les aliments.

3.3 Objectifs de la séquence et prérequis


L’objectif principal de la séquence est l’apprentissage d’une nouvelle technique d’analyse
microbiologique utilisée en industries agroalimentaires et pharmaceutiques. Cette technique
est l’analyse de liquides par la méthode de la filtration. Les élèves doivent avoir intégré les
quatre principaux aspects de cette méthode à la fin de la séance : la réalisation technique, la
principale différence avec les autres méthodes de dénombrement déjà vues, les applications
possibles (types d’échantillon analysés), et l’expression du résultat et sa comparaison à une
norme.

Cette séquence permet également de consolider les acquis en réalisant plusieurs rappels sur :
- les autres méthodes de dénombrement qui ont déjà été utilisées,
- la nature des flores recherchées dans les aliments, en particulier la flore fécale et la
flore totale qui sont des témoins de contamination,
- les moyens de sélectionner ces populations par les conditions opératoires et les
milieux de culture,
- l’utilisation des prélèvements de surface,
- le calcul et l’expression des résultats d’un dénombrement,
- la vérification qu’un produit répond aux normes demandées.

25
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

L’intégration de toutes ces données doit leur permettre d’analyser correctement les résultats
obtenus.

En conséquence, ce TP doit être réalisé après plusieurs autres consacrés à l’analyse en agro-
alimentaire :
- numération par la méthode NPP des coliformes totaux en milieu liquide, et réalisation de test
complémentaire d’identification d’E. coli par le test de Mackensie,
- numération des coliformes totaux d’un lait par technique de la double couche sur gélose au
désoxycholates,
- recherche de spores de Clostridium sulfito-réducteurs dans une eau contaminée (type eau de
mare),
- recherche de Staphylococcus aureus dans un lait sur le milieu de Baird Parker, confirmation
par une agglutination,
- utilisation des différentes techniques d’analyse de la flore de surface (écouvillonnage, boîte
contact).
Il sera donc réalisé vers la fin de l’année scolaire.

3.4 Préparation préalable


3.4.1 Par le professeur
Ce travail datant de 2006, son utilisation a nécessité la recherche de plusieurs documents. Il
m’a fallu en particulier remettre à jour les connaissances sur les normes actuelles en
agroalimentaire de l’analyse de l’eau, les procédés utilisés, les plans d’échantillonnage car il
est précisé dans le programme que les analyses sont réalisées selon les protocoles imposés par
la réglementation.

Ensuite, j’ai recherché les ressources disponibles sur le site internet Éducnet dans la base de
données ÉDU’bases Biotechnologies et ST2S. Un document est disponible sur la technique de
filtration, un diaporama présentant la technique (fiche n°161, http://www.ac-
montpellier.fr/Pedagogie/Disciplines/sti/biotechn/microbio.html). Un lycée de Montpellier
met également à disposition deux petits films montrant un élève réalisant la dépose de la
membrane sur le dispositif de filtration puis la dépose de la membrane sur le milieu de culture
(http://www.lyc-lacroix-narbonne.ac-montpellier.fr/dossiers/dossiers.php?val=291_analyse+
microbiologique+eau). Il m’a finalement semblé qu’il était plus parlant de faire une
démonstration devant les élèves plutôt que de montrer un diaporama et un film dans lesquels
toutes les étapes ne sont pas présentées (stérilisation du dispositif, filtration).

La préparation des documents élèves a ensuite été réalisée. Les documents techniques fournis
aux élèves sont utilisés lors des TP suivants et leur permettent de garder une trace du travail
réalisé puisqu’ils n’ont pas de manuel scolaire disponible pour leur section. Trois documents
élèves leur seront fournis : un protocole (pages 27 et 28) pour diriger le travail de la séance et
deux fiches techniques, une sur la technique de filtration (page 29) et une sur les milieux de
culture utilisés (page 30).
Ces documents sont présentés sur les pages suivantes. Sur les fiches techniques, ce qui est à
remplir avec les élèves est noté en rouge.

26
TP : Contrôle de l’embouteillage d’une eau minérale

Une usine d’embouteillage d’eau minérale vous demande de contrôler son produit à deux
stades de la production :
- eau à l’émergence : échantillon 1
- produit fini : échantillon 2

Vous devez également contrôler les surfaces en différents points de l’usine :


- P1 : prélèvement dans le bac à bouchons
- P2 : prélèvement dans les bouteilles vides
- P3 : prélèvement sur les becs de la soutireuse
- P4 : prélèvement sur la visseuse

Limites de qualité des eaux embouteillées

Limites de
Paramètre Méthode de recherche Notes
qualité
Coliformes A l’émergence et au cours de la
0 / 250 mL Iso 9308/1
thermotolérants commercialisation
A l’émergence et au cours de la
Entérocoques 0 / 250 mL Iso 7899/2
commercialisation

Méthodes de recherche imposées par la réglementation :


Iso 9308/1 : Filtration sur membrane et culture sur gélose lactosée au tergitol et TTC
Iso 7899/2 : Filtration sur membrane et culture sur gélose de Slanetz et Bartley

27
1er jour :

• Étude des échantillons d’eau


Vous disposez par binôme de 2 échantillons de 500 mL d’eau à analyser par la technique de
filtration sur membrane (voir fiche technique). Pour chacun, vous devez rechercher les
entérocoques sur gélose Slanetz et les coliformes thermotolérants sur gélose lactosée au
tergitol 7 et TTC (voir fiche milieux).

• Étude des prélèvements de surface


Vous disposez par binôme de 4 prélèvements réalisés par écouvillonnage sur 10 cm2 de 4
surfaces différentes de la zone de production (2 mL d’eau peptonée). Vous devez les analyser
par la technique d’étalement en surface avec une pipette râteau sur une gélose ordinaire (étaler
0,1 mL).

2ème jour :

• Étude des échantillons d’eau


Lire les résultats obtenus. Présenter les résultats du binôme dans un tableau en exprimant les
résultats du dénombrement de manière adéquate.

• Étude des prélèvements de surface


Réaliser un état frais et une coloration de Gram à partir des colonies obtenues sur la GNO.
Réaliser le test d’orientation. Conclure.
Présenter les résultats du binôme dans un tableau. Exprimer les résultats du dénombrement de
surface en nombre de bactéries par cm2. Conclure.

Compte rendu

1er jour :
Réaliser un schéma récapitulatif des analyses réalisées.

2ème jour :
Proposer une hypothèse sur la provenance des contaminants.
Quelles seront les conséquences sur la production ?
Quelles mesures allez-vous prendre pour corriger ce problème ?
Par quels moyens peut-on éviter cette contamination ?

28
Fiche technique : la filtration sur membrane
Utilisation
Analyse de produits liquides peu concentrés en microorganismes : l’eau

Principe
Concentration des microorganismes par filtration sur une membrane

Méthode

1- brancher la trompe à vide et ouvrir l’eau.

2- Verser un peu d’éthanol sur le support. Ouvrir la


vanne pour évacuer l’excès d’éthanol.

3- Refroidir avec un peu d’eau stérile. Sécher en


ouvrant la vanne à vide.

4- déposer la membrane de filtration de 0,45µm.

5- réaliser la filtration de la totalité de l’échantillon.

6- rincer avec 20 mL d’eau stérile. Sécher la


membrane.

7- déposer la membrane sur le milieu sans faire de


bulles.

Points critiques

- Réaliser la filtration en zone de stérilité


- Ne pas déchirer la membrane qui est fragile
- Penser à stériliser le dispositif entre chaque échantillon filtré
- Attention au sens de la membrane lors du dépôt sur la boîte de Pétri

29
Gélose de SLANETZ

Formule : en g.L-1 Rôle des composants


Peptone 20 source de N de C et d’énergie
Extrait de levure 5 éléments nutritifs et facteurs de croissance
Glucose 2 source de C et d’énergie
Hydrogénophosphate de sodium 4 source complémentaire de sels minéraux
Azide de sodium 0,4 inhibiteur des Gram – et de nombreux Gram +
Agar 10 gélifiant
pH final : 7,2
Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter coloration rouge ou rose des colonies (réduction
10 mg de TTC avant de couler les boîtes. en un composé coloré)

Utilisation : la gélose de Slanetz est un milieu solide sélectif qui permet la recherche et le dénombrement des
entérocoques dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.

Lecture des résultats


Les Enterococcus donnent des colonies moyennes roses ou rouges. Les Bacillus peuvent aussi pousser sur ce
milieu mais donnent des colonies un peu plus grandes. Staphylococcus peut également pousser sur ce milieu.

Gélose lactosée au Tergitol 7 et TTC

Formule : en g.L-1 Rôle des composants


Peptone de viande 10 source de N de C et d’énergie
Extrait de levure 6 éléments nutritifs et facteurs de croissance
Extrait de viande 5 éléments nutritifs et facteurs de croissance
Lactose 20 source de C et d’énergie
Tergitol 7 0,01 inhibe la pousse des germes à gram positif et limite
l’envahissement par Proteus
Bleu de bromothymol 0,05 indicateur coloré de pH
Agar.............. 13 gélifiant
pH final : 7,2
Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter coloration rouge ou rose des colonies (réduction
25 mg de TTC avant de couler les boîtes. en un composé coloré)

Utilisation : la gélose lactosée au Tergitol 7 et TTC est un milieu solide sélectif qui permet la recherche et le
dénombrement des coliformes dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.

Lecture des résultats


colonies bleues ou vertes : lactose –
colonies jaunes : lactose + (coliformes)

30
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

3.4.2 Par le personnel technique


Une feuille de préparation est fournie aux agents de laboratoire plusieurs semaines avant le
TP car on utilise des milieux de culture spécifiques et des membranes de filtration qui devront
être commandés suffisamment à l’avance.

TP analyse de l’eau par filtration

Matériel nécessaire à la séance par binôme pour 28 élèves


Flacon de 500 mL d’eau distillée stérile (noté E1) 1 14
2 3
Flacon de 500 mL d’eau distillée contenant avec 10 à 10
1 14
Enterococcus faecalis et E.coli /L (noté E2)
2 Tubes de 2 mL d’eau peptonée stérile (noté P2 ou P3) 1 28
3 4
2 Tubes de 2 mL d’eau peptonée contenant avec 10 à 10
1 28
Enterococcus faecalis et E.coli/mL (noté P1 ou P4)
Gélose en petite boîte Slanetz 2 28 (210 mL)
Gélose lactosée Tergitol 7 TTC 2 28 (210 mL)
Filtres stériles de porosité 0,45 µm 2 28
Gélose ordinaire 4 56
Dispositif de filtration stérilisé, un pour deux binômes.

Réaliser une dilution de bouillons de 18 heures d’Enterococcus faecalis et E.coli pour obtenir
une suspension à l’étalon n°0,5 de Mac Farland. Réaliser une dilution au 1/10000ème des
suspensions (104 UFC/mL).
Ajouter les tubes de 2 mL d’eau peptonée avec une goutte de pipette pasteur (50µL) de
chaque dilution. A réaliser juste avant le TP ou à stocker au frigo.
Réaliser une dilution supplémentaire des suspensions au 1/10ème (103 UFC/mL). Ajouter les
flacons de 500 mL d’eau distillée stérile avec 2 gouttes de ces dilutions.

Coût de l’ensemble

Matériel nécessaire à la séance pour 28 élèves prix TTC


Gélose Slanetz 210 mL 1,00 €
Gélose lactosée Tergitol 7 TTC 210 mL 5,62 €
Boïtes de pétri Ø 55mm 56 2,52 €
Filtres stériles de porosité 0,45 µm 56 37,84 €

Le prix total est de 46,98 € ce qui revient à 1,68 € par élève.

31
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

3.5 Organisation détaillée de la séquence :


3.5.1 Supports et consignes prévus
Trois documents seront distribués aux élèves :
- le protocole du TP
- une fiche à compléter sur la technique de filtration sur membrane
- une fiche sur la composition des milieux de Slanetz et Tergitol + TTC
D’autres supports seront utilisés :
- un transparent reprenant le schéma de l’usine qui est également sur le protocole pour
expliquer les différentes analyses effectuées sur le site de production,
- le tableau pour noter les consignes ou pour faire certains rappels de cours. Par exemple, la
répartition des analyses par binôme y sera indiquée (voir tableau ci-dessous).
Analyses par binôme Élève 1 Élève 2
Échantillon 1, filtration, sur Échantillon 2, filtration, sur
Analyse de l’eau
Slanetz et Tergitol+TTC Slanetz et Tergitol+TTC
P1 et P2, étalement de 0,1 mL, P3 et P4, étalement de 0,1 mL,
Analyse des surfaces
sur GNO sur GNO

Chaque élève travaillera sur un des deux échantillons d’eau (contaminée ou stérile) mais le
déposera sur les deux milieux de culture. De même, chaque élève travaillera sur deux
prélèvements de surface, un stérile et un contaminé. Pour pouvoir conclure, les élèves devront
donc mettre en commun leurs résultats par binôme. Chaque élève obtiendra une gélose
ordinaire comportant deux types de colonies. Ils pourront déterminer quel type de colonie
correspond à quel contaminant en effectuant la préorientation à partir de chacune d’entre elles
(état frais, gram et test d’orientation).

3.5.2 Déroulement détaillé de la séquence


Le premier jour, les élèves doivent réaliser la filtration. Le temps sera donc principalement
dédié à l’explication et à la réalisation de cette nouvelle technique afin d’atteindre l’objectif
principal.
Dans un premier temps, on rappellera les différentes techniques de dénombrement en analyse
agroalimentaire. A partir des connaissances des élèves, un diagramme sera construit au
tableau (figure 5). De ce tableau, les élèves devront déduire une méthode d’étude de solutions
peu concentrées en bactéries.

Figure 5 : diagramme sur les


techniques de dénombrement

32
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

Ensuite, les conditions de réalisation de la filtration seront bien expliquées à l’aide de la fiche
de synthèse et de la démonstration.
Enfin, les élèves réaliseront la filtration sous la surveillance du professeur qui corrigera
éventuellement les manquements ou les erreurs.
Le mode d’expression des résultats sera souligné lors de la lecture du protocole.

Première séance
Temps Supports Activités professeur Activités élèves

10 Diapo sur le
minutes site de Explications sur le déroulement
production de la production, travail attendu Noter sur le schéma du protocole
(analyse de la matière première, les différents types de
Protocole du produit fini et analyses de prélèvements et leur lieu.
distribué aux surface), normes d’analyse.
élèves

15 Rappels sur les techniques de


minutes dénombrement déjà vues par
questionnement des élèves,
Réalisation
d’un Essayer de faire trouver aux Participation orale pour construire
diagramme au élèves le point commun des le diagramme à partir des acquis
tableau techniques de dénombrement
(figure 5) connues (dilutions) et en déduire
une méthode pour analyser des
produits peu concentré en micro-
organismes.

15 Fiche de
Description de la technique de la
minutes synthèse sur
filtration sur membrane,
la filtration, Remplir une fiche de synthèse
présentation du matériel,
matériel
démonstration.
utilisé

10 Lecture du protocole, explication


minutes des consignes de réalisation, Répartition des échantillons par
Tableau
mode d’expression du résultat binôme
des dénombrements.

55 Mise en œuvre par les élèves,


Observation de la filtration
minutes début de la rédaction du compte-
(évaluation formative)
rendu

Le deuxième jour, les élèves analysent les résultats obtenus. Pour cela, la composition des
milieux utilisés est analysée. Le TP étant réalisé en fin d’année, les élèves sont autonomes
pour la lecture des milieux, la réalisation des observations microscopiques et leur
interprétation.

33
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

Deuxième séance

Temps Supports Activités professeur Activités élèves

10 Retour sur le travail de la séance


minutes précédente. Questionnement des
Protocole du élèves sur :
Participation orale
TP - le travail réalisé
- les lectures à faire
- les tests à réaliser.

20 Etude de la composition des


Fiche milieu Remplir la fiche milieu
minutes milieux utilisés

10
Tableau Explication des consignes
minutes

1 heure Lecture des milieux.


Réalisation d’un état frais, d’une
coloration de Gram et du test
d’orientation sur les souches
Observation des états frais et des obtenues sur les milieux non
Tableau
colorations de Gram sélectifs.
Mise en commun des résultats du
binôme.
Rédaction du compte rendu

10 Discussion Analyse des résultats du groupe,


minutes des résultats conclusion

Selon l’avancement des élèves au cours des séances, on pourra moduler la durée de certaines
activités. Par exemple, si les élèves ont terminé leur manipulation le premier jour, on peut leur
demander de commencer à remplir la fiche des milieux avec les connaissances qu’ils ont déjà
sur certains composants. Le deuxième jour, si les élèves sont en retard, ils pourront par
binôme se répartir les tests de pré-orientation, chaque élève analysant un type de colonie.
L’analyse des résultats du groupe et les conclusions peuvent être corrigées à la séance
suivante.

3.6 Modalités d’évaluation


Le but de l’évaluation est de vérifier que tous les élèves ont acquis la technique de la
filtration. Ils doivent en avoir compris l’intérêt, en connaître l’utilisation principale et savoir
exprimer le résultat correctement.
Il est difficile de noter le TP sur la réalisation pratique de la filtration car c’est la première fois
que les élèves la réalisent. Une évaluation formative peut par contre être réalisée. En
surveillant la réalisation, le professeur peut corriger les gestes des élèves ou poser des
questions aux élèves pour vérifier qu’ils ont compris le but des différentes étapes.

34
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE

La compréhension du travail réalisé par les élèves sera jugée sur le compte-rendu. Une partie
du compte rendu est libre, mais quelques questions posées à la fin du protocole permettent de
diriger la réflexion de l’élève.
La schématisation des analyses réalisées permet à l’élève de visualiser et de clarifier ce qu’il a
accompli (figure 6). On regardera si les élèves savent exprimer correctement leurs résultats de
dénombrement et les comparer à la norme fournie pour conclure sur la qualité du produit
analysé.
Figure 6 : schéma récapitulatif des analyses réalisées

Au delà de la lecture et de l’expression du résultat, l’élève doit utiliser les conclusions


précédentes pour se mettre dans une situation professionnelle de technicien de laboratoire en
agroalimentaire. La réponse aux questions du protocole doit l’y aider.
Les conclusions précédentes sont que le produit (échantillon 2) n’est pas satisfaisant alors que
l’eau à l’émergence est conforme. De plus, les prélèvements P1 (bac à bouchons) et P4
(visseuse) sont également contaminés.

Les réponses attendues sont les suivantes :


Proposer une hypothèse sur la provenance des contaminants : L’eau n’est pas contaminée à
l’émergence, mais le produit fini oui. La contamination a lieu pendant la mise en bouteille.
Les machines ont été contaminées par le personnel porteur de germes.
Quelles seront les conséquences sur la production ? La production doit être arrêtée, et les
produits non conformes retirés du circuit de distribution.
Quelles mesures allez-vous prendre pour corriger ce problème ? Il faut décontaminer puis
désinfecter le bac à bouchons et la visseuse avant de relancer la production.
Par quels moyens peut-on éviter cette contamination ? Les bactéries trouvées sont des
indicateurs de contamination fécale, ce sont les personnels qui les ont apportés. Il faut donc
leur rappeler les bonnes pratiques d’hygiène : lavage des mains, port de tenue appropriée.

35
BIBLIOGRAPHIE

Aliments et boissons, filières et produits, 1999. Elisabeth VIERLING. Collection Biosciences


et techniques, Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine.

Analyse des eaux, aspects réglementaires et techniques, 2002. Franck REJSEK. Collection
Biologie technique environnement, Centre régional de documentation pédagogique
d’Aquitaine.

Bulletin Officiel n°4 du 29 avril 2010. Enseignement d'exploration :


Programme d'enseignement de biotechnologies en classe de seconde générale et
technologique.

Code d’usages international recommandé en matière d’hygiène pour le captage, l’exploitation


et la commercialisation des eaux minérales naturelles (CCAC/RCP 33-1985).

Codex alimentarius (CODEX STAN 108-1981)

Hydrologie des écosystèmes marins : paramètres et analyses. 2005. Aminot A. et Kérouel R.


Collection méthodes d’analyses du milieu marin, IFREMER.

Les toxi-infections alimentaires collectives en France entre 1996 et 2005. G. DELMAS, A.


GALLAY, E. ESPIE, S. HAEGHEBAERT, N. PIHIER, FX. WEILL, H;DE VALK, V.
VAILLANT, JC. DESENCLOS. Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire du 26 Décembre
2006. Institut de Veille Sanitaire

Microbiologie alimentaire 5e édition, 2003. Christiane JOFFIN et Jean-Noël JOFFIN.


Collection Biologie technique, Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine.

Microbiologie des eaux d’alimentation, 1993.C Haslay et H. Leclerc. Collection Technique et


Documentaion, LAVOISIER.

Microbiologie et qualité dans les industries agroalimentaires, 2002. C. BONNEFOY, F.


GUILLET, G . LEYRAL, E. VERNE-BOURDAIS. Collection Biosciences et techniques,
Centre régional de documentation pédagogique d’Aquitaine.

Microbiologie générale et appliquée. J. FIGARELLA, G. LEYRAL, M. TERRET

Microbiologie technique tome 1 dictionnaire des techniques 4ème édition, 2006. Jean-Noël
JOFFIN, Guy LEYRAL.

Techniques d’analyse et de contrôle dans les industries agroalimentaires, tome 3 Le contrôle


microbiologique. C.M. BOURGEOIS, J.Y. LEVEAU

36
Annexe 1 : critères de qualité microbiologique du
décret du 14 mars 2007

37
Annexe 2 : Normes actuelles d’échantillonnage et
méthodes d’analyse à la source et aux points
critiques de contrôle

Echantillonnage

Méthodes :

Iso 9308/1 : Filtration sur membrane et culture à 44°C sur gélose lactosée au tergitol et TTC

Iso 7899/2 : Filtration sur membrane et culture à 37°C sur gélose de Slanetz et Bartley

Iso 6461/2 : chauffage de l’eau 15 minutes à 75°C puis filtration sur membrane (porosité
0,2µm) et culture à 37°C sur gélose TS

Iso 8360/2 : Filtration sur membrane et culture à 37°C sur gélose cétrimide

38
Annexe 3 : Normes actuelles d’échantillonnage et
méthodes d’analyse du produit fini et en cours de
commercialisation

39
Annexe 4 : Formules des milieux de culture

PCA : Cétrimide :
Formule : par litre d'eau distillée Formule : par litre d'eau distillée
Tryptone . 5,0 g Peptone de gélatine 16,0 g
Extrait de levure 2,5 g Peptone de caséine 10,0 g
Glucose 4,0 g Sulfate de potassium 10,0 g
Agar 9,0 g Chlorure de magnésium 1,4 g
pH final: 7,0 Cétrimide 0,2 g
Acide nalidixique 15,0
mg
Agar 10,0 g
pH final : 7,1

Tergitol 7 TTC :
Formule : par litre d'eau distillée
Peptone de viande 10,0 g
Extrait de levure 6,0 g
Extrait de viande 5,0 g Sabouraud :
Lactose 20,0 g Formule : par litre d'eau distillée
Tergitol 7 0,01 g Peptone de viande 10,0 g
Bleu de bromothymol 0,05 g Glucose 20,0 g
Agar.............. 13,0 g Chloramphenicol 0,5 g
pH final : 7,2 Agar 15,0 g
Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter pH final : 6,0
25 mg de TTC avant de couler les boîtes.

Slanetz et Bartley :
Formule : par litre d'eau distillée
Peptone 20,0 g
Extrait de levure 5,0 g
Glucose 2,0 g
Hydrogénophosphate de sodium 4,0 g
Azide de sodium 0,4 g
Agar 10,0 g
pH final : 7,2
Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter
10 mg de TTC avant de couler les boîtes.

40
39
40
41
42