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Section Biotechnologies
Option Biochimie Génie Biologique
Session 2010
ANALYSES BACTÉRIOLOGIQUES
D’EAU MINÉRALE NATURELLE ET
D’EAU DE SOURCE
EMBOUTEILLÉES
Candidat n°07
SOMMAIRE
ABRÉVIATIONS ...................................................................................................................... 3
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 4
ETUDE TECHNIQUE ............................................................................................................... 5
1. L’eau embouteillée ............................................................................................................. 6
1.1. Flore naturelle de l’eau .................................................................................................... 6
1.2. Les différentes sortes d’eau embouteillée ....................................................................... 6
1.2.1. Les eaux de source ................................................................................................... 6
1.2.2. Les eaux minérales naturelles .................................................................................. 7
1.2.3. Les eaux rendues potables par traitement................................................................. 7
1.3. Les normes françaises actuelles ...................................................................................... 7
1.3.1. Les normes microbiologiques .................................................................................. 7
1.3.2. Les autres critères ..................................................................................................... 8
1.4. Les biocontaminations en industrie agroalimentaire ....................................................... 8
1.4.1. Les origines .............................................................................................................. 8
1.4.2. Les pathogènes et leurs effets ................................................................................. 10
2. Les analyses effectuées .................................................................................................... 11
2.1. Le site de production ..................................................................................................... 11
2.2. Les points de contrôle ................................................................................................... 13
2.3. Les techniques d’analyse ............................................................................................... 14
2.3.1. Types d'analyse ...................................................................................................... 14
2.3.2. Prélèvement des échantillons ................................................................................. 15
2.3.3. Analyse microbiologique des échantillons ............................................................. 15
2.3.4. Analyse physico-chimique des échantillons .......................................................... 18
2.4. Exemples de résultats et conséquences sur l’exploitation ............................................. 19
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE ....................................................................................................... 21
1. Introduction ...................................................................................................................... 22
2. Présentation des différents niveaux d’exploitation possibles ........................................... 22
2.1 Application en enseignement d’exploration en classe de seconde ............................ 22
2.2 Application en biochimie en classe de première STL-BGB...................................... 23
2.3 Application en microbiologie en classe de terminale STL-BGB .............................. 23
2.4 Application en microbiologie en STS ....................................................................... 23
3. Présentation de la séquence détaillée ............................................................................... 24
3.1 Modalités d’enseignement ......................................................................................... 24
1
3.2 Contenu du programme concerné .............................................................................. 24
3.3 Objectifs de la séquence et prérequis ........................................................................ 25
3.4 Préparation préalable ................................................................................................. 26
3.4.1 Par le professeur ................................................................................................. 26
Protocole……………………………………………………………………………………...27
Fiche technique Filtration………………………………………………………………..…...29
Fiche technique Milieux……………………………………………………………………...30
3.4.2 Par le personnel technique.................................................................................. 31
3.5 Organisation détaillée de la séquence :...................................................................... 32
3.5.1 Supports et consignes ......................................................................................... 32
3.5.2 Déroulement détaillé de la séquence .................................................................. 32
3.6 Modalités d’évaluation .............................................................................................. 34
BIBLIOGRAPHIE……………………………………………………………………………36
Annexe 1 : critères de qualité microbiologique du décret du 14 mars 2007 ............................ 37
Annexe 2 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse à la source et aux
points critiques de contrôle ...................................................................................................... 38
Annexe 3 : Normes actuelles d’échantillonnage et méthodes d’analyse du produit fini et en
cours de commercialisation ...................................................................................................... 39
Annexe 4 : Formules des milieux de culture40Annexe 5 : fiche technique du Dosage des ions
ammonium ................................................................................................................................ 41
Annexe 6 : fiche technique du Dosage du fer ........................................................................ 402
Annexe 7 : fiche technique du Dosage des ions manganèse .................................................. 413
Annexe 8: fiche technique du dosage des nitrites…………………………………………….44
2
ABRÉVIATIONS
3
INTRODUCTION
L’eau constitue 60% de notre organisme et une consommation de 1,5 litre par jour est
conseillée pour compenser les pertes hydriques. En raison de son caractère vital, l’eau
consommée doit être de bonne qualité sanitaire, afin d’éviter la survenue de pathologies
d’origine hydrique.
Le consommateur a aujourd’hui le choix entre l’eau du réseau de distribution, qui provient
majoritairement de captages d’eaux superficielles (rivières, lacs, canaux) et d’eau
embouteillée provenant de ressources profondes (nappes souterraines). Dans tous les cas, ces
eaux brutes doivent subir des traitements plus ou moins complexes selon leur qualité initiale.
Le produit distribué au consommateur doit répondre à des exigences de qualité
microbiologique et physico-chimique. Il subit donc un grand nombre de contrôles lors de sa
production.
Le travail présenté ici a été effectué dans une usine d’embouteillage lors d’une mission
d’intérim en tant que technicienne de laboratoire. J’ai pendant quatre mois réalisé les analyses
de qualité de l’usine : analyses microbiologiques sur le produit fini (eau minérale gazéifiée ou
non et eau de source embouteillées), qualité microbiologique de l’environnement, analyse de
l’eau aux différentes étapes de la mise en bouteilles. Ce travail est plus un contrôle qualité de
la production en routine qu’une analyse poussée du produit fini, cette dernière étant réalisée
par un laboratoire mieux équipé centralisant les analyses complètes des produits de toutes les
usines du groupe. Il s’agissait plus de contrôler certains points critiques afin de pouvoir réagir
rapidement en cas de problème. Ainsi les analyses qui sont effectuées doivent répondre à une
triple contrainte : elles doivent avoir un coût réduit, être réalisables facilement et donner des
résultats rapidement.
Dans l’étude technique, quelques rappels sur la réglementation et sur les précautions sanitaires
en agroalimentaire seront présentés. Ensuite, le fonctionnement de l’usine et les principaux
points de contrôle ainsi que les protocoles d’analyses seront décrits.
Dans l’application pédagogique, ce travail a été adapté pour être proposé en travaux pratiques
de microbiologie à une classe de terminale STL-BGB. Le but est à la fois de présenter une
nouvelle technique (la filtration de l’eau) et de donner une vision intégrée des analyses
microbiologiques dans une situation de travail, ici dans une usine agroalimentaire.
4
ÉTUDE TECHNIQUE
5
ÉTUDE TECHNIQUE
1. L’eau embouteillée
L’eau est un produit alimentaire particulier à bien des égards. C’est un milieu pauvre qui ne
permet pas le développement des micro-organismes, et s’il est sensible à des contaminations
microbiennes au même titre que les autres aliments, les conséquences sont plus limitées car
ces contaminants ne pourront pas se multiplier. L’eau de source et l’eau minérale ne
nécessitent pas de stérilisation, mais doivent répondre à des critères de qualité comme les
autres aliments. Si le producteur a une obligation de résultats, il n’a cependant pas
d’obligation de moyens. Le producteur peut donc effectuer les analyses qu’il décide avec les
milieux de culture de son choix, afin de s’adapter au mieux aux risques réels de la production
dans son usine.
Les bactéries rencontrées dans l’eau peuvent avoir trois origines différentes :
- une origine purement aquatique : germes aquicoles adaptés aux conditions de
température et à la disponibilité des substrats minéraux et organiques de ce milieu,
- une origine terrestre : leurs propriétés d’adaptation leur permettent de survivre et
éventuellement de se développer,
- une origine humaine ou animale : germes de contamination appelés germes fécaux,
dont la température normale de développement est de 37°C. Ils survivent dans ce
milieu mais ne peuvent pas y croître.
Les eaux souterraines ont pour origine l’eau de pluie ou les eaux de ruissellement qui
s’infiltrent dans le sol. Lors de cette infiltration, l’eau se charge en polluants, particules de
matière organique et microorganismes. Le passage dans le sol s’apparente à une filtration à
travers un milieu poreux dont les pores seraient de très petite taille. La matière organique
particulaire ainsi que les bactéries qui y sont fixées sont ainsi majoritairement éliminées. En
parallèle, l'eau se charge en composants des sols et des roches mères et peut acquérir des sels
minéraux en grande quantité (calcium, magnésium, sulfates...).
6
ÉTUDE TECHNIQUE
Les mentions obligatoires de l’étiquetage sont le nom de la source, son lieu d’exploitation et
les traitements de séparation des composés instables, tels le fer ou le manganèse, par
décantation ou filtration ; en mention facultative, l’utilisation pour l’alimentation des
nourrissons peut être signalée (c’est la seule allégation nutritionnelle autorisée pouvant
apparaître sur l’étiquette).
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ÉTUDE TECHNIQUE
8
ÉTUDE TECHNIQUE
L’eau d’origine profonde est un cas particulier car c’est un milieu nutritif très pauvre, la
plupart des bactéries ne peuvent s’y multiplier. L’absence de matière organique implique
également qu’elle ne peut être altérée par les micro-organismes, une contamination
importante sera donc moins facilement détectable par le consommateur. Enfin, l’eau profonde
est quasiment exempte de microorganismes lorsqu’elle est pompée dans le sous-sol, la flore
retrouvée dans le produit fini provient donc exclusivement des opérations technologiques
réalisées lors de l’embouteillage (contaminations secondaires). Toutes les précautions
d’hygiène sont prises pour limiter ces biocontaminations (voir tableau 2).
9
ÉTUDE TECHNIQUE
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ÉTUDE TECHNIQUE
Malgré leur nature extrêmement différente, les agents pathogènes partagent (ainsi que les
infections qu’ils causent) plusieurs caractéristiques (voir tableau 3).
Ils sont résistants et peuvent survivre plusieurs mois dans l’eau et conserver leur potentiel
pathogène. Ils induisent après ingestion des symptômes gastro-intestinaux tels que diarrhées
et/ou vomissements. La gravité de l’infection est variable selon la quantité de pathogènes
ingérée, selon sa virulence, et selon l’état physiologique de la personne infectée. La plupart
sont des pathogènes opportunistes ou causent des infections asymptomatiques ou sans gravité.
Cependant, chez les personnes âgées, immunodéprimées et les jeunes enfants la maladie peut
être grave, voire fatale. Quelques uns sont aussi des pathogènes stricts, comme Salmonella ou
Vibrio.
Leur mode de transmission (oro-fécal) est le même : les aliments ou l'eau sont contaminés par
les matières fécales de personnes ou d’animaux infectés ou porteurs sains (les porteurs sains
de Salmonella peuvent éliminer de l’ordre de 107 Salmonelles/g de selles toute leur vie). Si
l’homme est le seul réservoir, la prévention est plus simple. Le traitement de l’eau pour
éliminer les microorganismes et l’hygiène individuelle (lavage des mains avant toute
manipulation d’aliments, lavage des fruits et légumes crus, …) peuvent permettre d’éradiquer
le pathogène. Par exemple, le choléra et la dysenterie bactérienne ne causent plus d’épidémies
en Europe et en Amérique du nord depuis la mise en place des systèmes de traitement de l’eau
de distribution. Le problème est plus délicat si le pathogène est présent chez des animaux
domestiques ou sauvages. L’éradication est alors impossible et le risque de contamination
fécale par ces réservoirs est plus fréquent. Cependant, grâce aux mesures préventives, les cas
d’intoxications alimentaires d’origine hydrique sont extrêmement rares (58 cas en 10 ans en
France).
L’eau pompée est stockée dans une première cuve, permettant le fonctionnement des chaînes
d’embouteillage même si le pompage doit être arrêté pour des opérations de maintenance.
Cette eau est ensuite traitée. De l’ozone y est injectée pour oxyder le fer et le manganèse qui
forment des particules de décantation, ces particules sont ensuite éliminées par filtration.
L’eau déferrisée est stockée dans une deuxième cuve permettant aussi de faire une réserve
d’eau prête à être embouteillée.
En parallèle, les bouteilles sont préparées dans la salle de soufflage. Des préformes en PET
passent dans une machine où elles sont chauffées puis soufflées dans un moule afin d’obtenir
la forme de la bouteille. Le soufflage est effectué dans une salle blanche, car les bouteilles
doivent être exemptes de microorganismes. Les accès sont tous équipés d’un pédiluve et d’un
poste de lavage des mains. Le personnel ne peut entrer que s’il porte une charlotte et des
surchaussures. L’intervention dans les machines nécessite en plus le port d’un masque. Les
bouteilles sont ensuite transportées jusqu’à la salle de soutirage par un rail protégé par un flux
laminaire.
11
ÉTUDE TECHNIQUE
La salle d’embouteillage est également une salle blanche. L’eau y est distribuée dans les
bouteilles qui sont immédiatement bouchées. Cette étape peut être précédée d’une adjonction
de CO2 pour obtenir de l’eau gazeuse. La soutireuse est un point sensible car c’est le seul
endroit où l’eau sort des canalisations et peut donc être contaminée par les opérateurs, l’air
ambiant ou les machines. Ces machines sont dans une enceinte close et sous flux laminaire
(voir figure 3). Les bouteilles sont ensuite étiquetées et le code produit, la date et l’heure
d’embouteillage, ainsi que la DLUO y sont gravés.
Le produit fini quitte ensuite les salles blanches pour une zone moins critique où les bouteilles
sont assemblées en pack, puis en palettes, avant d’être déplacées dans une zone de stockage.
Le site comprend deux forages et trois lignes d’embouteillage (le schéma a été simplifié et ne
comporte qu’un forage et une ligne d’embouteillage) qui peuvent fonctionner en parallèle de
manière continue pendant toute la semaine, grâce à des équipes d’opérateurs travaillant en
3x8H. Lorsque les lignes fonctionnent au maximum de leur capacité, elles produisent environ
20000 bouteilles de 1,5 L ou 2L par heure pour les deux premières lignes et environ 60000
bouteilles de 0,5L par heure pour la troisième.
A la fin de chaque semaine de production, l’usine est intégralement nettoyée, en particulier les
salles blanches dont les machines sont désinfectées au canon à mousse.
12
ÉTUDE TECHNIQUE
Il faut aussi vérifier les matières premières, soit l'ensemble des éléments qui entrent dans la
composition de la bouteille comme les matériaux en contact avec l'eau (bouchons,
plastique…) ainsi que la qualité du produit final : niveau de remplissage, étiquette bien collée,
DLUO lisible, couple de vissage des bouchons, pression de CO2, …. Le produit fini est
contrôlé lors du démarrage de la ligne de production, puis à chaque changement d’équipe soit
toutes les 8 heures. Des prélèvements de surface sont effectués dans la soutireuse pour vérifier
si la désinfection a été efficace.
Sur la figure 2, les points de prélèvement de l’eau sont marqués par les flèches rouges
(analyses microbiologiques) et violettes (analyses physico-chimiques). Sur la figure 3, les
prélèvements de matières premières et les prélèvements de surface sont indiqués
respectivement par les flèches vertes et oranges.
13
ÉTUDE TECHNIQUE
En suivi de production d’eau embouteillée, seule l’analyse sommaire est requise. Le produit
fini devrait subir une analyse complète. Dans l’usine, une analyse de type B2, une recherche
de Pseudomonas aeruginosa ainsi qu’un dénombrement des moisissures et levures sont
réalisés quotidiennement sur les produits finis et dans les cuves de stockage de l’eau après
traitement. Ces deux dernières analyses ne sont pas obligatoires mais sont réalisées car l’usine
est très ancienne (elle date des années cinnquante) et quelques défauts de conception induisent
des contaminations récurrentes par les moisissures. De même, la recherche de Pseudomonas
aeruginosa est réalisée quotidiennement car cette bactérie peut former des biofilms dans les
canalisations.
La recherche des spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices n’est pas réalisée car le
laboratoire ne dispose pas d’étuve anaérobie pour les analyses par filtration et la technique
d’ensemencement en tubes demande beaucoup plus de temps. De plus, les anaérobies sulfito-
réducteurs sont des indicateurs de contamination fécale ancienne. Or la source est pure, donc
toute contamination fécale sera récente et sera très bien détectée par une recherche des autres
bactéries de la flore fécale (coliformes et entérocoques).
Une analyse microbiologique plus complète (prenant en compte tous les pathogènes et les
indicateurs de contamination fécale comme les spores de bactéries sulfito-réductrices, les
légionelles, …) et les analyses biochimiques complètes sont réalisées par un laboratoire gérant
toutes les sources du groupe une fois par mois. Une analyse trimestrielle est également
réalisée par un laboratoire indépendant agréé par l’état. La recherche de contaminants dans
l’atmosphère, sur les contenants (bouteilles et bouchons), sur les machines dans les salles
blanches (écouvillons), et sur les mains des opérateurs sont réalisées une fois par semaine. En
parallèle, chaque jour l’eau est analysée pour mesurer la concentration de quatre ions dont la
teneur est règlementée : fer, manganèse, ammonium et nitrites.
Ce travail a été réalisé en 2006, les normes d’analyse ont évolué depuis et les méthodes
d’échantillonnage et de contrôle microbiologique sont aujourd’hui fixées par le codex
alimentarius (CODEX STAN 108-1981) et dans le code d’usage international pour
l’exploitation et la commercialisation des eaux minérales naturelles (CCAC/RCP 33-1985).
Elles sont identiques pour l’eau de source. Elles sont présentées dans les annexes 2 et 3.
14
ÉTUDE TECHNIQUE
Pour les prélèvements de surface, on utilise des écouvillons en tube contenant un milieu de
culture stérile. Le dispositif d’écouvillonnage est ouvert rapidement, frotté sur la surface à
analyser et refermé immédiatement. Le prélèvement n’est pas réalisé en conditions de
stérilité, mais les machines sont toutes sous flux laminaire et l’atmosphère doit y être très peu
contaminée. Chaque prélèvement est réalisé en double.
L’analyse de l’ambiance consiste à rechercher la présence de levures et moisissures dans
l’atmosphère des salles d’embouteillage, de soufflage et dans la salle des bouchons. Une boîte
de Pétri de 12,5 cm de diamètre est ouverte et disposée en hauteur dans la salle pendant une
heure. Elle est ensuite fermée, retournée et incubée 48 heures à 22°C.
Le contrôle de l’hygiène des mains du personnel est réalisé par apposition des doigts sur le
milieu de culture en boîtes de Pétri. Sur une main sont recherchés les entérocoques et sur
l’autre les coliformes thermotolérants.
Matériel
Figure 4 :
appareillage
de filtration
de l’eau
(photo
matériel
Sartorius)
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ÉTUDE TECHNIQUE
La filtration est réalisée sur une rampe de filtration sous vide contenant trois systèmes de
filtration afin de gagner du temps lors de la réalisation des analyses (trois échantillons sont
filtrés en même temps). Voir figure 4
Mode opératoire
1) Stériliser le dispositif, en versant de l’éthanol dans l’entonnoir, flamber au bec bunsen.
Rincer à l’eau distillée stérile pour enlever les dernières traces d’éthanol et refroidir le
dispositif.
2) Enlever l’entonnoir, placer la membrane stérile (Sartorius, acétate de cellulose) quadrillage
vers le haut bien centrée sur le fritté grâce à une pince préalablement flambée puis refroidie,
remettre l’entonnoir.
3) Verser l’échantillon à analyser jusqu’au repère (graduation de volume). Ouvrir la vanne à
vide. Quand le filtre paraît sec, casser le vide et enlever l’entonnoir.
4) Enlever la membrane et la déposer sur une boîte de Pétri de 5 cm de diamètre contenant le
milieu de culture adéquat, quadrillage vers le haut. Faire attention à ce qu’il n’y ait pas de
bulles d’air pour que toute la membrane soit au contact du milieu de culture. Les boîtes sont
retournées et incubées le temps nécessaire (voir tableau 5).
L’analyse d’un même échantillon (six boîtes de Pétri sont réalisées) ne nécessite pas de
stériliser le dispositif de filtration entre chaque filtration.
16
ÉTUDE TECHNIQUE
stérile environ. Le flacon est bien agité puis l’eau est filtrée. Pour le contrôle de l’hygiène des
mains du personnel et les prélèvements de surface, seuls les flores indicatrices de la présence
de pathogènes sont recherchées (entérocoques et coliformes thermotolérants). Dans ce dernier
cas, le milieu de culture contenu dans le tube de l’écouvillon est bien homogénéisé, puis versé
sur le filtre avec le même mode opératoire.
Milieux de culture
La composition des milieux de culture est présentée en annexe 4.
PCA :
Principe : La gélose P.C.A. Standard dénombrement, encore appelée « Plate Count Agar »,
est utilisée pour le dénombrement des germes aérobies totaux dans le lait, les eaux, les
viandes, les produits à base de viande, les autres produits alimentaires, ainsi que pour
l'analyse des produits pharmaceutiques, des produits cosmétiques et de leur matière
premières.
Lecture : Chaque colonie est considérée comme ayant été engendrée par une bactérie.
Dénombrer sur les boîtes de Pétri présentant entre 30 et 300 UFC. Pour l’analyse de l’eau, la
flore se développant à 20°C doit être plus importante que la flore se développant à 37°C.
Tergitol 7 TTC :
Principe : la gélose lactosée au T.T.C. et Tergitol 7 est utilisée pour les recherches et
dénombrements des coliformes et coliformes thermotolérants des eaux par la méthode des
membranes filtrantes.
Le Tergitol 7 inhibe la pousse des germes à gram positif, réduit l'envahissement du milieu par
les Protéus et favorise le recouvrement des coliformes.
Autre additif, le T.T.C est réduit très rapidement par la majorité des bactéries coliformes et
forme un formazan de couleur rose ou rouge.
Enfin, les micro-organismes capables de fermenter le lactose présent dans le milieu, donnent
des colonies cernées de halos jaunes, coloration due au virage de l'indicateur de pH, le bleu de
bromothymol.
Lecture : colonies bleues ou vertes : lactose -, colonies jaunes : lactose +. La réduction du
TTC en composé rouge est faible avec Escherichia coli et Enterobacter aerogenes qui
donnent donc des colonies jaunes alors que celles des autres coliformes seront rose-rouges et
entourées d'un halo jaune. Une colonie avec un halo jaune est identifiée par galerie Api 20E.
Slanetz et Bartley :
Principe : la gélose de Slanetz est un milieu solide qui permet la recherche et le
dénombrement des entérocoques dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.
Lecture : Les Enterococcus donnent des colonies moyennes roses ou rouges. Une
confirmation d’identification est réalisée par ensemencement d’une gélose BEA incubée 4H à
44°C.
Cétrimide :
Principe : la gélose au cétrimide est utilisée pour l’isolement sélectif et l’identification
présomptive de Pseudomonas aeruginosa. Sur ce milieu de très nombreuses bactéries sont
inhibées de par la présence de l'antiseptique cétrimide (bromure de N-cétyl-N, N, N-
triméthylammonium), ainsi que par la présence de l'antibiotique acide nalidixique (inhibiteur
de nombreuses bactéries à Gram négatif). Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi
la production de pigments par P. aeruginosa.
17
ÉTUDE TECHNIQUE
Sabouraud :
Principe : La gélose Sabouraud est un milieu d'utilisation générale, permettant la croissance et
l’isolement d'une grande variété de levures et moisissures. Il est additionné de chloramphénicol
pour inhiber la croissance des bactéries Gram positif et Gram négatif. Il permet l’isolement
sélectif des levures et moisissures dans un produit contenant des bactéries.
Lecture : Chaque colonie ou thalle est considéré comme ayant été engendré par une levure ou
une moisissure.
18
ÉTUDE TECHNIQUE
thermotolérants
Moisissures et
revivifiables à
revivifiables à
Entérocoques
Pseudomonas
organismes
organismes
Coliformes
aeruginosa
levures
Micro-
Micro-
22°C
37°C
Fer
Forage
0/250mL 0/250mL 0/250mL 0/100mL 0/100mL 0/100mL 0,5 mg/L
Cuve de
110/100 40/100m 0,05
stockage 0/250mL 0/250mL 0/250mL 1/100mL
mL L mg/L
Produit fini
200/100 15/100m
au 0/250mL 0/250mL 0/250mL INC -
mL L
démarrage
Produit fini
200/100 120/100
en cours de 0/250mL 0/250mL 0/250mL 3/100mL -
mL mL
production
Soutireuse
0 0 - - - - -
Bouchons
Bouteilles 0 0 - - - - -
Ambiance 12
- - - - - -
colonies
Mains du
personnel 2 0 - - - - -
● Les concentrations en fer et manganèse sont suivies chaque jour. Dans le cas présenté, on
atteint la valeur limite de 0,05 mg/L, le nettoyage des filtres doit être programmé à la fin de la
semaine de production,
19
ÉTUDE TECHNIQUE
37°C. Si ce n’est pas le cas, ce peut être le signe d’une contamination fécale. Les résultats
obtenus pour la flore fécale et les pathogènes doivent toujours être négatifs.
● Les contrôles de surface dans les machines ne doivent montrer aucune UFC. Si c’était le
cas, la production serait immédiatement arrêtée pour lancer une désinfection complète car le
risque de contamination du produit serait bien trop élevé.
● L’analyse de la flore sur les mains du personnel permet de vérifier le respect des consignes
d’hygiène. Le résultat obtenu ici est correct, c’est aussi l’occasion de faire un rappel des
consignes au personnel intervenant aux points critiques de l’embouteillage.
En conclusion, on peut noter que toutes les précautions prises lors de la production portent
leurs fruits puisqu’aucun incident n’a eu lieu dans l’usine depuis plusieurs années. Le contrôle
aux différentes étapes de l’embouteillage assure une réaction rapide en cas de problème et
permet d’améliorer les procédés de fabrication en identifiant les éventuels points critiques.
20
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
21
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
1. Introduction
Les techniques utilisées principalement lors de cette expérience professionnelle sont d’une
part l’analyse microbiologique d’eau par filtration, et d’autre part l’analyse de
l’environnement de production par des prélèvements de surface. Elles correspondent
parfaitement aux enseignements en lycée technologique et ne nécessitent pas de matériel
particulier ou coûteux que les lycées ne pourraient se fournir. Elle est de plus au programme
de plusieurs cursus. Cette séquence est donc parfaitement adaptable à plusieurs niveaux aussi
bien en seconde en enseignement d’exploration de biotechnologies qu’en terminale STL-BGB
ou dans certaines sections de technicien supérieur.
La transposition de cette expérience professionnelle peut être utilisée pour susciter un intérêt
particulier de l’élève en lui montrant une application réelle dans la vie professionnelle de ses
apprentissages en travaux pratiques. De plus, cette activité permet d’intégrer l’analyse d’un
produit alimentaire et les prélèvements de surface en montrant leurs liens dans la pratique
industrielle. Cela permet également aux élèves d’appréhender le travail en industries
agroalimentaires et les aider à faire leur choix d’orientation post-baccalauréat puisqu’ils
voient lors des travaux pratiques des applications correspondant aux différents métiers qu’ils
seront susceptibles d’exercer par la suite.
22
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
ce travail en seconde demande une adaptation importante des techniques et des milieux
utilisés.
23
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
Dans ce cas, les élèves doivent réaliser une analyse complète du produit, c'est-à-dire
rechercher l’ensemble des bactéries pour lesquelles une valeur limite est donnée dans la
réglementation, ce qui peut être réalisé lors d’une séance de travaux pratiques.
L’analyse de la pollution de l’environnement par les différentes techniques utilisées en
laboratoire peut être l’objet d’une autre séance de TP, en y ajoutant la recherche de la flore
cutanée avant et après lavage des mains (simple, antiseptique, chirurgical).
24
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
L’analyse de l’eau par filtration peut être facilement réalisée en lycée technologique. Le
matériel est présent dans tous les lycées. De même, la recherche de la flore de surface par
différentes techniques est au programme des terminales STL-BGB, ainsi que les différentes
techniques de dénombrement dans les aliments.
Cette séquence permet également de consolider les acquis en réalisant plusieurs rappels sur :
- les autres méthodes de dénombrement qui ont déjà été utilisées,
- la nature des flores recherchées dans les aliments, en particulier la flore fécale et la
flore totale qui sont des témoins de contamination,
- les moyens de sélectionner ces populations par les conditions opératoires et les
milieux de culture,
- l’utilisation des prélèvements de surface,
- le calcul et l’expression des résultats d’un dénombrement,
- la vérification qu’un produit répond aux normes demandées.
25
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
L’intégration de toutes ces données doit leur permettre d’analyser correctement les résultats
obtenus.
En conséquence, ce TP doit être réalisé après plusieurs autres consacrés à l’analyse en agro-
alimentaire :
- numération par la méthode NPP des coliformes totaux en milieu liquide, et réalisation de test
complémentaire d’identification d’E. coli par le test de Mackensie,
- numération des coliformes totaux d’un lait par technique de la double couche sur gélose au
désoxycholates,
- recherche de spores de Clostridium sulfito-réducteurs dans une eau contaminée (type eau de
mare),
- recherche de Staphylococcus aureus dans un lait sur le milieu de Baird Parker, confirmation
par une agglutination,
- utilisation des différentes techniques d’analyse de la flore de surface (écouvillonnage, boîte
contact).
Il sera donc réalisé vers la fin de l’année scolaire.
Ensuite, j’ai recherché les ressources disponibles sur le site internet Éducnet dans la base de
données ÉDU’bases Biotechnologies et ST2S. Un document est disponible sur la technique de
filtration, un diaporama présentant la technique (fiche n°161, http://www.ac-
montpellier.fr/Pedagogie/Disciplines/sti/biotechn/microbio.html). Un lycée de Montpellier
met également à disposition deux petits films montrant un élève réalisant la dépose de la
membrane sur le dispositif de filtration puis la dépose de la membrane sur le milieu de culture
(http://www.lyc-lacroix-narbonne.ac-montpellier.fr/dossiers/dossiers.php?val=291_analyse+
microbiologique+eau). Il m’a finalement semblé qu’il était plus parlant de faire une
démonstration devant les élèves plutôt que de montrer un diaporama et un film dans lesquels
toutes les étapes ne sont pas présentées (stérilisation du dispositif, filtration).
La préparation des documents élèves a ensuite été réalisée. Les documents techniques fournis
aux élèves sont utilisés lors des TP suivants et leur permettent de garder une trace du travail
réalisé puisqu’ils n’ont pas de manuel scolaire disponible pour leur section. Trois documents
élèves leur seront fournis : un protocole (pages 27 et 28) pour diriger le travail de la séance et
deux fiches techniques, une sur la technique de filtration (page 29) et une sur les milieux de
culture utilisés (page 30).
Ces documents sont présentés sur les pages suivantes. Sur les fiches techniques, ce qui est à
remplir avec les élèves est noté en rouge.
26
TP : Contrôle de l’embouteillage d’une eau minérale
Une usine d’embouteillage d’eau minérale vous demande de contrôler son produit à deux
stades de la production :
- eau à l’émergence : échantillon 1
- produit fini : échantillon 2
Limites de
Paramètre Méthode de recherche Notes
qualité
Coliformes A l’émergence et au cours de la
0 / 250 mL Iso 9308/1
thermotolérants commercialisation
A l’émergence et au cours de la
Entérocoques 0 / 250 mL Iso 7899/2
commercialisation
27
1er jour :
2ème jour :
Compte rendu
1er jour :
Réaliser un schéma récapitulatif des analyses réalisées.
2ème jour :
Proposer une hypothèse sur la provenance des contaminants.
Quelles seront les conséquences sur la production ?
Quelles mesures allez-vous prendre pour corriger ce problème ?
Par quels moyens peut-on éviter cette contamination ?
28
Fiche technique : la filtration sur membrane
Utilisation
Analyse de produits liquides peu concentrés en microorganismes : l’eau
Principe
Concentration des microorganismes par filtration sur une membrane
Méthode
Points critiques
29
Gélose de SLANETZ
Utilisation : la gélose de Slanetz est un milieu solide sélectif qui permet la recherche et le dénombrement des
entérocoques dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.
Utilisation : la gélose lactosée au Tergitol 7 et TTC est un milieu solide sélectif qui permet la recherche et le
dénombrement des coliformes dans les eaux par la méthode des membranes filtrantes.
30
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
Réaliser une dilution de bouillons de 18 heures d’Enterococcus faecalis et E.coli pour obtenir
une suspension à l’étalon n°0,5 de Mac Farland. Réaliser une dilution au 1/10000ème des
suspensions (104 UFC/mL).
Ajouter les tubes de 2 mL d’eau peptonée avec une goutte de pipette pasteur (50µL) de
chaque dilution. A réaliser juste avant le TP ou à stocker au frigo.
Réaliser une dilution supplémentaire des suspensions au 1/10ème (103 UFC/mL). Ajouter les
flacons de 500 mL d’eau distillée stérile avec 2 gouttes de ces dilutions.
Coût de l’ensemble
31
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
Chaque élève travaillera sur un des deux échantillons d’eau (contaminée ou stérile) mais le
déposera sur les deux milieux de culture. De même, chaque élève travaillera sur deux
prélèvements de surface, un stérile et un contaminé. Pour pouvoir conclure, les élèves devront
donc mettre en commun leurs résultats par binôme. Chaque élève obtiendra une gélose
ordinaire comportant deux types de colonies. Ils pourront déterminer quel type de colonie
correspond à quel contaminant en effectuant la préorientation à partir de chacune d’entre elles
(état frais, gram et test d’orientation).
32
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
Ensuite, les conditions de réalisation de la filtration seront bien expliquées à l’aide de la fiche
de synthèse et de la démonstration.
Enfin, les élèves réaliseront la filtration sous la surveillance du professeur qui corrigera
éventuellement les manquements ou les erreurs.
Le mode d’expression des résultats sera souligné lors de la lecture du protocole.
Première séance
Temps Supports Activités professeur Activités élèves
10 Diapo sur le
minutes site de Explications sur le déroulement
production de la production, travail attendu Noter sur le schéma du protocole
(analyse de la matière première, les différents types de
Protocole du produit fini et analyses de prélèvements et leur lieu.
distribué aux surface), normes d’analyse.
élèves
15 Fiche de
Description de la technique de la
minutes synthèse sur
filtration sur membrane,
la filtration, Remplir une fiche de synthèse
présentation du matériel,
matériel
démonstration.
utilisé
Le deuxième jour, les élèves analysent les résultats obtenus. Pour cela, la composition des
milieux utilisés est analysée. Le TP étant réalisé en fin d’année, les élèves sont autonomes
pour la lecture des milieux, la réalisation des observations microscopiques et leur
interprétation.
33
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
Deuxième séance
10
Tableau Explication des consignes
minutes
Selon l’avancement des élèves au cours des séances, on pourra moduler la durée de certaines
activités. Par exemple, si les élèves ont terminé leur manipulation le premier jour, on peut leur
demander de commencer à remplir la fiche des milieux avec les connaissances qu’ils ont déjà
sur certains composants. Le deuxième jour, si les élèves sont en retard, ils pourront par
binôme se répartir les tests de pré-orientation, chaque élève analysant un type de colonie.
L’analyse des résultats du groupe et les conclusions peuvent être corrigées à la séance
suivante.
34
ÉTUDE PÉDAGOGIQUE
La compréhension du travail réalisé par les élèves sera jugée sur le compte-rendu. Une partie
du compte rendu est libre, mais quelques questions posées à la fin du protocole permettent de
diriger la réflexion de l’élève.
La schématisation des analyses réalisées permet à l’élève de visualiser et de clarifier ce qu’il a
accompli (figure 6). On regardera si les élèves savent exprimer correctement leurs résultats de
dénombrement et les comparer à la norme fournie pour conclure sur la qualité du produit
analysé.
Figure 6 : schéma récapitulatif des analyses réalisées
35
BIBLIOGRAPHIE
Analyse des eaux, aspects réglementaires et techniques, 2002. Franck REJSEK. Collection
Biologie technique environnement, Centre régional de documentation pédagogique
d’Aquitaine.
Microbiologie technique tome 1 dictionnaire des techniques 4ème édition, 2006. Jean-Noël
JOFFIN, Guy LEYRAL.
36
Annexe 1 : critères de qualité microbiologique du
décret du 14 mars 2007
37
Annexe 2 : Normes actuelles d’échantillonnage et
méthodes d’analyse à la source et aux points
critiques de contrôle
Echantillonnage
Méthodes :
Iso 9308/1 : Filtration sur membrane et culture à 44°C sur gélose lactosée au tergitol et TTC
Iso 7899/2 : Filtration sur membrane et culture à 37°C sur gélose de Slanetz et Bartley
Iso 6461/2 : chauffage de l’eau 15 minutes à 75°C puis filtration sur membrane (porosité
0,2µm) et culture à 37°C sur gélose TS
Iso 8360/2 : Filtration sur membrane et culture à 37°C sur gélose cétrimide
38
Annexe 3 : Normes actuelles d’échantillonnage et
méthodes d’analyse du produit fini et en cours de
commercialisation
39
Annexe 4 : Formules des milieux de culture
PCA : Cétrimide :
Formule : par litre d'eau distillée Formule : par litre d'eau distillée
Tryptone . 5,0 g Peptone de gélatine 16,0 g
Extrait de levure 2,5 g Peptone de caséine 10,0 g
Glucose 4,0 g Sulfate de potassium 10,0 g
Agar 9,0 g Chlorure de magnésium 1,4 g
pH final: 7,0 Cétrimide 0,2 g
Acide nalidixique 15,0
mg
Agar 10,0 g
pH final : 7,1
Tergitol 7 TTC :
Formule : par litre d'eau distillée
Peptone de viande 10,0 g
Extrait de levure 6,0 g
Extrait de viande 5,0 g Sabouraud :
Lactose 20,0 g Formule : par litre d'eau distillée
Tergitol 7 0,01 g Peptone de viande 10,0 g
Bleu de bromothymol 0,05 g Glucose 20,0 g
Agar.............. 13,0 g Chloramphenicol 0,5 g
pH final : 7,2 Agar 15,0 g
Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter pH final : 6,0
25 mg de TTC avant de couler les boîtes.
Slanetz et Bartley :
Formule : par litre d'eau distillée
Peptone 20,0 g
Extrait de levure 5,0 g
Glucose 2,0 g
Hydrogénophosphate de sodium 4,0 g
Azide de sodium 0,4 g
Agar 10,0 g
pH final : 7,2
Quand le milieu est refroidi à 45°C, ajouter
10 mg de TTC avant de couler les boîtes.
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