Chromatographie d’affinité et l’HPLC

PLAN

01 Introduction 02 Chromatographie
d’affinité

03 Bio-chromatographie 04 Chromatographie
pseudo affinité
 PLAN

05 Chromatographie 06 CLHP
d’affinité de cellules

07 CAHP 08 Conclusion
 Introduction
La caractérisation, l’analyse, la séparation et la purifications des
molécules biologiques sont des outils indispensables dans la chimie
biologiques, dont ils permettent d’identifier et d’obtenir les molécules les
plus pure possible, qui seront utilisées dont des différents domaines
cliniques et biologiques.
 02
Chromatographie d’affinité
Définition
La chromatographie d'affinité c’est une méthode de
chromatographie liquide, elle peut être définie
comme une technique biophysique importante qui
permet la séparation, l'identification et la
purification des composants d'un mélange pour une
analyse qualitative et quantitative.
 Les divers constituants
de cette chromatographie
 Phase stationnaire
La phase stationnaire est constitué d’un
support (silice, polymère) inerte
chimiquement, insoluble et suffisamment
perméable pour posséder une surface
considérable sur laquelle se fixe un ligand par
covalence soit directement ou indirectement à
travers un bras .
 
Phase mobile
Une solution tampon versée dans la colonne avec
une vitesse contrôlée, le tampon souvent utilisé dans
cette chromatographie est le PBS (solution saline
tamponnée au phosphate).
 Il s’agit de quoi?
Son principe repose sur la reconnaissance spécifique d’un composé ou d’un groupe de
composés par un ligand attaché à la phase solide stationnaire et l’élimination de la majorité des
autres composés, cette méthode est basée donc sur les interactions spécifiques et réversibles
entre le ligand et son partenaire disant affinant en solution, elle se droule generalement en trois
étapes :

Fixation Purification Elution

  Etape de fixation:

Le mélange de molécules contenant le composé à purifié est

chargé sur la colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une
affinité pour la colonne sera retenue par l'effecteur greffé sur la
phase stationnaire.

l’interaction spécifique ligand-récepteur

Un ligand (L) et un récepteur (R) doivent se transporter a

proximitee et de meme temps se rencontrer avec la bonne
orientation pour construire des liaisons non covalantes a travers des
interactions spécifiquede type Van der Waals (VDW), hydrophobes,
liaisons hydrogènes et électrostatiques, en formant le complexe .
  Etape de purification:

En continuant à faire passer du

tampon dans la colonne, toutes les
molécules contaminants sont
éliminées et éluées.

 Etape d’élution:

La molécule purifiée est décrochée de

la colonne et est recueillie dans
l'éluant.
Domaines d’application
La chromatographie d'affinité constitue un outil puissant
pour la séparation surtout desmacromolécules biologiques,
ce procede est adapté soit à l’analyse, soit à la préparation
des échantillons biologiques. Il est utilisé en :

o Enzymologie.
o Immunologie.
o Protéinochimie.
Avantage  

 La haute spécificité.
 Les molécules cibles peuvent être obtenues dans un état
pur.
 La matrice peut être réutilisée rapidement.
 Donne un produit purifié avec un rendement élevé.
 03
Bio-chromatographie
 Elle s’agit de quoi?
Dans ce type de chromatographie, il y a
reconnaissance et interactions souvent multiples
(hydrogène, hydrophobe, ionique, transferts de
charge π-π) entre deux molécules : le soluté et la
phase stationnaire.

Il s'agit d'une chromatographie d'adsorption

dans laquelle la molécule à purifier est
adsorbée spécifiquement de façon réversible
sur un ligand immobilisé sur la phase
stationnaire.
Méthodes de couplage
1-Carbodiimide
2-Il est possible de fixer sur la matrice des thiols (type glutathion -2-pyridyl disulfure)

RSH peut être une protéine, un peptide etc.

 Règle de Dalgliesh 

Cette séparation est basée sur la règle des

trois points, qui postule que la discrimination
chirale repose sur la formation d’un
complexe diastéréoisomèrique nécessitant au
moins trois interactions. Il en résulte trois
points d’ancrage et les énantiomères forment
des complexes de diastéréoisomères qui ont
des énergies de liaisons différentes
 04
Chromatographie
pseudo-affinité
 Méthode très utilisée par les biochimistes, elle
consiste à fixer une enzyme sur la phase stationnaire
de façon à complexer sélectivement les substrats

C’est qoui? correspondants (ou vice versa). Il s’agit là d’une

association entre une molécule polyfonctionnelle et
une phase stationnaire comportant des sites
stériquement définis et de capacité d’échange
multiple.
 Les divers constituants
de cette chromatographie
Phase stationnaire

Elle correspond généralement aux

billes pleine qui sont recouverts d’un
bras espaceur au bout du quel est
porté de façon covalente un atome du
nickel.

Ce bras espaceur correspond à une

molécule d’acide nitriloacétique qui fixe
de façon covalente un atome du nickel qui
permet aux molécules tels les protéines qui
sont beaucoup plus grand que le nickel de
pouvoir accéder aux billes de la phase
stationnaire.

 
Histidine?

C’est un résidu d’acide aminé qui

rentre dans la composition de très
nombreuse protéines. Or que le
réassemblage de ces histidines reliées
par des liaisons peptidiques nous
donnent une chaine peptidique ou
une chaine polyhistidine.
Pourquoi l’imidazole?

Le noyau imidazole qui constitue

la chaine latérale de l’histidine
peut reconnaitre de façon très
spécifique l’atome du nickel,
donc l’histidine est
particulièrement adaptée à cette
méthode.
Divers étapes de séparation
Phase mobile
 05
chromatographie d’affinité de
cellules
Sur quel principe se repose cette
chromatographie?

L’application d’une force mécanique

permet de libérer jusqu’à 90% des
cellules capturées mais elle altère
souvent la viabilité des cellules.
L’utilisation d’un compétiteur chimique
est une méthode plus douce pour libérer
les cellules mais la fraction de cellules
libérées est souvent insuffisante.
 Il existe de nombreuses techniques de tri cellulaire, dont
certaines utilisées pour des applications thérapeutiques.
Cependant aucune à ce jour n’est capable de trier des
cellules à l’échelle industrielle. Nous proposons donc de
développer une technique de tri par affinité pour des
applications cliniques, pouvant aussi traiter des volumes
importants (jusqu’à quelques centaines de litres), et
industrialisable.
 Méthode
tri cellulaire
La suspension cellulaire de départ contenant différents
types cellulaires s’écoule dans une colonne remplie de
billes fonctionnalisées avec un anticorps reconnaissant
spécifiquement les cellules d’intérêt. Les cellules ne
portant pas l’antigène ciblé restent en solution, alors
que les cellules d’intérêts se fixent à la surface des
billes. La colonne est rincée avec une solution tampon
afin d’éliminer les cellules restées en solution. Les
billes utilisées ne sont pas solides mais ce sont des
billes poreuses constituées d’alginate, un copolymère
naturel issu d’algues brunes marines. Il est composé de
deux types de sucres : le β-D-mannuronate (noté M) et
le α-L-guluronate (noté G)
 Comment ça fonctionne?

Pour cela la propriété de

déstabilisation du gel d’alginate en
présence de chélatant du calcium
est utilisée.
Favoriser une bonne pureté de la
séparation. Ceci nous indique aussi qu’il
existe un approvisionnement en alginate
répondant aux critères de qualité du
domaine médical et que ce n’est pas un
matériau dont l’utilisation à grande
échelle pose problème.
 06
Chromatographie liquide à haute
performance
Définition La chromatographie HPLC est une technique d’analyse qui
permet l'identification, la quantification et la séparation de
composés chimiques dans un mélange liquide.
C’est une forme hautement améliorée de chromatographie sur
colonne en exerçant sur la phase mobile une forte pression, ce
qui rend la technique beaucoup plus rapide et precis par rapport
à la chromatographie sur colonne.
Principe
 HPLC en phase normale HPLC en phase inversée

L'inconvénient de la phase normale, c'est la détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un
manque de reproductibilité des séparations. Ce qui implique que La CLHP en phase inversée est la forme la plus
 Domaines d’application
Les domaines d’utilisation de la chromatographie en phase liquide sont essentiellement :

Pharmaceutique: Environnement:
Þ Contrôler les impuretés dans un médicament. Þ L’identification de quelques composés dans les
Þ Contrôler la matière première et la stabilité des extraits de plantes.
médicaments. Þ Analyse des contaminants dans les eaux résiduair
Þ La pétrochimie.

Agroalimentaire:
Þ Contrôler les contaminants et les additifs dans une matrice alimentaire
Þ Contrôler la qualité et la sécurité alimentaire
Þ Analyse qualitative et quantitative des éléments dans les aliments
Þ Contrôler les médicaments vétérinaires (antibiotiques).
 07
Chromatographie d’affinité à haute
performance
La chromatographie d'affinité haute performance
(HPAC) est un type de chromatographie d'affinité qui Définition
permet de purifier les composés dans un complexe,
c’est une technique qui utilise un agent biologiquement
apparentée en tant que phase stationnaire dans un
système HPLC.
 Support

l'HPAC utilise des supports rigides adaptés au

travail en HPLC tels que la silice ou le verre frité à
diamètre étroit, des matériaux à base de perfusion
pour fournir des séparations rapides et efficaces.

Ligand
Des divers types d'agents de liaison qui
peuvent être utilisée pour cette méthode,
notamment des anticorps, des protéines, des
enzymes, des protéines de transport, des lipides,
des antigènes …

.
 Principe
La HPAC est basée sur les
interactions spécifiques et
réversibles qui se
produisent entre de
nombreux agents de liaison
biologiques et leurs cibles
qui sont capturée et retenue
lors de son passage dans la
colonne, ces interactions
sont généralement assez
fortes permettant
l'utilisation de cette
chromatographie dans la
purification et l'analyse de
composés cible dans des
échantillons complexes.
 Domaines d’application

La chromatographie d'affinité est un outil bioanalytique puissant pour la purification ou l'isolement de

composés biologiques complexes, elle a également connu une croissance considérable dans des divers domaines
tels
que:
 la biochimie
 la chimie clinique
 la recherche pharmaceutique.

Cette chromatographie permet d’étudier les différents interactions de systèmes

biologiques, tel que les interactions de médicaments, d'hormones et d'autres substances avec des
protéines sériques, les interactions anticorps-antigène, la liaison d'enzymes avec des substrats ou des inhibiteurs
 Avantage
Chromatographie d’affinitée HPLC
la biospécificité et la nature hautement sélective de l'instrumentation, la rapidité et l'efficacité et
la chromatographie d'affinité. la résolution élevées.

HPAC

un caractère de séparation plus rapide et efficace

L'HPAC présente ainsi plusieurs avantages par rapport à la chromatographie d'affinité :

 un rendement beaucoup plus élevé à des débits considérables.
 la séparation de l'échantillon est plus rapide et peut être reproduite plus facilement.
 La capacité à réutiliser le même agent biologique pour de nombreuses études.
 Conclusion
la combinaison entre les deux méthodes a donnée naissance à
une nouvelle technique qui rassemble le caractère bio
spécifique de la chromatographie d'affinité avec la vitesse et la
résolution élevées obtenues en chromatographie liquide à haute
performance, est annoncé sous le nom de la chromatographie
d'affinité à haute performance CAHP qui permet une
purification rapide et efficace de molécules biologiquement
actives.