Classe BIO 1 A

GROUPE 3
ANDRIAMALAZA Valisoa Joelinirina Daniela #32
RAKOTONDRAVELONA Santatra Ariniaina #04
RAZAFINDRALAMBO Anjaranirina Yasmirah #33
RASOARINIAINA Fidellinah #12
ANDRIAMIHANINTSOA Lanto Oniniaina #21
RAMBONIMANANA Tiavintsoa Fandresena #38

La chromatographie d’affinité

La chromatographie est une technique séparative analytique et/ou préparative. Elle

consiste à faire migrer les constituants à séparer d’une phase stationnaire immobile, à
l’aide d’une phase mobile, liquide ou gazeuse, de nature différente.
La chromatographie d’affinité est une technique de chromatographie qui permet de
séparer un composé en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique
(greffé sur une matrice macromoléculaire) et son substrat, en l’occurrence la molécule
à isoler. La base de cette chromatographie repose sur l’interaction spécifique et
réversible qui peut exister entre deux molécules.

Principe
Le principe de cette technique consiste à préparer le gel d’affinité (résine), en fixant
l’effecteur (liguant) sur un support inerte. Une colonne est remplie de ce gel
d’affinité, on y fait passer la solution aqueuse contenant la molécule à purifier. La
molécule est retenue, alors que les contaminants en solution passent librement. On
s’assure d’éliminer tout résidu indésirable par des lavages à répétition. Finalement, la
molécule obtenue est éluée. Cela se fait en modifiant les conditions de milieu :
changement de pH, utilisation d’un dénaturant réversible ou on fait passer une solution
contenant un ligand ayant plus d’affinité avec la macromolécule retenue que le ligand
fixe.

Caractères de supports
Les supports utilisés dans la chromatographie d’affinité doivent posséder des
propriétés particulières :
 Etre insolubles dans l’eau
 Etre poreux
 Etre stables chimiquement et mécaniquement
 Porter des groupements fonctionnels réactifs permettant la fixation des
effecteurs

Effecteurs(ligand)
Un ligand est une molécule qui se lie de manière réversible à une macromolécule
ciblée, protéine ou acide nucléique. Toutes les substances capables de former des
complexes stables avec les molécules à isoler peuvent être utilisées comme effecteurs.
Ils sont choisis en fonction de la molécule à purifier.
 Pour la purification des enzymes
Des substances analogues de substrats
Des inhibiteurs réversibles
Des coenzymes
 En immunologie
Des antigènes
Des anticorps
 Pour l’étude des protéines réceptrices
Des hormones
Dans l’idéal, le ligand ne devrait avec d’affinité qu’avec une seule espèce moléculaire.
Il faut aussi utiliser une résine neutre pour éviter que des molécules autres que la
molécule cible viennent s’y fixer.
Les étapes de la chromatographie d’affinité
 Etape de fixation
Un ligand bispécifique est couplé par liaison covalente à une matrice ou résine à
chromatographie (dextrine, agarose) sans perdre son affinité pour le produit à
analyser. Le mélange de molécules contenant le composé à purifier est chargé dans
la colonne d’affinité. La molécule présentant une affinité pour le ligand utilisé
d’absorbe et reste fixée à la colonne.
 Étape de purification
On passer du tampon dans la colonne, toutes les molécules contaminant sont
éliminées et éluées tandis que la molécule d’intérêt reste liée au ligand.
 Etape d’élution
Cette étape consiste à défaire la liaison entre la molécule et le ligand. Pour cela, le
complexe molécule d’intérêt-résine doit être mis dans des conditions où
l’interaction ligand-molécule spécifique est moins stable. Cette étape peut être
réalisée de différentes façons
 Tampon de pH différent de celui ayant permis la charge donc changement
de l’état d’ionisation de la molécule donc on a la désorption.
 Tampon de pH ionique différent de celle ayant permis la charge donc
changement de conformation de la molécule
 Compétition avec un ligand libre (libération de la molécule d’intérêt par
compétition pour les sites de fixation).

Application de la chromatographie d’affinité

La chromatographie d’affinité est utilisée :
 En enzymologie, pour l’extraction d’enzymes et la purification d’extraits
enzymatiques
 En immunologie, pour la purification d’anticorps
 En protéinochimie, pour l’étude des protéines membranaires
 En biochimie, pour l’isolement des acides nucléiques

REMARQUE :
Dans ce document, nous avons vu la méthode de chromatographie dite par
colonne mais il existe une autre méthode beaucoup moins courante : la
méthode en cuve agitée (ou réacteur agité).
La méthode consiste à mettre dans un bécher avec agitateur magnétique la
résine et le mélange à séparer puis à mélanger le tout assez longtemps pour que
la molécule d’intérêt s’adsorbe.
La résine est récupérée par sédimentation, ou parfois par centrifugation ou par
filtration. Le surnageant ou filtrat contenant les molécules non-ciblées est
éliminé. La résine est ensuite lavée avec le solvant d’adsorption pour élimer
d’éventuelles traces de contaminants. La molécule d’intérêt est finalement
résorbée.
Cette méthode n’est presque plus utilisée qu’à l’échelle industrielle, car elle est
moins efficace et nécessite de manipuler la phase solide.