Synthèse chimique des oligonucléotides

La synthèse des oligonucléotides se déroule de manière cyclique et le même principe générale reste
le même pour tous les oligonucléotides existants

Les caractéristiques et étapes de la synthèse chimique des oligonucléotides sont les suivantes :
 L’oligonucléotide en cours de synthèse est fixé à un support solide et les différents réactifs
sont ajoutés en solutions en phase organique
 La synthèse se déroule dans le sens 3’ vers 5’. Il s’agit du sens inverse à celle de la synthèse
enzymatique qui est réalisée par l’adn polymérase.
 La synthèse est cyclique. Lors de la formation de l’oligonucléotide, à chaque cycle, un
nucléotide est ajouté
 La synthèse se fait en monobrin. Il est donc possible d’hybrider deux oligonucléotides
complémentaires après la synthèse.

Support solide
Avantages :
 Un rinçage suffit pour éliminer l’excédent de réactifs entre chaque étape de la synthèse.
 Il n’y a pas de purification intermédiaire nécessaire contrairement au support liquide qui
nécessite une filtration intermédiaire entre les étapes pour éliminer le surplus de réactifs.
 Possède déjà un nucléotide en 3’ accroché sur le support

Les phosphoramidites
Pour réaliser la synthèse d’un oligonucléotide, on utilise des nucléotides
modifiés : les phosphoramidites
Le nucléotide manque de réactivité et de sélectivité
Le nucléotide phosphoramidites possède différents groupements protecteurs
afin de contrôler les sites réactifs et ainsi s’assurer que le produit obtenu
corresponde bien à la séquence désirée

Le nucléotide se compose :
 En 3’, le groupement réactif de la phosphoramidites qui permet d’accélérer l’addition du
nucléotide modifié à l’extrémité 5’ libre du nucléotide précédent.
 Il y a présence d’un groupement protecteur cyanoéthyl
 En 5’, il y a un groupement protecteur diméthoxytrityl qui protège la nouvelle extrémité 5’
afin d’éviter une suraddition durant le couplage.
 Et pour finir un groupement protecteur acyl sur la base hétérocyclique qui protège le
groupement azoté de l’addition de phosphoramidites à ce niveau.

Le cycle de synthèse
Le cycle de synthèse correspond à l’addition d’un nucléotide à l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide en
cours d’élongation. Ce cycle se déroule en quatre étapes. Le solvant principal des réactions est
l’acétonitrile, il sert à rincer entre les réactions du cycle de synthèse.
1. Détritylation
On utilise un acide fort comme l’acide dichloroacétique. Il permet de cliver le groupement
diméthoxytrityl du groupement 5’ Oh de la dernière base ce qui crée un endroit où le nucléotide
pourra venir s’accrocher.
Rendement de la réaction de synthèse :
Le diméthoxytrityl libre, possède une forte absorbance à 498 nm dû à sa coloration orange-rouge
Cette propriété permet le suivi de la synthèse en quantifiant par spectrométrie UV-visible la quantité
de DMT au début de chaque cycle.
La quantité de DTM relargué correspond toujours à la quantité de nucléotides couplés durant la
précédente étape.
Il est donc possible d’établir un rendement à chaque début de cycle

1. Couplage
Se réalise entre l’extrémité 3’ de la phosphoramidites en solution avec l’extrémité 5’OH de la dernière
base présente sur le support.
Il se réalise avec l’aide d’un activateur qui est un acide faible.
2. Oxydation
Lors de la formation de la nouvelle liaison entre le nucléotide ajouté et celui de la chaine, une liaison
phosphite, triester p se forme mais est instable.
Il est nécessaire d’oxyder cette liaison phosphodiester P stable.
3. Capping
Le couplage des phosphoramidites est une réaction très efficace, cependant le rendement de celle-ci
n’est jamais exactement de 100%. Le capping est une étape qui protège les extrémité 5’ OH qui n’ont
pas réagi afin d’éviter qu’ils réagissent lors du prochain couplage et ne forment un oligonucléotide
mutant par délétion.
Le capping permet de bloquer la synthèse des oligonucléotides non couplés et sert à éviter d’avoir à
purifier des oligonucléotides de tailles ou de charges similaire.
4. Clivage et déprotection
Clivage de l’oligonucléotide à son support solide.
Déprotection des groupements protecteurs provenant de la synthèse et qu’il faut déprotéger.
Cette dernière ce déroule à 70°C en milieu basique, avec une solution d’AMA. Il s’agit d’un mélange
en volumen de 50% d’ammoniaque et de 50% de méthylamine. Avant de passer à l’étape suivante qui
est la purification de l’oligonucléotide, le tout est filtré afin de ne récupérer que l’oligonucléotide en
solution.
5. La purification des oligonucléotides
Une fois synthétisée, clivé de son support et déprotégé, les oligonucléotides ont besoin d’être purifiés.
Il peut être contaminé par diverses impuretés (par exemple des arrêts de la synthèse ou bien des
résidus de groupements protecteurs).
Pour cela, il existe différente technique :
 La précipitation : élimination des courts arrêts de synthèse ainsi que les résidus de
groupement protecteurs.
Cette dernière se fait par ajout de sel et d’éthanol.
Après centrifugation l’oligonucléotide cible est présent dans le culot et les impuretés dans le
surnageant.
Cette technique ne permet pas de séparer les arrêts de
synthèse de plus de 10 bases.
 La filtration sur gel : technique utilisée pour purifier des
oligonucléotides de petite taille de tous les sous-produits de
synthèse, de clivage et de déprotection pouvant être toxique.
  La chromatographie : technique de séparation des impuretés de l’oligonucléotide cible sur
base d’une différence d’affinité avec une phase stationnaire
2 techniques :
o Chromatographie inverse : séparation sur base de la
différence d’hydrophobicité.
Les oligonucléotides cibles possèdent généralement une
hydrophobicité plus importante.

o Chromatographie par échange d’ions : séparation sur base

de la différence du nombre de charge négative. Cette
technique est possible grâce à la liaison phosphodiester
chargée négativement des oligonucléotides ; Il est donc
possible de séparer des oligonucléotides sur base de leur
longueur.

Électrophorèse sur gel polyacrylamide :

Séparation sur base du poids moléculaire des espèces présentes.
Le mélange à séparer est déposé sur un gel de polyacrylamide où une différence
de potentiel est appliquée aux extrémités du gel.
Les oligonucléotides de longue taille diffuseront plus lentement dans le gel que
les oligonucléotides de petite taille.

6.Technique de quantification des oligonucléotides

Afin de quantifier les fractions d’oligonucléotides purifiés, il faut réaliser
une mesure spectrométrique.
L’avantage des oligonucléotides est qu’ils absorbent à 260 nm.

La loi de beer- lambert se calcule comme suit avec une absorbance à 260 nm

Production de substances immunogènes et de vaccins

La vaccination
Le principe de la vaccination consiste :
À administrer à un être vivant un principe actif capable d’induire une immunité spécifique vis-à-vis
d’un agent pathogène, ainsi qu’une mémoire immunitaire susceptible d’amplifier plus rapidement la
réponse immune qu’après primo-infection.
Les modalités d’obtention des vaccins ont connu une évolution importante au cours des dix dernières
années.
C’est sans doute dans le développement de vaccins viraux que ces méthodes ont pour l’instant connu
les plus grands développements, raison pour laquelle les infections virales représenteront une part
importante des exemples que nous choisirons.
Les vaccins
Un vaccin contre un virus doit ressembler au vrai virus à un point tel quel le système immunitaire s’y
trompe et développe une réponse qui sera efficace contre le virus
Le vaccin ne pourra être le virus lui-même, qui provoquerait la maladie, mais il doit conserver les sites
antigéniques qui se trouvent normalement à la surface extérieure du virus et qui sont responsable du
développement des anticorps protecteurs.

Les vaccins conventionnels :

Le virus ou bactérie tuée inactivée par des agents chimiques soigneusement contrôler pour qu’il
donne plus de maladie mais soit toujours spécifiquement antigénique.
Ces vaccins sont injectés et donnent une protection de relativement courte durée. Plusieurs doses
sont souvent nécessaires.

Ces vaccins sont produits à partir de souches sauvages virulentes cultivées sur :
 Des lignées cellulaires de rein de singe (cas de la polio)
 Des fibroblastes humains (cas de la rage)
 Œufs embryonnés (cas de la grippe)
Puis inactivés par :
 Des agents chimiques : formol
 Des agents physiques : chaleur, UV
Les vaccins inactivés contiennent souvent des adjuvants qui
stimulent les processus précoces de la reconnaissance immunitaire. Vésicules lipidiques, mélanges
des sels d’aluminium.

Inconvénient :
→Réponse immunitaire incomplète : car pas de multiplication de la souche virale vaccinale.
→Immunitaire moins durable : nécessite d’ajouter des adjuvants, plusieurs injections nécessaires et
des rappels.
→Cout élevé
→Allergisant

Le virus ou bactérie vivante mais atténuée (moins virulent)

Le microorganisme a subi des modifications génétiques contrôlées ou non.

Il ne donne plus de maladie mais se multiplie dans l’organisme (infection inapparente) et confère
donc une meilleure réponse immunitaire et une protection de longue durée, souvent après une seule
dose. Ces vaccins sont injectés ou pris par la bouche.

Avantages :
→Réponse immune complète car véritable multiplication de la
souche.
→Réponse immune durable
→Peu cher
Inconvénient
→Risque de virulence résiduelle
→Effet secondaire : fièvre, arthralgies
→Rougeole 1/1million d’encephalite
→Oreillon : 1/1million de méningite
→Instabilité génétique= mutants de réversion
Multiplication vaccinale du virus de la polio dans le tube digestif, révision par contamination e
l’environnement possible . Polio vaccinale 1 cas / 2,5 millions de doses.

Vaccins fragiles : chaine du froid indispensable

Les fragments du virus : résulte de la cassure du virus en morceaux ou de la synthèse de sous- unité
par génie génétique.

Les nouveaux vaccins ou synthétiques recombinants

Le vaccin protègerait plus longtemps, serait san risque, stable vis-à-vis de la chaleur, administration
facile et surtout bon marché.
Pour pouvoir développe de nouveaux vaccins il faut avoir déterminer la ou les protéines antigéniques
du virus utiliser qui vont susciter la formation d’anticorps neutralisant le virus mais également isolé le
ou les gènes correspondants.

Les techniques de biologie moléculaire ont conduit à identifier les protéines majeures contre
lesquelles la réponse immunitaire de l’hôte est dirigées
La réponse immune contre un petit nombre de protéine permet une protection complète
Le gène de cette ou ces protéines voir une séquence codant pour une petite fraction de celle-ci, peut
alors transféré dans un autre micro-organismes (virus ou bactéries) appelé vecteur.

Ce micro-organisme va, après administration à l’hôte , induire une réponse immune contre cette
protéine étrangère. Cette approche correspond à un deuxième type de vaccin recombinant

Antigène ou protéine purifiées (non produits par des bactéries recombinantes)

Herpersvirus (rhinotrachéite infectieuse bovine)

Ils contiennent actuellement uniquement certaines protéines de l’enveloppe virale.
Cette approche permet de limiter la part de protéines non nécessaires dans un vaccin et peut limiter
le nombre de réactions non désirable : comme les protéines internes au virus ou un substrat de
culture.
Il en est de même de vaccins bactériens produits à partir d’exotoxines inactivées.

Glycoprotéine de surface pure :

La protéine virale est produite en grandes quantités, grâce à l’introduction du gène correspondant
dans des bactéries, levures ou cellules animales

Cette protéine est ensuite purifiée

Ex : vaccin contre l’hépatite B

Agglomération de protéines virales

Les protéines virales sont agglomérées sur un support pour permettre une meilleure présentation au
système immunitaire

Les vaccins recombinants

On inclut dans l’adn d’un virus sans danger le gène de la protéine immunisante

Le virus vaccinal ainsi modifié prote la protéine intéressante dans son enveloppe , introduit dans
l’organisme , il va se multiplier et permettre l’immunisation contre la protéine de l’autre virus.

Le vaccin à ADN
Il est constitué de gènes insérés dans un vecteur qui codent pour des protéines spécifiques de l’agent
pathogène.

Elle est basée sur l’introduction dans les tissus cellulaires par bombardement ou par voie nasale d’un
plasmide purifié d’adn contenant une séquence codant pour un antigène donné

Après administration de l’adn , l’antigène est exprimé par les cellules transfectées induisant une
réponse immunitaire spécifique et mesurable
La cellule va donc externaliser l’antigène du vaccin et il y a aura reconnaissance

La réaction provoquée par un vaccin à ADN ressemble beaucoup à la réaction provoquée par un virus
Vivant mais sans les risques
Afin de renforcer la réponse immunitaire, différentes approches sont étudiées comme :
 La co-administration de cytokines
 La costimulation à partir de gènes spécifiques et l’adjonction de molécules de ciblage

Les travaux de recherche sur l’animal ont montré que la sécurité des vaccins à ADN était maîtrisée au
niveau de l’intégration potentielle dans le génome de l’hôte, de la production d’anticorps anti-ADN et
de l’induction possible d’une tolérance vis-à-vis de l’antigène exprimé

Les premiers essais clinique de vaccins à ADN, déjà réaliser chez l’homme aux stade des phases I et II
couvrent les infection par le VIH, les hépatites B et C , les infections à herpes virus , la tuberculose et
la malaria
La nouvelle approche de vaccination par des vaccins à ADN supporte des espoirs importants du fait
du faible coüt de fabrication des vaccins et de leurs stabilités à température ambiante.

Vaccins à ARNm
Il possède des problème de stabilité car l’arn se dégrade facilement sous l’effet de RNAse ou de
température

Avantage :
Particules non infectieuse et intégratives
Facilement dégradés par la machinerie cellulaire comme le sont les ARNm naturellement produit

Inconvénient :
Ne code que pour une protéines ou une partie de cette protéine donc l’immunité est dirigée
uniquement sur une protéines ou une partie de celle-ci
La purification des ARNm (synthèse à partir d’un plasmide) présente des micro-ARN

Principe :
L’arn m cide pour un antigène immunogène du virus ou de la bactérie contre laquelle on veut
vacciner
Les molécules sont portégée par des nanoparticules
On utilise des adjuvants pour augmenter la réponse immunitaire

Traitements antiviraux :
La chimiothérapie antivirale est confrontée à un problème difficile : c’est la cellule qui multiplie les
virus
Toute molécule affectant la multiplication du virus risque d’endommager la cellule infectée et les
cellules saines

En usage interne , tous les antiviraux sont virostatiques

Dans les infections latente l’antiviral n’agit qu’au moment des récurrences
Chaque étape du cycle de multiplication peut être une cible
Encore faut-il que la molécule soit plus toxique pour le virus que pour l’hôte
Les antiviraux tuent aussi les cellules qui les hébergent ainsi que les autres cellules normales
Il est donc nécessaire d’étudier la biologie et la structure des virus pour cerner les point d’attaques
potentiels qui sont spécifique du virus et n’existent pas dans la cellule normale

L’action de deux médicaments

Analogues de nucléosides
Ces analogues sont tronqué et une fois incorporés , ils arrêtent la synthèse de l’adn
Ils ont une action plus particulièrement sur la construction de l’adn viral que sur celle de l’adn
cellulaire

L’aciclovir est un des principaux médicaments antiviraux , il possède une très grande spécificité et
une faible toxicité , il a un champ d’action très restreint .
Ilest différents des autres car il est constitué d’une structure partielle de nucléoside car le sucre
cyclique est remplacé par une chaine ouverte

Mode d’action :
Il est converti en forme monophosphate , aciclo-GMP, par la thymine kinase virale , qui est bien plus
efficace dans la phosphorylation que la thymine kinase cellulaire.

Ensuite la forme monophosphate est phosphorylée en forme active triphosphate , aciclo-GTP par des
kinase cellulaires
La forme triphosphate agit en s’incorporant dans l’adn viral durant sa réplication ,bloquant la
polymérisation de ce dernier

L’AZT – traitement du SIDA ; appartient à la classe des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptases

inverse
Il s’agit d’un nucléoside analogue de la thymidine
Il est phosphorylé par la thymidine kinase cellulaire et transformé en nucléotide triphosphate
Cette étape est indispensable et nécessite un certain degré d’activité cellulaire
L’AZT triphosphate entre en compétition avec la thymidine triphosphate au site actif de la
transcriptase inverse et bloque l’élongation du génome virale

Il est utiliser pour la transcriptase inverse et très peu par les transcriptases cellulaire qu’il inhibe
moins
Il s’agit donc d’un inhibiteur compétitif relativement spécifique de la transcriptase inverse
On observe un blocage de l’infection de la cellule par le virus mais l’activité des cellules de
l’organisme est préservée
L’AZT empêche donc l’infection de nouvelles cellules mais est sans effets sur le réservoir de virus déjà
intégrés

La résistance est un problème difficile qui vient entraver l’efficacité des traitement . Cette résistance
est dues à des mutations dans la transcriptase inverse du virus

Utilités thérapeutique des ARNm

L’ARNm est une molécule insuffisamment stable pour les applications pharmaceutiques , étant donné
sa sensibilité à la dégradation rapide par les RNAse ubiquitaire

Les optimisations ont été obtenues par modifications d’éléments non codants ( coiffe , queu poly A et
régions non traduites)

L’ARNm synthétique généré par transcription in vitro à partir d’un modèle ADN linéaire est vite
apparu comme un système polyvalent de diffusion de l’information génétique pour induire la
production de peptides et de protéines par les cellules

L’ARNm synthétique est :

 Monobrin
 Contient un 5’ cap
 Des UTRs embrassant la région codante
 Une queue de 3 poly A
Ce qui leurs permet de ressembler à des molécules d’ARNm mature traitée naturellement

L’ARNm exogène pénètre dans la cellule :

Soit en passant directement à travers la membrane cytoplasmique
Soit par endocytose suivie d’un échappement endosomal (si délivré sous forme d’ARNm nus ou
formulés)
Soit entouré d’une vésicule lipidique

La traduction se produit dans le cytosol et la protéine dérivée de l’ARNm synthétique n’est pas
distinguable de la protéine traduite de l’ARNm endogène
La protéine subit des modifications post-traductionnelles et est acheminée vers des compartiments
subcellulaires, tels que la voie sécrétoire, la membrane cellulaire , le noyau , les mitochondries ou les
péroxysomes , via des séquences de ciblage ou des domaines transmembranaires
Finalement, la protéine est dégradée et des peptides sont présentés sur des complexes majeurs
d’histocompatibilité (CMH)

Utilisation des ARNm dans le traitement des cancers

Cette méthode comprend l’ingénierie des lymphocytes T et des cellules tueuses naturelles (NK) avec
des récepteurs antigénique, et son utilisation comme modèle pour les protéines immunologiquement
actives dans une variété de cellules immunitaires et non immunitaires

L’ARNm injectée est absorbé par lescellules locales , y compris les APCs et amenés au niveau du
cytoplasme pour la traduction

L’ARNm est utilisé pour la vaccination anticancéreuse ou

il délivre des antigènes cancéreux aux APC pour la
présentation sur les CMH 1 et 2

L’ARNm peut également stimuler l’activation

immunitaire inées en se liant aux CPR exprimés par les
APC
Les ARNm permette l’expresison de protéines
immunomodulatrices y compris les TLR , les récepteurs
de chimiokines
Les ARNm introduisent des récepteurs d’antigène tels
que les RAC et les TCR dans les lymphocyte

Utilisation des ARNm dans la vaccination préventive antivirales ou bactérienne

Le développement de l’ARN messager thérapeutique par nanoparticules liquides conduit à faciliter les
essaies cliniques , ce qui améliore l’efficacité de la modalité de traitement dans une large mesure
Des défis en matière de sécurité et d’effets indésirable en raison des réponses immunitaires
incontrôlées et des interventions pharmacologiques inappropriées pourraient limiter cette efficacité
énorme

Deux types de molécule d’ARN m présent dans des propriétés biologiques différentes ont été mis au
point pour une utilisation en tant que vaccins :

 Conventionnelles ou non réplicatifs : L’ARNm est semblable au cellulaire , la séquence

génétique de la protéine à exprimer est flanquée à chacune de ses extrémités 5 et 3 par une
séquence untranslated region (UTR)

L’ARN m possède comme avantage qu’il est une molécule simple à produire , petite et très
spécifique
 Cependant l’expression de cet ARNm est limitée et de nature transitoire , nécessitant
l’administration de doses élevé.
 Auto amplifiable ou réplicatifs
Le vecteur est le génome d’un autre virus ARN-positif , l’ensemble des gènes codant pour la
protéines non structurelles est essentielles , y compris l’ARN -polymérase , ARN dirigé est
conservé et le reste est remplacé par la séquence génétique de l’antigène à exprimer

Après réplication initiale du virus dans le cytoplasme les gènes sont exprimés ainsi que les
fragments qui codent l’antigène désiré

Grâce au processus d’autoréplication d’une seule molécules d’ARNm , de grands quantités

d’antigènes sont obtenues

Malgré l’utilisation des gènes d’autre virus , ceux-ci ne sont pas capable de former des
particules viables
Des concentrations plus faibles de ce virus sont nécessaires et donc aussi des quantité plus
faible de nanoparticules lipidiques qui les incluent , induisant des effets négatifs également
inférieurs à l’ARNm conventionnel
Ainsi, les vaccins de ce type à ARNm ne nécessitent que 0,1-1,0 μg pour obtenir une
protection totale, par rapport aux 10 μg chez les souris immunisées avec l’hémagglutinine
(HA) de la grippe.
En outre, les répliques d’ARN formées dans le processus d’amplification montrent sur la
surface cellulaire des modèles de reconnaissance qui augmentent la réponse immunitaire.
Bien que les deux types d’ARNm induisent une immunité humorale et cellulaire, l’ARNm
réplicatif détermine des niveaux plus élevés d’expression et de réponse immunitaire.
La fragilité et la dégradation physiologique rapide des molécules d’ARNm ont obligé à les
protéger pour pouvoir être administrées aux mammifères. La meilleure solution à ce
problème a été de les inclure dans une structure lipidique complexe d’environ 80 nm,
semblable au virus grippal, formant ce qu’on appelle des nanoparticules lipidiques

Définition de la biotechnologie végétale

C’est la technologie recouvrant toutes les interventions sur les organes , tissus , cellules , adn
végétaux
Cette étude à pour but de mieux maitriser et accélérer la production , d’améliorer les caractéristiques
pour la recherche ,l’agriculture et les produits industrielles

Application :
 Reproduction à l’identique par multiplication végétatives à partir de fragments de tissus
 Accélération des générations
 Sauvetage d’embryons interspécifiques produits lors de croisement entre espèces distantes
 Modification du nombre et de l’organisation des chromosomes
 Recombinaison entre génomes d’espèce différentes par croisement ou fusion de protoplastes
 Augmentation de la variabilité génétique en intervenant sur les organites du cytoplasme des
cellules
 Modification de l’information génétique au niveau de l’adn par mutagénèse ou transgénèse
 Sélection génétique assisté par des marqueurs
 Assurer la sécurité alimentaire d’une population
 Accroitre et stabiliser les rendement par la résistance
 Adapter les cultures aux contraintes climatiques
 Fabriquer des molécules dans un but thérapeutique