Centre Wallon de Biologie Industrielle

PROCEDES POST-FERMENTATION
DOWN-STREAM PROCESSING
Université de Liège - Faculté Universitaire des Sciences
Agronomiques de Gembloux

1
 Objectifs principaux des opérations en
aval des fermenteurs

a. Obtenir un taux de récupération élevé du produit

recherché avec le moins possible de contaminants
(attention, ne pas confondre taux de récupération élevé et
pureté élevée – la pureté d’un produit est une notion
variable liée à la nature du produit et à son économie).

b. Mettre en œuvre des techniques fiables, s’adaptant à de

faibles variations dans la nature et les propriétés physico-
chimiques du flux à traiter

2
 Moût fermenté

Microorganismes et
Elimination des insolubles insolubles
Produit en solution
Extraction Impuretés

Produit dilué

Concentration
Produit concentré

Purification

Fig. 1.1. Diverses phases de l’extraction

Produit pur d’un produit extracelllulaire
3
 Moût fermenté

Récupération des cellules Milieu

Rupture des parois cellulaires

Elimination des insolubles Parois cellulaires

Extraction Impuretés
Produit dilué
Concentration

Purification

Fig. 1.2. Diverses phases de l’extraction

Produit pur d’un produit intracellulaire
4
Caractéristiques des moûts de fermentation
-Concentration faible
-Biodégradabilité (enzymes, microorganismes)

Substances Concentration (g/l)

Glucose 50
Ethanol 70-120
Acides organiques (ac. acétique, citrique,…) 40-150
-amylase 20
Antibiotique 4-30
Riboflavine 10-15
Vitamine B12 0.02
Glutamate de sodium 35
Acétone-alcool butyrique 18-20
Lipide 10-30
SCP 30-50

Tabl. 1.1. Concentration typiques de produits de fermentation dans

les bouillons de fermentation 5
 Disruptions cellulaires

Opération « brutale et délicate »

Disruption mécanique

Ultrasons : actuellement petits volumes

bruits

6
 Presse de French et homogénéisateur

Fig 1.4. Configuration de la vanne de

Fig. 1.3. Schéma de la presse de French décharge d’un homogénéisateur du
type Manton-Gaulin

7
La suspension cellulaire est placée dans le cylindre, vanne fermée.
Après mise en place du piston, l’appareil est retourné, la vanne
ouverte et l’air contenu dans le cylindre est expulsé.

La vanne est alors refermée et l’ensemble placé sur une presse

hydraulique puissante qui, par l’intermédiaire du piston, soumet la
suspension à une pression importante (généralement supérieure à
1000kg/cm2). La vanne à aiguille est à nouveau ouverte et la
suspension est littéralement extrudée au travers de cet orifice.

Ce système présente divers inconvénients :

- Un échauffement parfois important du milieu (risque de

dénaturation des substances biochimiques)

- Une capacité très réduite (volume traité en une fois de l’ordre de 50

ml, débit à travers la vanne de l’ordre de quelque ml par minute)

- Système discontinu
8
Au niveau industriel, les homogénéisateurs de type Manton-
Gaulin, sont les appareils les plus répandus pour la disruption
cellulaire.

Ils se composent pour l’essentiel, d’une pompe haute-pression

équipée d’une vanne à orifice de décharge ajustable.

Lilly et ses collaborateurs ont étudié les performances d’un tel

système pour la disruption d’une levure de boulangerie. Ils ont
montré que la disruption cellulaire, mesurée par la proportion de
protéines solubles libérées, était indépendante de la concentration
en levure, était proportionnelle au nombre de passes dans
l’appareil et dépendait de la pression opératoire.
9
En fait, ils ont mis en évidence la loi suivante :

R 2.9
Log --------- = K N P
Rm

Où
R = proportion de protéines solubles libérées
Rm = proportion maximale de protéines solubles libérables
(ici 96 mg par g de levure)
N = nombre de passes
P = pression
K = constante dépendant de la configuration de la vanne de
décharge et de la température

10
 Moulins à billes

Divers types de moulins à billes, notamment utilisés dans l’industrie

de la peinture, ont été testés pour la disruption cellulaire.

Ces appareils sont généralement constitués d’une chambre

cylindrique comportant un arbre central équipés de plateaux
cylindriques régulièrement espacés. Les espaces annulaires
compris entre les plateaux, le rotor et la paroi de l’appareil sont
partiellement remplis de billes dont la granulométrie peut varier
d’une chambre à l’autre. Ce sont ces billes qui constituent l’agent
de broyage proprement dit.

A- cylindre
B- agitateur
C- séparateur
D- moteur
1&2 entrée et sortie des cellules
3&4 refroidissement agitateur
5&6 refroidissement du cylindre

Fig.1.5. Moulin à bille de Netzsch LM-20 11

 Pression

La presse-X due à Ebedo se compose d’un cylindre divisé en

deux parties séparées par un disque percé d’un petit orifice.

Une pâte cellulaire gelée est forcée un grand nombre de fois au

travers de l’orifice entre les deux parties du cylindre. La
disruption cellulaire qui en résulte est probablement due à la
déformation des organismes enrobés de glace (la glace subit
lors du passage de l’orifice des modifications cristallines). Cet
appareil est uniquement utilisé au laboratoire.

12
Fig. 1.6. Schéma de la presse –X
de Ebedo

13
Disruption non mécanique

La lyse physique

Les méthodes physiques de lyse cellulaire sont essentiellement

des techniques de laboratoire.

Ainsi, le refroidissement et la congélation lente de cellules suivis

de leur dégel (rupture de l’enveloppe cellulaire par des cristaux
de glace) se révèle en pratique une technique lente, coûteuse et
peu efficace.

Plus prometteuse mais encore inutilisé industriellement est la

technique du choc osmotique qui pourrait, dans certaines
conditions, conserver les cellules sous un forme viable tout en
les forçant à relâcher certaines enzymes de façon sélective.
14
 La lyse chimique

Certains détergents anioniques et cationiques, des alcalis et

divers solvants endommagent sérieusement les composants
lipoprotéiques de la membrane cellulaire conduisant à la lyse
cellulaire.

Ces agents chimiques cependant dénaturent généralement par la

même occasion le matériel endocellulaire. Seul l’extraction de
composés particulièrement résistants peut être envisagée par
ces techniques.

L’emploi d’antibiotiques (tyrocidine, amphotéricines) permet

d’accroître la perméabilité cellulaire des bactéries mais l’emploi
de ces agents est fort limité à cause de leur coût.

15
 La lyse enzymatique

Le lysosyme et d’autres enzymes du même type sont capables de

provoquer la lyse des bactéries gram-positives et, sous certaines
conditions, de bactéries gram-négatives. Certains antibiotiques
(pénicilline,…) peuvent interférer dans les étapes de synthèse
des parois cellulaires conduisant à des cellules anormales
particulièrement faciles à lyser.

Ces techniques prometteuses sont gravement handicapées par le

coût des agents utilisés.

16
 Séparations liquide-solide

Faisant suite à la disruption cellulaire, si elle a été effectuée, la

première étape du traitement des bouillons de fermentation consiste
généralement en une séparation liquide-solide dont le but peut être :
-de séparer le ou les produits recherchés des autres composés
indésirables tout en opérant une réduction importante du volume à
traiter;
-d’éliminer les débris cellulaires résultant de la disruption avant
d’extraire le ou les produits intracellulaires recherchés. On en
facilite ainsi la concentration et la purification en évitant, par
exemple, le colmatage des membranes d’ultrafiltration ou des
colonnes d’adsorption;
-de récupérer les cellules en tant que biomasse pouvant être utilisée
comme source de protéines (SCP), comme pied de levain dans
l’industrie alimentaire ou encore lors du démarrage de l’épuration
biologique de certaines eaux résiduaires;
-D’éliminer, par lavage multiétagé les traces de divers substrats
indésirables…
17
Différentes techniques

Décantation

Centrifugation

Filtration

Ultrafiltration

Moussage

18
 Sédimentation

Lors de la sédimentation, deux forces verticales agissent sur les

particules (que nous considérons sphériques et de diamètre
uniforme) :
dp3
-la force de gravité Fg = (p – f) g -------
6
-la force résultant du frottement visqueux fluide-particule
dp2 V2
FD = CD --------- f -------
4 2

avec CD = coefficient de traînée de la particule *

V = vitesse verticale relative fluide-particule

*Le coefficient de traînée dépend du régime hydrodynamique de l’écoulement vertical – voir cours
de génie chimique. Généralement, en sédimentation, on se trouve dans le régime de Stokes :
24 24µf
CD = ---- = -------- 19
Re
fVdp
La vitesse de sédimentation, ici la vitesse terminale de chute libre,
est atteinte lorsque les deux forces verticales agissant sur la
particule s’équilibrent :
2
dp3 dp2 Vg
Fg = FD => (p – f) g ------- = CD --------- f -------
6 4 2
p-f
D’ou en régime de Stokes : Vg = ---------- g dp2
18 µf

Il est clair que la vitesse de sédimentation, dont dépend

directement les performances du sédimenteur, est liée à l’intensité
de la force volumique (gravité) agissant sur les particules. D’où
l’idée d’accroître artificiellement cette force en plaçant le flux à
sédimenter dans un champ d’accélération supérieur à celui de la
pesanteur et plus particulièrement dans un champ d’accélération
centrifuge.
20
 Décantation

Bien que la sédimentation classique dans le champ de la pesanteur

soit peu utilisée en biotechnologie (sauf en épuration des eaux), il
est utile d’en rappeler les principes car ils sont à la base de la
définition des critères d’extrapolation pour la sédimentation
centrifuge.
Considérons le cas de la sédimentation discrète idéale dans un tank
ayant la forme d’un parallélépipède droit.

On définit, pour un type de particules donné (dp, p), un débit

critique Qc qui est celui pour lequel 50% des particules de type
considéré auront sédimenté dans le tank;

On montre facilement que :

Qc = 2 Vg A

Où Vg = vitesse de sédimentation dans le champ de la pesanteur

A = aire du tank de sédimentation 21
Fig. 1.7. Sédimentation idéale dans un tank parallélépipédique

22
Fig 1.8. Décanteur à traction par câbles

23
 Notions de sédimentation centrifuge

Rappelons qu’une particule animée d’un mouvement circulaire plan

autour d’un point est soumise à une accélération centripète :

= 2r
Où = vitesse angulaire de rotation
r = distance de la particule au centre de rotation

On caractérise parfois une telle accélération en nombre de G

 2r
G = ------
g
Dans un sédimenteur centrifuge, un bol tournant à grande vitesse
entraîne la masse liquide qu’il contient dans un mouvement de
rotation à vitesse angulaire quasi-identique à la sienne.
L’inertie des molécules liquides est généralement suffisamment
petite pour qu’elles ne dévient pas de leurs trajectoires circulaires.
Par contre, si le liquide contient des particules solides, celles-ci
verront se superposer au mouvement circulaire d’entraînement, un
mouvement radial tendant à les éloigner du centre de rotation. 24
Dans le sens radial, les particules sont soumises à deux forces : une
force centrifuge due à l’accélération et une force centripète
correspondant aux frottement visqueux. La vitesse de sédimentation
correspond à l’égalité de ces forces :
2
dp3 dp2 Vg
(p – f) --------  r = CD -------- -----
2

6 4 2

D’où, en régime de Stokes :

p-f 2
Vs = ---------  r dp2
18 µf
La notion de débit critique Qc peut aussi être induite pour des
sédimenteurs centrifuges et on écrit classiquement par analogie avec
l’expression obtenue en sédimentation discrète dans le champ de la
pesanteur :

Qc = 2 Vg 

Où Vg = vitesse de sédimentation dans le champ de la pesanteur

25
 = facteur sigma du sédimenteur centrifuge
Le facteur sigma du sédimenteur centrifuge correspond
physiquement à la surface A d’un sédimenteur classique fonctionnant
dans le champ de pesanteur terrestre et qui aurait les mêmes
performances que le sédimenteur centrifuge considéré.

Les deux principaux types de sédimenteurs centrifuges utilisés

industriellement sont la centrifugeuse à bol circulaire et la
centrifugeuse à disque.

Pour ces deux types d’appareils, le facteur sigma s’écrit

respectivement :
b 2
bc = --------- (3r + r2)
2
2g 2 1

2(N-1)(rb3-ra3) 2
cd = ---------------------------
2g t 
Idéalement, la notion de facteur sigma devrait fournir un élément
chiffré de comparaison entre des centrifugeuses de tailles et de types
différents. 26
Malheureusement, l’établissement des équations se base sur
nombre d’hypothèses simplificatrices qui ne sont, en pratique, que
partiellement applicables aux machines réelles (sédimentation
discrète, couche mince,…)

On s’accorde cependant pour dire que le facteur sigma fournit un

critère relativement correct d’extrapolation pour des centrifugeuses
d’un même type : * Il faut cependant être fort prudent et notamment n’appliquer
2 * la formule que pour des centrifugeuses ayant des vitesses de
Qc2 = Qc1 ---- rotation peu différentes. Sinon, il faut corriger le facteur
d’extrapolation (« scale-up factor »)
1
Remarquons en outre que la sédimentation centrifuge est, en
principe, favorisée par des particules de grand diamètre, une grande
différence de densité entre fluide et solide et une faible viscosité du
solide. Nous savons, malheureusement, que les particules
biologiques sont généralement à l’opposé de ces critères. La
sédimentation de telles particules est dès lors difficile et impose des
vitesse angulaires élevées et des centrifugeuses de rayon aussi
grand que possible. Ces facteurs sont cependant limités par la tenue
des matériaux. 27
 Equipements de sédimentation centrifuge

La centrifugeuse la plus simple se compose d’un simple bol tubulaire

suspendu à un moteur par l’intermédiaire d’un accouplement flexible.
Le guidage se fait par le bas à l’aide d’une garniture constituée d’un
métal doux, souvent du laiton. (Bien qu’il n’y ait, en principe, aucun
contact entre la solution à centrifuger et ce métal, des
contaminations au cuivre sont parfois observées avec des liquides
contenant des sels d’ammonium).

Ce type de centrifugeuse se rencontre surtout au niveau du

laboratoire ou du pilote. Son fonctionnement est discontinu (la
décharge des solides implique l’arrêt du système). On trouve des
modèles fournissant des accélérations comprises entre 15000 et
50000 g environ.

Le liquide est introduit axialement par le bas du bol. Les solides

sédimentent sur le bol tandis que le surnageant est récolté au
sommet du bol (attention au moussage et à la formation d’aérosol).
28
Fig. 1.9. Centrifugeuse à bol circulaire 29
A l’échelle industrielle, c’est la centrifugeuse à disque qui est
l’appareil le plus universellement répandu. Le liquide est introduit
dans la centrifugeuse à travers son axe central, il ressort par le
sommet de l’appareil après avoir traversé le jeu de cônes.
L’espacement faible entre ceux-ci favorise la sédimentation rapide
des solides qui glissent sur la surface des cônes et quittent la
centrifugeuse par des orifices percés à la périphérie du bol.

Fig. 1.10. Centrifugeuse à disques 30

Un dernier type d’équipement est la centrifugeuse à bol tubulaire
et à vis. Il s’agit d’un type de centrifugeuse particulièrement
adapté aux solides collants qui risqueraient d’obstruer
rapidement les orifices des centrifugeuses à disques. La vis
d’Archimède intérieure au bol tourne à une vitesse inférieure à ce
dernier et racle les solides sédimentés qui sortent dans la partie
tronconique de l’appareil.

Fig 1.11. Centrifugeuse à bol tubulaire et à vis

31
Fig 1.12. Bol clarificateur à chambres Fig 1.13. Centrifugeuse à disques et bol
concentriques (Westfalia) autodébourbeur à ouverture par piston
(Alfa Laval)
32
 Filtration

D’une façon générale, il faut savoir que les liquides de fermentation

ne sont pas très faciles à filtrer en raison notamment de la viscosité
du milieu, de la taille et de la nature des microorganismes.

Les gâteaux biologiques sont souvent très compressibles de sorte

qu’un accroissement de la pression de filtration ne se traduit
parfois que par un gain transitoire en débit de filtrat suivi
rapidement d’une chute importante de ce débit.

La nature filamenteuse ou collante de divers microorganismes

conduit souvent au colmatage rapide de la toile filtrante. Pour
toutes des raisons, il est courant d’utiliser des adjuvants de
filtration tel le Kieselguhr. Si ces adjuvants sont très utiles lorsque
le produit recherché se trouve en phase liquide, ils ne sont pas
sans inconvénients.

33
Non seulement les cellules ou les débris cellulaires mêlés au
Kieselguhr ne peuvent plus être utilisés pour l’alimentation
animale, mais les adjuvants utilisés adsorbent parfois
sélectivement certaines enzymes que l’on veut récupérer.

En filtration batch, le filtre-presse classique est l’équipement le

plus courant dans l’industrie biotechnologique (débâtissage
automatique)

En filtration continue, le filtre rotatif sous vide avec décharge soit à

couteau soit à fil est le plus répandu. Pour certaines applications
spécifiques, des filtres sous pression à décharge centrifuge
(Funda) sont parfois utilisés.

34
Fig 1.14. Filtre-presse
35
Fig 1.15. Filtre sous vide, à bande sans fin 36
Fig 1.16. Filtre à tambour rotatif, en enceinte fermée, sous pression

37
 Flottation

La séparation se fait dans un liquide contenant des particules

solides en suspension, comme par exemple des cellules
microbiennes. Ces dernières se fixent sur les bulles d’un gaz qui se
forment dans la suspension. La flottation des particules adhérentes
aux bulles permet de les éliminer sous forme de mousse.

Pratiquement, on injecte un gaz au fond du fermenteur. Comme les

moûts ont une constitution hétérogène, il se forme de la mousse à
l’interface gaz-liquide. Si l’on a ajouté des antimousses au cours de
la fermentation, on doit prévoir un apport de substances tensio-
actives. Les mousses doivent avoir un rapport gaz/liquide élevé pour
que, la mousse une fois cassée, on ait aussi peu de liquide, très
enrichi en cellules microbiennes.

38
 Substance cassant
la mousse

Mousse cassée riche en

mousse cellules bactériennes

liquide

gaz Substance tensio-active

Fig 1.17. Représentation schématique d’une séparation de cellules par flottation

Ce procédé est appelé microflottation. Le rapport entre la

concentration des particules dans la mousse cassée et celle de la
suspension d’origine définit le facteur de concentration. On exprime
plutôt les résultats sous forme d’un rapport d’enrichissement tenant
compte du nombre de particules dans le même volume de liquide
restant après enlèvement de la mousse. Ce rapport augmente
lorsqu’on ajoute des substances qui favorisent la fixation des
particules aux bulles (amidons ioniques, chlorure de cétylpyridinium,
sels minéraux, détergents cationiques). 39
La microfiltration et l’ultrafiltration tangentielle sur membrane

Les biotechnologies exigent de plus en plus des techniques de

séparation fines; on désire descendre de plus en plus souvent sous le
micron et parfois même jusqu’à quelques angström.

Le tableau ci-dessous reprend la classification des différentes

techniques de séparation sur membrane.

Technique Taille des particules Pressions mises en

oeuvre
Microfiltration (MF) 0.02 à 10 microns 1 à 5 kg/cm2

Ultrafiltration (UF) Macromolécules d’un PM 1 à 10 kg/cm2

> 500 Daltons
Osmose inverse (RO) Molécules, ions d’un PM 10 à 60 kg/cm2
< 500 Daltons

40
Les principaux types de membranes

Membranes homogènes : ces membranes possèdent une structure

poreuse identique sur tout leur épaisseur. Leur utilisation est surtout
réservée à la microfiltration car la taille des pores est trop importante
pour les autres techniques. Cette structure très fine sur toute
l’épaisseur entraînerait une perméabilité.

Membranes asymétriques : ces membranes présentent une couche

très dense et très fine (0.2 à 2 micron) qui réalise la séparation. Cette
couche est supportée par une structure macroporeuse (100 à 200
microns) beaucoup plus perméable ce qui permet d’obtenir des
débits de perméation beaucoup plus élevés.

Membranes écrans : ces membranes sont constituées d’une fine

pellicule de polycarbonate (15 microns) percée de pores bien
calibrés.

41
La microfiltration tangentielle

Les membranes de microfiltration sont des membranes relativement

poreuses et symétriques. Elles comportent des pores plus ou moins
cylindriques dont le diamètre moyen est défini avec grande
précision. Le seuil de coupure de ces membranes est en principe
précisément défini par la taille moyenne des pores (par ex : 0.22 µm
ou 0.45 µm).

On peut distinguer trois grand types commercialisés.

Les fibres Millipore préparés à partir d’esters de cellulose ou de

polymères fluorés selon un procédé qui n’est pas connu. La
microstructure de ces filtres ressemble à une éponge mais la
dimension des pores est ajustée avec grande précision. L’épaisseur
moyenne des membranes de ce type est d’environ 100µm. Leur
porosité est élevée, environ 80%.

42
Les filtres Nucleopore constitués d’un film de polycarbonate dense
irradié à l’aide de fragments de fission d’Uranium 235. La trace
laissée par la trajectoire de chaque particule donne naissance à un
pore après traitement à la soude. Pour éviter la superposition des
pores qui donnerait une dispersion importante des diamètres des
pores, le nombre de pores et donc la porosité de la membrane sont
limités drastiquement ( = 10%). Cependant, comme les pores sont
des capillaires parfaitement rectilignes et que la membrane est de
faible épaisseur (10µm) le débit nominal de ces filtres est équivalent
à celui des filtres Millipore, de l’ordre de 10.000 à 50.000 l/h m2 bar.

Les membranes Celgard sont formée à partir de films extrudés de

polypropylène. Au cours de l’extrusion du polymère, les lamelles
microcristallines en formation se placent parallèlement les unes aux
autres. Le film ainsi obtenu est alors étiré. Au cours de cette
opération, les lamelles sont écartées les unes des autres et donnent
naissance à une structure poreuse très caractéristique. Les
pression d’utilisation de ces membranes sont de l’ordre de
quelques bars. Récemment sont apparues des membranes
minérales (alumine frittée, oxyde de Zirconium sur support de
carbone) d’une haute résistance chimique et thermique. 43
Les appareils

Les appareils appelés généralement perméateurs ont été décrits

dans le cours de technique de séparation et de concentration des
produits. Rappelons les différents types : perméateurs à
membranes planes, perméateurs à membranes tubulaires,
perméateurs à fibres creuses, perméateurs à membranes spiralée.

Fig. 1.18. Module plan

44
 Fig 1.19. Ceramic element cutaway.
Membrane is inside 3mm circular channels

Fig. 1.20. Configuration monolithe ou multicanal 45

Fig. 1.21. Modèle tubulaire : vue latérale et
vue en coupe

46
Fig. 1.22. Module fibre creuse
 solution pressurisée (A), (B)

rétentat

membrane

solution (B)

Fig. 1.23. Diagramme schématique du procédé d’ultrafiltration sur membrane

47
Le nettoyage et la désinfection de la filtration à membranes

La percée de la technologie de membranes et la diversification

constante des différents domaines d'application, ont fait que les
facteurs de procédés et les conditions d'utilisation se sont
optimalisées progressivement.

Malgré cette évolution, il est primordial pour la détermination du

rendement de la filtration à membranes, que les procédures de
nettoyage et de désinfection soient exécutées en respectant les
prescriptions du fabricant avec le plus grand soin.

Les résidus logeant sur les membranes, suite à un nettoyage

insuffisant ou mauvais ont pour conséquence, une diminution du
temps de procédé et de capacité. Une désinfection inadéquate a
énormément d'influence sur la qualité de production.

48
Principaux facteurs relatifs au nettoyage des installations de
filtration

La dureté de l’eau : non pas pour le nettoyage, mais plutôt pour le

rinçage, il est indispensable que l'eau soit conforme à la loi. En
outre, il existe des limitations relatives à la teneur des éléments
chimiques tels que : le fer, le managenèse et le silicate.

Le temps de nettoyage : Le plus important dans la phase de

nettoyage, c'est le temps de contact entre le produit de nettoyage
et les résidus. Le temps de nettoyage diffère en fonction de la
nature du produit chimique.

La température de nettoyage : L'augmentation de la température

améliore l'effet du nettoyage. En général, on choisit pour les
résidus de graisse, une température supérieure à la température de
fusion.

49
Le profil et la vitesse du courant : L'épaisseur de la membrane
secondaire - formée par la polarisation de concentration en
surface de séparation laminaire de la membrane - dépend du
rapport entre la vitesse et la pression appliqués. Les résultats de
nettoyage sont d'autant plus efficaces que la pression est basse
et que la vitesse du courant est haute.

L’influence de la nature du produit de nettoyage : Il est bien connu

que pour l'élimination des résidus organiques, on utilise les
produits alcalins tandis que pour les matières inorganiques, les
produits acides.

Pour améliorer l'effet de nettoyage - spécialement pour les résidus

de graisse, protéines ou autres substances organiques, on ajoute
des mouillants et des complexants en différentes combinaisons
en phase alcaline.
Le choix de la procédure de nettoyage dépend de l'application en
question.
50
Critères en cas de mauvais fonctionnement

Pour chaque application et même pour chaque installation, il y a

divers phénomènes qui peuvent contribuer au mauvais
fonctionnement du nettoyage des membranes.

En tous cas, il faut :

- éviter l'injection d'air dans la solution de nettoyage

- utiliser des produits de nettoyage spécifiques

- désinfecter l'installation après et avant la production

51
 Parois

Cellules
Rupture
cellulaire

Extraits
. . Traitement Séparation
.. . thermique solide/liquide
...
. ..

Milieu de fermentation
(moût)

52
 Concentration et purification

Concentration

Ultrafiltration
Précipitation
Osmose inverse
Evaporation
Distillation

Purification

Résine échangeuse d’ions

Chromatographie d’affinité
Précipitation
Cristallisation
Solvant

53
Ultrafiltration

Concentration 10X

Voir membranes (autres parties)

54
Précipitation

Sels : (NH4)2SO4 : précipitation fractionnée

Très polluant
Na2SO4

Solvant : acétone, éthanol, méthanol, isopropanol

Ancienne technique peu utilisé

Précipitation des polymères haut poids moléculaires

Principe : les polymères de hauts poids moléculaires sont avides

d’eau et ils déshydratent les macromolécules en jouant sur des
interactions stériques avec leurs groupements hydrophiles.
Polymères : dextran, polyéthylène glycol (PEG)
Récupération du polymère : par passage sur une résine séphadex

Précipitation : point isoélectrique (peu utilisé) sauf pour les

métabolites (acide aminés)
55
Osmose inverse

Solution concentrée

eau

- concurrence de l’évaporation (multiples effets ou simple effet

(voir sucrerie))

- avantages : - température basse

-Moins d’énergie

-Coût des membranes élevé

56
 Résines échangeuse d’ions

Théorie : vue ailleurs

- résines anioniques ou cationiques

solution

reconditionnement
Fixation Décrochage
sur par action
résines du pH ou
condi- force
tionnées ionique

Solution enzymatique
ou métabolique

Utilisé pour les enzymes ou les métabolites 57

Chromatographie d’affinité
Principe : sur une matrice insoluble, sont fixé des ligands
spécifiques du produit à purifier dont on a pris soin de préserver
le(s) caractère(s) d’affinité pour celui-ci. Le produit est fixé sur la
matrice par interaction avec le ligand. On utilisera un éluant qui
aura une plus grande affinité pour le produit que le ligand ou on
jouera sur des conditions de milieu pour diminuer l’affinité entre le
ligand et le produit.

Exemple d’applications :
- Purification d’enzymes : le ligand peut être un cofacteur ou un
analogue du substrat
- Purification de glycoprotéines : le ligand peut être une lectine
(protéine ayant la capacité de se fixer spécifiquement à un résidu
glycosidique)
- Purification d’antigènes : le ligand peut être un anticorps
(l’inverse est également possible)
58
Autres chromatographies

Chromatographie d’adsorption non spécifique

Principe : les molécules sont séparées en fonction de leur affinité

surfacique pour l’adsorption (souvent l’hydroxyapatite)

Chromatographie hydrophobe

Principe : les molécules sont séparées en fonction de leur

capacité à interagir avec des groupements hydrophobes fixés sur
une matrice.

59
Extraction par solvant

L’extraction liquide-liquide est une technique bien connue en

génie chimique. Elle est utilisée assez couramment dans
l’industrie biochimique et plus spécialement dans la production
des antibiotiques. L’extracteur Podbielniaky est souvent
rencontré. Notons que les techniques d’extraction sont aussi très
souvent utilisées pour des productions à petite échelle (appareil
de Craig…)

Remarquons enfin que se développent depuis quelques années

des techniques d’extraction liquide-liquide utilisant deux phases
aqueuses immiscibles (dextran + Polyéthylène glycol). Ces
techniques pourraient se révéler utiles pour séparer des enzymes
où autres espèces chimiques sensibles ne supportant pas les
solvants organiques.

60
Distillation

Colonne à plateaux

61
Cristallisation

- Opération très performante

- Métabolite (acide glutamique, lysine, saccharose)

- Peu coûteuse

62
Conditionnement final du produit

- Sous forme liquide

- Sous forme solide

63
Sous forme liquide

-Facile à manipuler pour les industriels

-Maintenir la stabilité du produit

-Antimicrobiens (acide sorbique,…)

-Anti-protéases (protéines, viscosité (polyol, glycol,…))

-Stabilisateur de la structure (glycérol, substrats,…)

64
Sous forme sèche

-Atomisation

-Lyophilisation

-Fluidisation

65
 Enzymes à 10 euros le kilo

ultrafiltration Produits finis liquide

Moût ou atomisation (solide)
x10

. additifs
.
.. .
Centrifugation
...
. .. filtration Cellules (déchets)

66
 Enzymes à 100 - 250 euros le kilo

Moût R.E.I. solution liquide

. . atomisation
.. .
Centrifugation
...
. .. filtration Cellules (déchets)

67
 Enzymes à 500 - 2000 euros le kilo

ultrafiltration chromatographie
d’affinité
. .
.. . Centrifugation lyophilisation
... . .. Cellules (déchets) atomisation
filtration

parois

cellules broyage chromatographie

d’affinité
. .
.. . Centrifugation lyophilisation
... . . Moût atomisation
. filtration

68
 Métabolites à 3 - 5 euros le kilo

moût évaporation précipitation

. .
.. . Centrifugation solubilisation
... . . Cellules (déchets)
. filtration

cristallisation

Produits finis

Acide glutamique
lysine

69
 Métabolites à 20 - 25 euros le kilo

moût Extraction par évaporation

solvant
. .
.. . Centrifugation séchage
... . . Cellules (déchets) précipitation
. filtration

Antibiotique

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