Le réseau endomembranaire

Le réseau endomembranaire est composé d'un ensemble de compartiments intracellulaires (délimité

par la membrane plasmique). Nous avons donc l'enveloppe nucléaire (noyau) qui est en continuité
avec le réticulum endoplasmique. Il en existe deux types :

-> Le réticulum endoplasmique rugueux/granulaire qui possède beaucoup de ribosomes. Il sert à la

synthèse de protéines non-cytosoliques et à la maturation de ces protéines.

->le réticulum endoplasmique lisse/agranulaire qui n'a pas de ribosome. Quant à lui, il permet la
biosynthèse de lipides, le stockage de calcium, le métabolisme glucidique et la détoxification de la
cellule. Cela permet surtout à la synthèse de cholestérol, formation d'hormones stéroïdiennes, à
l'élongation des acides gras et à la formation des phospholipides membranaires + céramides.

Ensuite, nous avons l'appareil de Golgi qui n'est pas en continuité avec l'enveloppe nucléaire. Il est
formé de citernes/saccules (empilement de dictyosomes (également un empilement entre 5 à 10
saccules)). Ce qui faut vraiment comprendre aussi, c'est la face cis (convexe) et la face trans
(concave) avec la notion de cis golgien (face de formation) et de trans golgien (face de protéines).
Cela permet de comprendre le sens.

Ci-dessous est un petit croquis montrant le fonctionnement de l'appareil de Golgi de la face cis vers
la face trans.

 Cis (Protéine immature) |

 Réception vésicule |
 Modification N=glycosylation |
 Phosphorylation des mannoses |
 O-Glycosylation |
 Clivage des mannoses |
 Protéolyse |
 Sulfatation |
 Zone de tri trans (protéine spécifique)

Entre le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi, nous avons des déplacements antérogrades
(du Réticulum endo G/R vers l'appareil de Golgi (face cis) grâce à des vésicules de type COP II.

Ensuite, il y a des déplacements rétrogrades (mouvement inverse mais avec des vésicules de type
COP I. Les sécrétions possibles sont donc soit constitutives (protéines COP I, protéines solubles,
MEC…) ou provoquées (stockage, signal, hormones peptidiques….).

Enfin, pour les endosomes ou lysosomes, leur objectif est de dégrader des éléments étrangers.
L'endosome, provient d'une vésicule d'endocytose qui forme un endosome précoce (face trans
golgienne). Cela va ensuite aboutir à la formation de corps multi-vésiculaires qui vont fusionner pour
former l'endosome. Cet endosome va fusionner avec un lysosome ce qui va permettre la formation
d'un lysosome secondaire (qui crée un corps résiduel par la suite).

Leurs rôles est donc : la digestion, la protection, le renouvellement des organites (mitochondries), le
recyclage des métabolites (polypeptides), nutrition (acides aminés) et d'éliminer des composés
néfastes (exocytoses).
 Test le réseau endomembranaire

Le nom des trois manteaux les plus retrouvés permettant la formation des vésicules au niveau du
réseau endomembranaire sont (donnez les noms dans l’ordre du RE vers la membrane plasmique) :
 manteau de COPII
 manteau de COPI
 manteau de Clathrine
Le nom de la protéine permettant l’étranglement final pour permettre la formation de la vésicule
est la dynamine.

Cochez la/les réponses justes.

 Les ARNm sortent par les pores nucléaires pour se retrouver dans le cytosol où ils seront
traduits en protéines.
 La localisation finale d’une protéine peut parfois être prédite si sa séquence en acides aminés
est connue.
 Les protéines destinées aux lysosomes commencent leur traduction dans le cytosol puis sont
traduites au niveau du réticulum endoplasmique granuleux

Cochez la/les réponses justes.

 Les vésicules se formant au niveau du Golgi et retournant vers le réticulum endoplasmique se
forment grâce à des manteaux COPI.
 La séquence en acides aminés KDEL des protéines du réseau endomembranaire est une
séquence de localisation au réticulum endoplasmique.
 Des protéines spécifiques du réticulum endoplasmique peuvent se retrouver par transport
vésiculaire dans l’appareil de Golgi.
 La séquence KDEL lie des récepteurs transmembranaires spécifiques présents dans l’appareil
de Golgi. Cela permet leur retour vers le réticulum endoplasmique grâce aux manteaux COPI.
Le pH étant plus élevé dans le réticulum endoplasmique (RE), l’interaction récepteur/KDEL
n’est plus possible, cela libère la protéine contenant la séquence KDEL dans la lumière du RE.

Cochez la/les réponses justes.

 Une séquence peptidique précise d’une protéine transmembranaire doit être présente côté
cytosolique pour que les protéines internes du manteau les reconnaissent et que cela
permette l’assemblage du manteau et la formation d’une vésicule au niveau de cette
membrane. Cette séquence est appelée signal de sortie.
 L’activité GTPasique des petites GTPases monomériques est importante pour le détachement
du manteau d’une vésicule.
 Un manteau est constitué de plusieurs protéines.
 La clathrine est un triskelion constitué de 3 grandes et 3 petites sous-unités.
 Des GEF spécifiques permettent le recrutement aux membranes des GTPases monomériques
essentielles à la formation des manteaux.
Cochez la/les réponses justes.
 Les vésicules formées au niveau du réticulum endoplasmique fusionnent entre elles pour
former les agrégats vésiculaires tubulaires.
 Une vésicule formée au niveau cis-golgien peut fusionner avec les membranes du réticulum
endoplasmique.
 Une vésicule formée au niveau cis-golgien peut fusionner avec les saccules golgiens suivants.

Cochez la/les réponses justes.

 Une vésicule formée au niveau trans-golgien peut fusionner avec un endosome tardif.
 Une vésicule formée au niveau trans-golgien peut fusionner avec la membrane plasmique.
 Une vésicule formée au niveau d’une citerne médiane de l’appareil de Golgi peut fusionner
avec une citerne antérieure.

Cochez la/les réponses justes.

 Des petites GTPases monomériques sont essentielles pour un assemblage correct des
manteaux et la formation des vésicules.
 Il faut suffisamment d’éléments solubles et transmembranaires à transporter pour qu’une
vésicule puisse se former à l’aide d’un manteau.

Un organite est un compartiment cellulaire délimité par au moins une membrane et qui a une
fonction propre dans la cellule.
Le pulse-chasse :
Le pulse-chase est un protocole expérimental qui permet d’étudier un processus dynamique. Il
consiste à :
 faire un marquage court dans le temps (= pulse) en proposant un précurseur marqué au système à
étudier,
 puis suivre le devenir des molécules marquées au bout d’intervalles de temps variables ; pendant
ce temps variable (= chase, ou chasse), on fournit au système le même précurseur non marqué, de
façon à permettre au processus étudié de se poursuivre. Si le système expérimental ne permet pas
d’éliminer correctement le précurseur marqué à la fin du pulse, il suffit de fournir pendant la chasse
le précurseur non marqué en quantité abondante, de façon à provoquer l’utilisation préférentielle du
précurseur non marqué (par simple effet de dilution).

Immunofluorescence directe et indirecte :

Objectif : déterminer la présence ou non d'une protéine spécifique ainsi que sa localisation à l'aide de

fluorochromes.
Principe : utilisation d’un fluorochrome qui va se fixer de façon covalente à l’anticorps spécifique et
permettre la détection directe de l’antigène à analyser. Ou bien, on utilise un anticorps secondaire
conjugué à la fluorescéine qui apparaît en vert au microscope à fluorescence pour permettre de
localiser la protéine d'intérêt.

Immunoprécipitation :
La co-immunoprécipitation (également nommée « pull down ») est une méthode classique pour
étudier les interactions protéine-protéine : le principe repose sur le fait que lors de
l’immunoprécipitation d’une protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique, les protéines qui sont
associées à la protéine d’intérêt par des interactions protéine-protéine sont également précipitées
(Fig. 10). Le complexe immunoprécipité est ensuite soumis à une électrophorèse en gel de
polyacrylamide et les protéines partenaires de notre protéine d’intérêt peuvent alors être identifiées
par Western blot en utilisant des anticorps spécifiques.
Autoradiographie et coloration :

Figure 3 - Comparaison d’une coloration au bleu de Coomassie et d’une autoradiographie d’un gel
d’électrophorèse

L’échantillon testé est le résultat d’une immunoprécipitation de DBH (dopamine-β-hydroxylase)

humaine marquée lors de sa synthèse par l’utilisation de méthionine35S (ce marquage a été rendu
possible car la protéine a été synthétisée dans des œufs de Xénope, suite à l’injection dans cet œuf
de l’ARNm humain purifié codant pour la DBH). La séparation électrophorétique a été réalisée par
SDS-PAGE en présence de β-mercaptoéthanol. L’image 1 montre le résultat de la coloration du gel au
bleu de Coomassie et l’image 2 le résultat de l’autoradiographie du même gel. En coloration au bleu
de Coomassie, on constate la présence d’une bande très importante de masse moléculaire apparente
égale à 50 kDa environ. Cette bande correspond à la chaîne lourde des anticorps utilisés pour
l’immunoprécipitation et ne correspond donc pas à la protéine d’intérêt (de même pour la bande
d’environ 25 kDa de masse moléculaire apparente qui correspond à la chaîne légère des anticorps).
En revanche, par autoradiographie, seules les molécules marquées sont révélées avec une bande
largement majoritaire située à 73 kDa de masse moléculaire apparente, correspondant à la DBH (voir
Fig. 3). On remarquera que cette bande est invisible sur le gel coloré au bleu de Coomassie, ce qui
illustre bien la différence de sensibilité entre les méthodes de révélation disponibles. Les autres
bandes observées (plus faibles) correspondent soit à des produits de dégradation, soit à d’autres
protéines qui sont également reconnues par les anticorps utilisés, soit à des contaminants. En effet,
étant donné la sensibilité de l’autoradiographie, il faut très peu de contaminants pour voir apparaître
une bande.
Colonne A : marqueurs de masse moléculaire ; colonnes B et C : immunoprécipitation d’un
surnageant de culture d’ovocytes injectés avec le l’ARNm humain de DBH, coloration au bleu de
Coomassie (B) ou révélation par autoradiographie (C).