CHAPITRE Il : LA MUTAGENESE

La mutagenèse est l'introduction volontaire d'un changement dans la séquence nucléotidique d'un gène,
autrement dit d'une mutation. C'est une technique qui offre la possibilité d agir sur la relation entre la
séquence d'un gène et la fonction de la protéine qu'il code. La mutagenèse in vitro est. utiiisée aujourd'hui
d'une manière courante. Le schéma général de l'opération (fig.l), comporte .
 • Une étape de modification de la séquence Une étape de
transformation
• Une étape de sélection des mutations

La mutagenèse peut être aléatoire ou dirigée

11. LA MUTAGENESE ALEATOIRE

La mutagenèse aléatoire génère des mutations n' importe où dans l'ADN. Les mutants sont ensuite
triés. On peut générer des mutants in vivo ou in vitro. Dans le premier cas, les bactéries sont soumises
directement au traitement. Dans le deuxième cas, le plasmide portant le gène est purifié, Anodifié puis
réintroduit dans une nouvelle bactérie (fig.2),.
On peut utiliser des produits qui modifient les bases appelées des agents mutagènes ou utiliser des
enzymes.
1.1/. Utilisation d'aqents mutaqenèses
De nombreuses molécules abîment l'ADN et peuvent être utilisées pour effectuer de la mutagenèse.
 • Désamination des bases (fig.3)
Lorsque l'Adénine est désamirlée, on obtient de l'Hypoxantine (Cytosioe : Uracile), l'Hypoxcntine
provenant de l'Adénosine s'apparie avec la Cytosine au lieu de la Thyr.line. De même l'Uracile
provenant de ia désamination de la cytosine s'apparie avec l'Adénine au lieu de la Guanine.

Plusieurs molécules peuvent être utilisées pour désaminer les bases de l'ADN
- l'hydroxylamine désamine la cytosine et donc est responsable de transition GC 'vers AT.
- l'acide nitreux désamine la cytosine, l'adénine et la guanine. Il peut causer des transitions A"l- vers GC
comme des transitions GC vers AT. De plus il est peu spécifique et peut aussi causer

REMARQUE
La plupart des mutations sont réparées : les bases modifiées sont repérées par ies enzymes de réparation
de l'ADN, tout d'abord une glycosilase coupe la liaison sucre-base puis une AP-endonucléase coupe les
liaisons phosphodiesters, une ADN polymérase comble les trous. Cette réparation est due au fait que les
bases modifiées n'existant pas dans l'ADN, leur présence entraîne un mésappariement qui est reconnu par
les enzymes de réparation.

Alky!ation
Les agents alkylants ajoutent des groupes alkyls (CH , CH CH ....) aux bases. On peut citer l'éthyle
méthane sulfonate (EMS). Cette alkylation n'est souvent pas reconnue par les systèmes de réparation et
entraîne une différence d'appariement.

Irradiation UV (fig.4),
L'ADN absorbe à 260 nm du fait des doubles liaisons conjuguées présentes sur les bases. Les photons
absorbés augmentent l'énergie des bases et les doubles liaisons peuvent ré gir avec d'autres atomes
présents à proximité. L'altération la plus souvent rencontrée est la formation de dimère de pyrimidine
entre deux bases consécutives.
Les modifications des bases sont réparées et il n'y a généralement pas de mutation. Cepenaant, si la
réplication a lieu avant la réparation, la base modifiée peut servir de matrice à kjne base différente et ainsi
occasionner une mutation.

1.2/. Utilisation d'enzymes (fig.5)

21. LA MUTAGENESE DIRIGEE

La mutagenèse dirigée a pour objet de muter une séquence d’ADN à un endroit bien précis (un nucléotide
par exemple). Elle per et de modifier d’une manière prédéterminée la séquence d’un gène. Les techniques
de mutagenèse dirigée ont devenues simples et rapides depuis que des oligonucléotides de synthèse sont
disponibles.

Lorsqu’on veut changer une ou plusieurs bases dans un plasmide, on peut partir soit d’un ADN
simple brin soit d’un ADN double bri

2.1/. A partir d’un ADN imple brin (fig.6)

 Pour obtenir un DN simple brin on introduit dans le plasmide utilisé, une origine de réplication simple brin.
On utilise les rigines de réplication des phages M13 ou fl :

On hybride un oli onucléotide phosphorylé en 5’, comportant la mutation désirée en son centre. La
polymérisation du brin manquant amorcée par l’oligonucléotide est effectuée à l’aide d’une T4 DNA
polymérase et un ligation entre l’extrémité 5’ de l’oligonucléotide et le brin néosynthétisé est
éventuellement e ctuée avec la T4 DNA ligase. On est donc à ce stade en présence d’un hybride ADN
sauvage, AD muté.

Plusieurs techniqu s ont été trouvées pour éliminer le brin sauvage

1. Une première technique utilise lors de la polymérisation un a.-.alogue soufré d’un nucléotide. On
effectue ensuite une coupure par Nsi I qui ne coupe pas le brin muté, néosynthétisé et comportant
donÊ l’analogue soufré. Par contre, Nsi I coupe le brin matrice, sauvage qui ne comporte pas
d’analogue soufré. Nsi i reconnaissant uniquement 4 bases, le brin sauvage est toujours coupé en
plusieurs endroits. L’ADN est alors digérée par une exonucléase pour retirer tout le brin parental et
resynthétisé par la T4 DNA polymérase.

2. Une seconde technique (fig.7) consiste à préparer de l’ADN simple brin dans une souche
bactérienne dut-ung -.Ces souches dut-sont déficientes en UTPase et contiennent beaucoup d’UIP
qui rentre en compétition avec le TTP. Les souches ung – manquent d’UracyI Nenzyme qui
normalement enlève l’uracile incorporé dans l’ADN. Ainsi, les souches incorporent plusieurs
uraci}e.s dans l’ADN et donc dans le simple brin. Lors de la synthèse in vitro, I’UMP ne gène pas, il
n’est ni mutagène ni inhibiteur. Après hybridation de l’oligonucléotide et polymérisation, on
obtient donc un ADN hybride. Un brin muté et un brin sauvage contenant de l’uracile. Si cet hybride
est injecté dans u, .e souche ung+, les Uracyi Nglycosy !ases retirent les uraciles, produisant des
sites apuriniques. Ces sites bloquent la

Synthèse de l’ADN et seul le brin muté se réplique.

3. Une aute technique utilise deux oligonûcléotides, un pour la mutation et pour modifier le gène de
résistance, à l’antibiotique lui donnant ainsi une nouvelle spécificité, une résistance à un nouvel
antibiotique. Après hybridation avec les deux oligonucléotides et remplissage, la molécule hybride
est directement utilisée pour une transformation. Après une première réplication, on a deux
catégories de plasmides, sauvage et muté. Si on prépare les plasmides et qu’on effectue une
nouvelle transformation seule les plasmides mutés pourront se développer en présence de
l’aneibiotique.

Pour l’ensemble de ces techniques on utilisera in vitro une ADN polymérase n’ayant pas d’activité 5’3’
exonucléase. En effet cette activité occasionne un « remplacement de brin » par digestion du brin
néEosynthétisé en commençant par l’oligonucléotide. Un tel remplacement résulte en la perte de la
mutation introduite C’

2.21. A

Utilisation des techniques de PC en présence d’un oligonucléotide muté (fig.8),.

Une méthode utilise quatre oligonucléotides. On fait deux amplifications séparées chacune avec un
oligonucléotide externe et un oligonucléotide portant ta mutation. Les deux fragments obtenus
séparément sont ensuite amplifiés ensemble. Avec les deux amorces les plus externes. On digère ensuite
les deux extrémités par des enzymes de restriction et on ligue dans le plasmide original.
1