République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche scientifique

Université Abderrahmane Mira Bejaia

Faculté des Sciences de la Nature et de la vie
Département des Sciences alimentaires

Enzymologie fondamentale

Support pédagogique destiné aux étudiants de L3

«Alimentation, Nutrition Pathologie ».

Fait par ALOUI-BERKATI Salima

Année universitaire : 2020-2021

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 CHAPITRE III

PURIFICATION DES ENZYMES ET DOSAGE DE L’ACTIVITE

ENZYMZTIQUE

I. Introduction

La majeure partie des investigations biochimiques implique la purification du matériel d'étude car les
substances ciblées doivent être débarrassées de tout contaminant, si caractérisation rigoureuse est
envisagée. Cela est souvent une tâche difficile, car une cellule typique renferme des substances qui se
ressemblent à l'égard de leurs propriétés physiques, chimiques et catalytiques. En outre le matériel d'intérêt
pourrait être instable et existerait en quantité infime. L'enzyme qui représente moins de 0,1 % de la matière
sèche de la cellule doit être ramenée à 98 % de pureté.

La purification d'une enzyme consiste à isoler, parmi les diverses molécules présentes dans l'extrait brut,
une molécule unique sous une forme biologiquement active et intacte (native). La séparation des groupes
de constituants cellulaires tels que les acides nucléiques, les protéines et les glucides est généralement
facile, car ils sont fondamentalement différents dans leur structure moléculaire. Par contre, l'isolement d'une
protéine unique dans une panoplie de protéines n'est pas toujours une tâche aisée. La méthode de
purification utilisée dépend toujours de la source de l'enzyme et des techniques analytiques disponibles. La
méthode de purification employée est étroitement dépendante des objectifs visés (analytiques, préparatifs,
conservation ou non des propriétés fonctionnelles, etc.). Selon que l'enzyme recherchée est intracellulaire
(cas rare) ou extra-cellulaire (cas le plus fréquent), le procédé d'extraction sera différent.

Aucune enzyme n'est purifiée au point d'homogénéité absolue. Même si les protéines contaminantes
constituent moins de 1 % de l'enzyme purifiée et échappent à la détection de nos meilleures méthodes; il y
a probablement des millions de molécules étrangères dans le mélange réactionnel. Généralement, ces
contaminants ne posent pas de problème si aucun d'eux n'est prépondérant ou s'ils n'interfèrent pas avec le
composé étudié.

II- Sources des enzymes : L’origine d’une protéine est généralement un tissu animal, végétale ou des
cellules microbiennes, exemple de l’amylase extraite des céréales, la même enzyme est extraite a partir de
la salive d’animal, l’invertase extraite à partir des levures.

 Tissu :

Avantages : il peut être très peu cher. L’enzyme y est exprimée en grande quantité et dans son
environnement, ce qui fait qu’elle est active.
Inconvénients : travailler avec du tissu comme source de matériel peut être indispensable, mais ce n'est
certes pas commode. Le tissu devra souvent être brisé (à la moulinette ou au Blender) et/ou traité à la
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collagénase pour en briser les fibres insolubles et très solides. Il peut être peu disponible ou à disponibilité
saisonnière (plantes).
 Cellules en culture :

Avantages : Les cellules en culture sont très proches, physiologiquement parlant, de ce qui se passe dans
un être vivant puisque elles sont exprimées dans leur contexte biologique, ce qui est important en terme de
fonctionnalité. Elles sont aussi généralement très faciles à traiter pour faire un extrait cellulaire.

Inconvénients : L’entretient d’une lignée cellulaire coûte cher (conditions de culture exigeant l'utilisation
de réactifs et de nutriments très onéreux) et prend beaucoup de temps. De plus, l’enzyme est produite en
très faible quantité.
 Les levures :

Avantages : les levures constituent une excellente source de matériel .Même si ce sont des organismes très
primitifs, ils sont proche des cellules eucaryotes. On y retrouvera donc des enzymes, comme les sérine-
thréonine kinases, que ne possèdent pas les vecteurs d'expression procaryotes. On peut en obtenir de
grandes quantités pour peu cher (les conditions de culture pour les levures sont élémentaires). La protéine
peut être bien structurées et fonctionnelle. Certaines levures, comme Picchia pastoris, peuvent permettre
l'expression d'énormes quantités de matériel.
Inconvénients : L’expression de la protéine n’est pas contrôlable facilement.
 Les bactéries : Le gène de la protéine est cloné et inséré dans un plasmide. La bactérie est
transformée et sélectionnée. Il suffit ensuite d’induire la production de la protéine en phase
exponentielle.

Avantages : L’expression est alors très forte, on obtient de grandes quantités de protéine. Un autre avantage
est que la culture est très rapide et ne coute rien. De plus, on peut mettre une «étiquette» à l’enzyme : la
plus fréquente est la queue polypeptidique (d’histidine). Ainsi, on peut rendre la protéine unique, elle peut
donc être purifiée en une seule étape car l’histidine, composée de doublets électroniques, réagit avec les
métaux (chromatographie d’affinité).
Inconvénients : L’environnement n’est pas le même, il peut manquer des protéines qui aident à la
structuration. Quand la protéine sort du ribosome, elle doit être assistée pour se conformer car sa séquence
n’est pas complète et qu’il y a une forte concentration en organites autour d’elle (risque de liaisons
hydrophobe). Ainsi, en purifiant la protéine à partir de bactéries, elle peut ne pas être fonctionnelle.
 Les virus :
Avantages : Il faut infecter des cellules humaines avec le génome viral. On obtient une très grande quantité
car il se multiplie très rapidement.
Inconvénients : Il faut faire attention car le virus peut infecter le biologiste.

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III- Lyse cellulaire et extraction

L’extraction consiste en la libération des enzymes des cellules ou constituants cellulaires, nécessitant donc
un éclatement de la paroi ou de la membrane cellulaire, par des procédés mécaniques, physiques ou
chimiques.

III-1-Composition d’un tampon d’extraction : Pour purifier une protéine il faut l’extraire de son milieu
naturel (cellule) dans une solution tampon pour garder le pH du lysat entre 7-8, pH proche du pH
physiologique. Plusieurs choix sont possibles selon la nature de la source.

La rupture cellulaire est réalisée à basse température (2-4°C) dans un tampon spécifique. Le choix du
tampon est fait en tenant compte de la solubilité de l'enzyme et de sa stabilité dans le tampon. La stabilité
de l'enzyme dépend non seulement du pH du tampon mais aussi de sa force ionique et de sa nature chimique.
Afin de stabiliser l'enzyme et de conserver ses propriétés catalytiques, des composés chimiques à de très
faibles concentrations (10-7 à 10-3 M) sont souvent ajoutés au tampon d'extraction. Pour cela on fabrique
certains milieux plus ou moins "physiologiques", comme le PBS ou le salin, qui possèdent ces propriétés.

Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Il
faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une
dénaturation et favorise l'oxydation, particulièrement des cystéines en cystine (i.e. formation d'un lien
disulfure). Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement sensibles car leur milieu naturel, le cytosol,
est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal une solubilisation dans le milieu ambiant qui est
oxydant. Une oxydation peut non seulement inactiver ou dénaturer les protéines, mais aussi causer leur
agrégation si la cystéine d'une protéine forme un lien disulfure avec celle d'une autre protéine. L'emploi
d'agents anti-oxydant comme le ß-mercapto-éthanol ou un des réactifs de Cleland (dithiothréitol ou
dithiotréitréol) est recommandé pour protéger ces protéines particulièrement sensibles. Ces deux derniers
remplacent de plus en plus souvent le ß-mercapto-éthanol, car ils sont beaucoup moins "odorants".

La présence d'EDTA, pour chelater les ions métalliques, peut être utile car ces derniers accélèrent les
réactions d'oxydation des protéines. Le travail à basse température,"sur glace", ralentit aussi les processus
de dénaturation. Les opérations d'homogénéisation mécanique et de centrifugation sont particulièrement à
surveiller, car elles causent souvent une surchauffe de l'extrait.
Quand on isole ou on travaille avec de faibles quantités de protéines, il est important d'éviter de contaminer
la préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la
préparation même, par exemple dans les lysosomes} qui sont brisés lors du broyage des cellules. Certains
tissus comme le pancréas en contiennent de grandes quantités. Elles peuvent aussi être exogènes, provenant
de l'extérieur, comme les mains, la salive, etc. Il existe de nombreuses préparations commerciales
d'inhibiteurs ayant des spécificités diverses par rapport au type de protéase. Ces inhibiteurs peuvent être
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des produits chimiques simples comme l'EDTA qui bloque les métalloprotéases. On retrouve aussi des
produits chimiques spécialisés, comme le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) qui inhibe les
protéases à sérine. Des inhibiteurs biologiques sont aussi employés, comme la pepstatine, la a 2-
macroglobuline, etc. On peut même se procurer des mélanges contenant un "cocktail" de divers inhibiteurs.

L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses
particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée.

III-2- Méthodes d’extraction : L’extraction a pour objectif de libéré des enzymes des cellules ou des
structures subcellulaires au sein desquelles ils se trouvent. Il est donc nécessaire de détruire selon le cas :
la paroi, la membrane cellulaire et les structure subcellulaire par des propriétés physiques et chimiques
efficaces sans pour autant trop dénaturantes. Les tissus peuvent être utilisés sous forme de fragment
organes, des coupe fines ou de broyat (obtenus après passage dans un broyeur type mixeur ménager).

Les différentes techniques d’extraction sont :

A-Méthodes mécaniques :

A1- Broyage mécanique : consiste à faire broyer (ou homogénéiser) le matériel biologique dans un
appareil muni d’un piston appelé homogénéisateur. Les broyeurs mécaniques sont utilisés pour réduire la
taille des particules de différents types de matériaux. Ils sont utilisés dans le cas où le matériel est sous
forme solide, sèche ou congelée. Il existe deux types de broyeurs:
 L’homogénéisateur de type Dounce Il ressemble à une éprouvette dans laquelle s’enfonce un
piston serré (Fig. 01). Le renflement du piston et la zone de broyage du mortier sont souvent en
verre fritté. Le passage des cellules dans l’espace très petit entre le piston et la paroi interne du tube
induit leur rupture.

 L’homogénéisateur de type Potter-Elvehjem Il s’agitd’un pilon composé d’une tige d’acier et un

renflement de téflon ainsi que d’un mortier de verre épais (Fig. 01).

Figure01 : Broyeurs mécaniques

A2- Presse de French : C’est un cylindre creux en métal dans lequel s’enfonce un piston métallique doué
de plusieurs o-rings d’un caoutchouc très solide(Fig. 02).Il est utilisé en expérimentation biologique pour
interrompre la membrane plasmique des cellules en les faisant passer à travers une valve étroite sous haute
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pression, ce qui déchire leur membrane. Plus que la pression est haute dans le cylindre, plus que la lyse est
totale. Cette technique est fiable, efficace et respecte l’activité des enzymes présentes dans les cellules
biologiques

Figure 02. Schéma de la presse de french

A3-Bombe à disruption : Cette technique consiste à traiter l’échantillon avec de l’azote à haute pression.
La pression force l’azote à se solubiliser dans les liquides. Par la suite, la pression est libérée tout d’un
coup; l’azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l’intérieur des cellules et les faits
éclatés.

Figure 03 : Bombe à disruption

A4- Billes de verre : consiste à détruire les cellules par l’action abrasive des billes de verre. Ce type de
broyage dégage beaucoup de chaleur. Il est donc nécessaire de travailler à froid (dans un bain de glace).

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 Figure 04 : Broyeur billes de verre

A5-Sonication (Ultrasons) : Elle consiste à détruire les cellules par les ultrasons qui sont des ondes dont
la gamme de fréquence se situe entre 20 kHz et plusieurs centaines de mégahertz. Cette gamme est trop
élevée pour que l’oreille humaine puisse la percevoir. La sonication est réalisée grâce à un appareil appelé
sonicateur qui permet de transformer l’énergie électrique en vibration mécanique longitudinale le long
d’une sonde. Cette dernière permet de casser les cellules biologiques en suspension. Il est indispensable de
travailler à basse température et d’effectuer des pauses entre les cycles de sonication afin d’éviter la
surchauffe de l’échantillon.

Figure 05 : Exemple de sonicateur

B- Méthodes physiques :
B1-Choc osmotique :
Le choc osmotique consiste à incuber les cellules fragiles dans une solution hypo-osmotique, ce qui permet
à l’eau d’entrer dans la cellule la fait gonfler jusqu’à ce que les membranes lipidiques se rompent et laissent
passer leur contenu dans le milieu. C’est une technique très douce et ne dénature pas les protéines.
L’éclatement des organites est l’inconvénient de cette technique.

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 Figure 06 : Choc osmotique

B2-Congélation-décongélation : des cycles de congélation (-20°C) et de décongélation (37°C) permettent

de détruire les membranes plasmiques des cellules surtout lorsqu’il s’agit d’une protéine ou d’une enzyme
bactérienne. .Durant la congélation des cristaux de glace se forment, ce qui provoque la désintégration de
la membrane cellulaire.
C- Lyse enzymatique : avec les levures, les plantes et les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire
qui protège la membrane plasmique. Pour ceci, les enzymes lytiques comme les cellulases, pectinases,
protéases, xylanases…peuvent être employées pour rompre les parois de ces cellules.

Le lysozyme est utilisé pour digérer le peptidoglycane des parois des bactéries. Des préparations
enzymatiques de lyticase (une endo-β1-3 glucanase hydrolysant les liaisons β1-3 des glucanes appelés
laminarine des parois des levures ) et/ou de zymolaseR (mélange d'enzymes, endo-β1-3 glucanases,
mannanases, protéases sécrétées par Arthrobacter luteus et hydrolysant les composants de paroi des
levures) sont commercialisées pour la digestion des parois des levures utilisées en biotechnologies, levure
de bière ...

D- Lyse chimique (par détergent) : Si les enzymes sont membranaires, on doit passer par une étape de
solubilisation ; les cellules sont détruites pour libérer les protéines en solution. La solubilisation des
protéines nécessite l’utilisation d’un détergent doux (Triton, Tween, etc., quelquefois déoxycholate) pour
les libérer en dissolvant les membranes.

L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon contrôlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui
libère des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc) qui peuvent attaquer et détruire les protéines
ou autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières doivent être prises si on travaille avec
des protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Certains tissus comme le pancréas et de foie
sont reconnus pour contenir de grandes quantités de ces enzymes, ce qui pose tout un défi quand on travaille
avec ces tissus. Une solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de
protéases qui sont soit physiologiques (inhibiteur de trypsine, antipaïne. leupeptine...) ou artificiels (E64,
PMSF...). Pour maximiser leur action, on les emploie souvent en mélange ("cocktails") à large spectre
d'action.
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 Figure 07 : Solubilisation des protéines membranaires par un détergents

IV-Clarification des extraits

A la fin de l’extraction la solution obtenue appelée extrait brute peut être filtré ou centrifugé afin d’enlever
les particules ou débris cellulaires, laissant ainsi la protéine d’intérêt dans le surnageant de la solution

-si la protéine d’intérêt est présente dans une organelle (mitochondrie, chloroplaste…) ou dans une
membrane, la centrifugation différentielle permettra d’enrichir cette composante cellulaire.

-La vitesse et la durée de centrifugation sont choisies pour que les composantes cellulaires plus denses
sédimentent dans le culot, enrichissant le surnageant avec la protéine d’intérêt

-Une deuxième centrifugation est effectuée pour sédimenter la fraction cellulaire contenant la protéine
étudiée

Centrifugation différentielle : se base sur les différences de vitesse de sédimentation entre particules qui
différent par densité et dimensions; la centrifugation sédimentera d’abord les particules les plus grandes,
puis les plus petites. La centrifugation différentielle consiste en plusieurs cycles de centrifugation à vitesses
croissantes. Dans un premier temps, les particules les plus massives vont sédimenter les premières sous la
forme d’un culot alors que les autres vont rester au niveau du surnageant. Ce dernier sera récupéré pour

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subir une deuxième centrifugation avec une vitesse et un temps plus importants pour sédimenter les
particules moyennes. Enfin, les plus petites particules peuvent être séparées du 2ème surnageant grâce une
autre centrifugation à haute vitesse (Fig 08).

Figure 08 : Principe de la centrifugation différentielle

V-Fractionnement et purification

La purification est un ensemble d’opération visant à enlever toutes les impuretés d’un extrait brut
contenant l’enzyme d’intérêt. Son objectif principal est d’avoir :

 Un maximum de rendement de l’enzyme

 Un maximum de pureté possible
 Un maximum de son activité catalytique

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La purification d’une protéine (enzyme, protéine de transport, hormone) devra mettre en œuvre plusieurs
techniques de fractionnment successives et/ou complémentaires. On utilise les différentes propriétés
physico-chimiques de la protéine étudiée pour l’isoler progressivement des autres substances cellulaires.

Les propriétés physico-chimiques exploitées dans les différentes techniques de séparation sont: la taille
moléculaire ; la solubilité et la charges ioniques ; l’affinité biologique pour d’autres molécules ... (tableau
ci-dessous)

V-1-Précipitation différentielle : L’une des étapes commune à quasi toutes les purifications est la
précipitation différentielle au sulfate d’ammonium (NH4)2SO4. C’est une technique qui repose sur les
différences de solubilité en présence de sels des différentes protéines. Une solution à 100% de sulfate
d’ammonium est une solution saturée. Chaque protéine a un seuil de précipitation. Une protéine est chargée
car elle interagit avec l’eau. Si l’on ajoute une faible concentration en ions, on observe le phénomène de
«#salting in#» qui augmente la solubilité des protéines. Par contre, si on augmente très fortement la
concentration en ions, on observe le «# salting out# » : les sels interagissent avec la protéine, et donc la
protéine devient insoluble car elle ne peut plus interagir avec l’eau. C’est donc l’action, par les sels, qui
isole les macromolécules de l’eau et les rendent insolubles (elles précipitent).

Il faut toutefois faire suivre cette étape d'une dialyse ou d'une ultrafiltration pour éliminer le sulfate
d'ammonium résiduel.

Figure 10 : Effet du sel sur la solubilité des protéines

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 Figure 11 : Exemple de précipitation d’un mélange de protéine

V-2- Dialyse : La dialyse est une technique qui permet de séparer des substances on utilisant leur capacité
respective à franchir les pores d’une membrane semi-perméable appelée membrane de dialyse. Les
membranes de dialyse se présentent sous forme d’un cylindre allongé qu’il faut fermer aux deux extrémités
et qui contiennent le liquide à dialyser. Ce cylindre prend alors le nom de « boudin de dialyse ». Il est placé
dans un récipient contenant le liquide contre lequel s’effectue la dialyse ou liquide contre dialyse (fig 12).

C’est le gradient de concentration du soluté de part et d’autre de la membrane qui gouverne la diffusion des
molécules : plus la solution a une concentration élevée plus les molécules traversent la membrane en
direction de la solution dont la concentration en solutés est la plus faible. L’utilisation de membranes semi-
perméables qui autorisent la diffusion des petites molécules (ions minéraux, oses, diholosides, aminoacides
...) et pas celle des macromolécules comme les protéines, permet de réaliser simplement des dessalages et
concentration de solutions protéiques.

Figure 12 : Principe de la dialyse

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V-3- Chromatographie d’affinité : La chromatographie d’affinité se base sur le principe de l’adsorption
spécifique: interaction entre une protéine bien déterminée à purifier et son ligand spécifique fixé sur une
matrice chromatographique. Un exemple classique est l’utilisation d’un anticorps qui reconnaît
spécifiquement la molécule à purifier. On distingue trois principales étapes :

 Etape de fixation : Le mélange de molécules contenant la protéine à purifié est déposé sur la
colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue par le
ligand greffé sur la phase stationnaire.
 Etape de purification : En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les
molécules contaminantes (non fixées) sont éliminées et éluées.
 Etape d'élution : La protéine purifiée peut être éluée, par exemple en utilisant un tampon d’élution
de haute force ionique, de pH différent, ou comportant une forte concentration d’une molécule
possédant également de l’affinité pour le ligand (libération de la molécule d’intérêt par compétition
pour les sites de fixation).

L’avantage de cette technique est sa très grande sélectivité potentielle, à tel point que son utilisation peut
parfois permettre une purification suffisante en une seule étape, ce qui est rarement le cas avec les autres
types de chromatographie. L’inconvénient de cette technique provient de la nécessité de posséder un ligand
adapté, lui-même suffisamment purifié.

La chromatographie d’affinité est donc très puissante par sa sélectivité importante, mais souvent plus lourde
et plus onéreuse à mettre en œuvre que d’autres types de chromatographie. Par ailleurs, elle n’est pas
adaptée à la purification de grandes quantités de molécules. En effet, la capacité est fonction du nombre de
sites disponibles sur la résine : lorsque ceux-ci sont saturés, les molécules en surnombre ne seront pas
purifiées.

Figure 13 : Principe de la chromatographie d’affinité

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V-4- Chromatographie échangeuse d’ions : La chromatographie d'échange d'ions sépare les protéines
en fonction de leur charge de surface nette, grâce à des interactions électrostatiques qui se produisent
entre les protéines et une phase stationnaire chargée. Deux types de chromatographie d'échange d'ions
sont à distinguer:

 Chromatographie d'échange d'anions (phase stationnaire chargée positivement qui se lie à des
protéines chargées négativement).
 Chromatographie d'échange de cations (phase stationnaire chargée négativement qui se lie à des
protéines chargées positivement).

Choix du type d'échangeur d'ions en fonction du pI de la protéine à séparer et du pH du tampon :

Considérons une protéine de pI = 5.

 1er cas : si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pI de la protéine (zone
bleue), celle-ci est chargée positivement. Il faut utiliser un échangeur de cations.
 2ème cas : si le pH du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pI de la protéine
(zone rouge), celle-ci est chargée négativement. Il faut utiliser un échangeur d'anions.

Figure 14: Variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH.

La chromatographie d'échange d'ions est souvent utilisée comme une étape intermédiaire dans un protocole
de purification des protéines. Cependant, elle peut donner une résolution élevée pour certaines protéines
lorsqu'elle est utilisée plus tôt ou plus tard au cours de la purification.

Si on prend l’exemple de la chromatographie échangeuse d’anions, la résine étant chargée positivement,

seules les molécules chargées négativement vont se fixer sur celle-ci. Les molécules neutres ou chargées
positivement ne vont pas s’accrocher et vont donc être éluées immédiatement (c’est le « non-fixé »).

L’élution des molécules fixées sur la résine peut alors être réalisée de deux manières :

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  En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge
que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.

 En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient
plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions). Il n'y a plus d'interaction
électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont
éluées (cette méthode peut induire une dénaturation des molécules biologiques (en particulier les
protéines) si les pH sont extrêmes).

Figure 15 : Principe de la chromatographie d’échange d’ions

V-5- Chromatographie d'exclusion : Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi

filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) est basé sur la séparation des
molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les
premières, Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur
migration est freinée. Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires.

Comme toutes les chromatographies, la filtration sur gel peut servir comme une étape de la purification
d'une protéine. Pour ce faire, il faut utiliser une résine de haute qualité permettant une résolution maximale.
Les filtrations sur gel sont souvent la dernière étape d'une purification de protéines car, pour être efficaces,
elles nécessitent une préparation relativement "propre" ayant un petit volume.

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 Figure 16 : Principe de la chromatographie d'exclusion

VI- Analyse de la pureté de l’enzyme

Pendant toutes les étapes de purification, la présence et la pureté de la protéine d’intérêt doivent être
déterminées. Les méthodes utilisées sont basées sur le principe de l’électrophorèse qui implique la
séparation des protéines via leur migration dans un gel (polyacrylamide) lorsqu’elles sont soumises à un
champ électrique. La Révélation des protéines et leur visualisation sur les supports d'électrophorèse
s'effectue par coloration au bleu de coomassie ou au nitrate d'argent.

La purification de la protéine est supposée être résolue, seulement lorsqu'une seule bande est obtenue à
partir d'électrophorèses analytiques telles que la Native-PAGE, la SDS- PAGE et l'isoélectrofocalisation
(IEF).

VI- 1- Électrophorèse sur gel polyacrylamide (PAGE) : sous l’action d’un champ électrique crée entre
deux électrodes sur le gel de polyacrylamide, les protéines migrent suivant leur taille et leurs charges.

Figure 17 : Principe de l’électrophorèse PAGE

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VI-2- Électrophorèse SDS-PAGE: Une variante de l’électrophorèse PAGE consiste à utiliser du SDS
(Sodium Dodécylsulfate) qui est un détergent anionique fort. Il a la propriété de défaire la structure
spatiale en se fixant sur les protéines et de les charger de la même façon (négativement) permettant ainsi de
les séparer uniquement en fonction de leur masse moléculaire. Les protéines sont dites dénaturées: elles ont
perdu leur structure tridimentionnelle native.

Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du SDS, on utilise un agent réducteur,
le β mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des protéines les rendant ainsi sous forme
monomérique.

Figure 18 : Principe de l’électrophorèse SDS- PAGE

VI-3- Isoélectrofocalisation : les protéines sont séparées selon leurs points isoélectriques (pI). Le mélange
de protéine est placé dans les puis d’un gel d’acrylamide contenant un gradient de pH sur toute sa longueur
(on ajoute des polymères avec des groupements ionisables pour avoir le gradient de pH). En soumettant les
protéines à un champ électrique elles migreront sur le gel selon leur charge :

 Les protéines chargées positivement migreront vers la cathode négative

 Les protéines chargées négativement migreront vers l’anode positive
Lorsque la protéine atteint une zone du gel où le pH = pI, elle sera neutre et arrêtera de migrer.

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 Figure 19 : Principe de l’isoélectrofocalisation

VI-4- Électrophorèse bidimensionnelle : L’électrophorèse bidimensionnelle ne fait que reprendre les

deux types d’électrophorèses présentées dans les deux paragraphes précédents, mais appliquées
successivement sur le même gel selon deux orientations différentes.

On commence par faire une isoélectrofocalisation permettant la séparation des protéines en fonction de leur
point isoélectrique. Ensuite, on réalise un SDS-PAGE à 90 degrés de la première migration, d’où le nom
d’électrophorèse bidimensionnelle. A l’issue de cette deuxième étape permettant de séparer les molécules
selon un second critère, leur, masse moléculaire on obtient des spots sur toute la surface du gel (Fig. 18).
Plusieurs centaines de spots peuvent ainsi être individualisés sur des gels de grande taille. Ce pouvoir de
résolution très intéressant est particulièrement mis à profit en génomique, domaine qui étudie l’expression
moléculaire du génome dans son ensemble.

Figure 20 : Principe de l’électrophorèse bidimensionnelle

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VII- Conservation : Les protéines purifiées sont souvent peu stables et doivent généralement être
conservées dans des conditions les protégeant de la dégradation. La conservation à basse température est
de rigueur. Certaines protéines sont beaucoup plus exigeantes que d'autres et doivent être gardées à -80°C
d’autres congelées en azote liquide (dans ce cas, il faut ajouter des cryoprotecteurs, souvent des sucres).
Cependant beaucoup se conservent aux alentours de -20°C.

Si les protéines sont stables sous forme sèche (en poudre), c'est la meilleure façon de les conserver. Il est
possible aussi de garder des protéines qui se dénaturent durant la congélation dans une solution de glycérol.
Cette méthode a l'avantage que le glycérol ne dénature pratiquement jamais les protéines et ne gèle pas aux
températures de l'ordre de -20°C. Certaines enzymes peuvent aussi être conservées dans une suspension de
cristaux de sulfate d'ammonium. Ces cristaux semblent stabiliser certaines protéines. Il convient aussi
d'éviter de répéter des cycles de congélation et de décongélation. La façon la plus commune d'éviter ce
problème est de congeler la préparation en petites fractions qui pourront être décongelées une à la fois. Le
rangement dans des solutions de glycérol ou des suspensions de sulfate d'ammonium permet aussi d'éviter
ce problème puisqu'elles restent liquides à -20°C; mais il faudra probablement se débarrasser de ce glycérol
ou de ce sulfate d'ammonium pour travailler avec ces protéines.

VIII. Suivi et caractérisation quantitative et qualitative de la purification :

Pour évaluer le succès d’un schéma de purification d’une protéine (enzyme) nous devons contrôler le
procédé à chaque étape en déterminant certains paramètres de purification et en effectuant une analyse par
éléctrophorése. Les critères d’une bonne purification sont une perte minimale de la protéine et une perte
maximale des contaminants (il ne faut pas trop perdre d'activité biologique tout en enrichissant les fractions
obtenues en la protéine voulue).
Si on s'aperçoit qu'une des étapes de purification provoque une perte substantielle d'activité ou de quantité
de la protéine, on doit remettre en question son utilité ou la qualité de son exécution.

1. Analyse par électrophorèse : La pureté d'une préparation de protéine peut être évaluée qualitativement
par électrophorèse à haute résolution ou focalisation isoélectrique. Si on n'aperçoit qu'une seule bande
protéique, on peut conclure que la préparation ne contient qu'une protéine. Cette évaluation qualitative peut
cependant être faussée si la protéine est contaminée par une ou plusieurs autres de même mobilité dans les
conditions d'électrophorèse ou de focalisation. Ces techniques permettent aussi de suivre la purification et
de voir si le nombre de protéines contaminantes diminue au fur et à mesure du processus pour finir,
idéalement, par une seule espèce protéique.

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2. Suivi de paramètres de purification : (Tableau de purification) : Les étapes de purification des
protéines sont généralement résumées dans un tableau de purification. Ce tableau sert à montrer le rôle et
l'efficacité de chaque étape dans le processus de purification. Il fait appel à des notions et à des termes
précis.

Pour construire un tel tableau, on dose à chaque étape de purification la quantité de protéines totales et
l'activité de la protéine en question. Généralement il s'agit d'une enzyme et son activité est exprimée en
unités enzymatiques. Sachant le volume de chaque fraction, la concentration des protéines totales et
l'activité, il devient facile de construire le tableau de purification.

 Protéine totale : La quantité de protéine présente dans une fraction après chaque étape est obtenue
en déterminant la concentration en protéine dans une partie de chaque fraction et en la multipliant
par le volume total de la fraction (protéines dans la fraction) x volume de la fraction (par exemple
mg/ml x ml).
 Activité enzymatique : l’activité enzymatique est proportionnelle à la quantité d’enzyme. A une
concentration en substrat constante, il existe un facteur de proportionnalité entre l’activité
enzymatique et la concentration en enzyme : AE = k x [E]. L'activité est la quantité de la protéine
exprimée non pas en termes de poids mais de capacité catalytique ou biologique. Après chaque
étape de purification en mesure l’activité de l’enzyme. L’activité enzymatique de la fraction est
obtenue en mesurant l’activité de l’enzyme dans le volume utilisé pour le dosage et en la multipliant
par le volume total de la fraction.

Unités de mesure de l’activité enzymatique : L’unité enzymatique est la quantité d’enzyme qui
catalyse la transformation d’une certaine quantité de substrat par unité de temps. Deux types d’unités sont
actuellement utilisés:

L’unité internationale (UI), correspond à la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une
micromole (µmole) de substrat par minute dans les conditions optimales (1 UI = 1 μmol.min–1);

Le katal (kat), unité du Système international correspond à la quantité d’enzyme qui catalyse la
transformation d’une mole de substrat par seconde. Le katal représente une quantité d'enzyme très élevée
par rapport aux réalités expérimentales d'un laboratoire. Seules les sous-unités millikatal, microkatal et
nanokatal sont utilisées.

(µkat (10-6 katal), nkat (10-9 katal) ou pkat (10-12 katal). 1 UI = 1 μmol.min–1 = 0,01667 μkat = 16,67
nka

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Le nombre de rotations ( kcat ) appelé également turnover number est le nombre de molécules de
𝐦𝐨𝐥𝐞 𝐝𝐞 𝐒
substrat transformées par molécule d'enzyme par seconde ( TON= ) (s-1)
𝐦𝐨𝐥𝐞 𝐝𝐞 𝐄 .𝐬

l'activité molaire,(ou activité moléculaire spécifique) est le nombre de moles de substrat transformé
𝐦𝐨𝐥𝐞 𝐝𝐞 𝐒
par mole d'enzyme par minute (kcat x 60) (AM = ) (mn-1).
𝐦𝐨𝐥𝐞 𝐄. 𝐦𝐧

 Activité spécifique : L'activité spécifique est l'activité par rapport à la quantité totale de l'ensemble
des protéines dans la préparation. Elle correspond au nombre de molécules de substrat transformées
par minute et par mg d’enzymes. L’activité spécifique est alors : AS = AE / masse de protéine
totale (mg). AS=μmol/min/mg de protéine=UI/mg de protéines.
C’est une mesure de la pureté enzymatique, elle augmente au cours de la purification et devient maximale
est constante quand l’enzyme est pure (l’AS augmente car l’AE reste constante et les autres protéines
diminuent).

 Rendement : Le rendement R de purification, est un paramètre quantitatif qui correspond à la

proportion, en %, de la quantité de la protéine purifiée qui reste par rapport à la quantité initiale.

R procédé = (activité de la fraction à la dernière étape) / (activité de l'extrait brut (première étape)) x 100

R étape = (activité de la fraction à l’étape n) / (activité de la fraction à l’étape n-1) x 100

 Taux de purification (degrés ou facteur de purification) : c’est un paramètre qualitatif. Le facteur

de purification est le nombre de fois qu'on a pu concentrer l'activité spécifique (par rapport à la
première étape) durant chacune des autres étapes de la procédure. Normalement cette valeur est de
plus en plus élevée au fur et à mesure des étapes. En effet la purification a justement pour but
d'obtenir une protéine de plus en plus pure, ayant donc une préparation dont l'activité spécifique de
plus en plus élevée. Il est obligatoirement de 1 pour la première étape, et augmente avec les
fractions. Ce taux de purification ne dépend que de la représentativité de l’enzyme à l’endroit où on
la cherche. On ne peut pas comparer la purification de 2 enzymes grâce à ce taux. On privilégie
toujours un bon taux de purification à un bon rendement.

T procédé= AS de la fraction purifiée à la dernière étape / AS de l'extrait brut.

T étape = AS de la fraction purifiée à l’étape n / AS de la fraction à l’étape n-1.

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Exemple d’un Un tableau de purification:

Les valeurs du tableau précédent sont obtenues avec les données suivantes. Pour chacune des fractions
qu'on a obtenues lors de la purification, on a mesuré le volume et prélevé des aliquotes pour doser les
protéines totales et l'activité de la protéine qu'on voulait isoler. Par exemple, l'homogénat du tableau a un
volume de 150 mL et contient 4 mg de protéines/mL et 40 U d'enzyme/mL. Cela permet d'obtenir la quantité
de protéines totale (150 mL x 4 mg/mL = 600 mg de protéines totales), l'activité totale (40 U/mL x 150 mL
= 6000 U) et l'activité spécifique (6000 U ÷ 600 mg = 10 U/mg). De la même façon on obtient les valeurs
des autres fractions. La purification et le rendement se déduisent ensuite facilement. Ainsi pour le
surnageant, on peut calculer la purification (25 U/mg ÷ 10 U/mg = 2.5X) et le rendement (3750 U ÷ 6000
U = 62.5%).

L’activité catalytique et la quantité de la protéine totale diminuent généralement à chaque étape

 L’activité enzymatique diminue à cause de l’existence de certains pertes qui est du à l’inactivation
ou des interactions non idéals avec les matériaux de la chromatographie ;
 Le taux des protéines totale diminue par ce que l’objectif est de retirer autant de protéine non
spécifique au cours d’une étape fructueuse, la perte des protéines non spécifique et beaucoup plus
grand que la perte de l’activité et donc l’activité spécifique augment même lorsque l’activité total
diminue ;

Le rendement diminue à chaque étape puisqu'il est inévitable qu'on ait des pertes de matériel à chacune.
Une purification est donc un "compromis" entre le désir d'obtenir une protéine la plus pure possible (facteur
de purification élevé) en quantité maximale (rendement élevé). En effet, chaque étape supplémentaire, qui
permet d'augmenter la pureté, cause des pertes de matériel, donc diminue le rendement. Au cours d'une
purification typique le facteur de purification augmente au fur et à mesure des étapes tandis que,
parallèlement, le rendement diminue.

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