RAPPEL

CHAPITRE 1 : Infrastructure et appareillage

CHAPITRE 2 : les différentes méthodes de stérilisation

Chapitre 3 : PREPARATION DES MILIEUX

La culture cellulaire est devenue une des techniques les plus utilisées en Sciences de
la vie et représente le terme général utilisé lorsque des cellules, tissus, organes d’un
animal ou d’une plante sont retirés et placés dans un environnement artificiel
propice à la croissance. Les conditions principales pour permettre aux cellules de
se diviser de manière optimale incluent: une température contrôlée, un substrat adapté
pour l’adhésion des cellules, un milieu de culture approprié et un incubateur
permettant le maintien d’un pH et de l’osmolarité corrects.

 L’étape la plus importante en culture cellulaire animale est la sélection d’un

milieu de culture approprié pour la culture in vitro. Un milieu de culture
est un liquide ou un gel conçu pour permettre la croissance de
microorganismes, de cellules ou de petites plantes. Le milieu de culture est
le facteur le plus complexe et le plus important pour le contrôle de la
croissance cellulaire optimale. Le milieu de culture contient généralement la
source d’énergie appropriée aux cellules et des composés qui régulent le cycle
cellulaire. Un milieu de culture typique est composé d’un complément
d’acides aminés, vitamines, sels minéraux, glucose et de sérum comme
source de facteurs de croissance, hormones, et facteurs d’adhésion. En
plus de l’apport de nutrients, le milieu de culture permet aussi le maintien du
pH et de l’osmolarité du système de culture.

I. Types de milieux de culture

• Les cellules animales peuvent être cultivées en utilisant soit un milieu

complètement naturel ou un milieu synthétique complété par des produits
naturels.
I.1. Milieux naturels

Un milieu naturel est constitué uniquement de fluides biologiques d’origine

naturelle. Le milieu naturel est très utile et convient à une large gamme de culture de
cellules animales. Mais le désavantage majeur de l’utilisation de milieux naturels est
le manque de reproductibilité car la composition exacte de ces milieux naturels
n’est généralement pas connue.

I.2. Milieux artificiels

• Les milieux artificiels ou synthétiques sont préparés artificiellement par

addition de plusieurs nutrients (organiques et inorganiques), de vitamines,
de sels, d’O2 et de CO2, de protéines sériques, de carbohydrates et de
cofacteurs. Différents milieux artificiels ont été développés pour les raisons
suivantes:

• Survie immédiate (solution saline équilibrée avec un pH et une osmolarité

spécifique)

• Survie prolongée (solution saline équilibrée supplémentée avec des

formulations variées de composés organiques et//ou de sérum)

• Croissance indéfinie

• Fonctions spécialisées.

Catégories de milieux artificiels.

• Les différents milieux artificiels développés pour la culture cellulaire peuvent

être groupés dans les quatre catégories suivantes:

1. Milieux contenant du sérum: Le Sérum Fœtal Bovin (FBS) est le supplément le

plus commun pour les milieux de culture animale. Il est utilisé comme supplément
de coût relativement faible pour obtenir un milieu de culture optimal. Ces
suppléments apportent des transporteurs ou des chélateurs pour les nutrients
labiles ou insolubles dans l’eau, des hormones et facteurs de croissance, des
inhibiteurs de protéases et, ils lient et neutralisent les composés toxiques.
2. Milieux sans sérum: La présence de sérum dans le milieu a plusieurs
désavantages et peut être la source de mauvaises interprétations dans les études
immunologiques. Pour éliminer ce problème, un nombre de milieux sans sérum ont
été développés. Ces milieux sont généralement formulés spécifiquement pour
supporter la culture d’un seul type cellulaire et incorporent des quantités définies de
facteurs de croissance purifiés, lipoprotéines et autres protéines normalement fournies
par le sérum. Ces milieux sont aussi appelés “milieux de culture définis” car les
composés de ces milieux sont connus de manière précise.

3. Milieux définis chimiquement: Ces milieux contiennent des composés

inorganiques ultra purs sans contamination et des ingrédients organiques. Ils
peuvent aussi contenir des additifs protéiques purs tels que des facteurs de
croissance. Ces constituants sont produits en bactéries ou en levures par génie
génétique avec addition de vitamines, cholestérol, acides aminés spécifiques et acides
gras.

4. Milieux sans protéines: Les milieux sans protéines ne contiennent aucune protéine
et ne contiennent que les constituants non protéiques nécessaires à la culture
cellulaire. Par rapport aux milieux supplémentés avec du sérum, l’utilisation de
milieux sans protéine permet une croissance cellulaire et une expression de
protéines supérieures et facilite la purification du produit exprimé . Les milieux
MEM, RPMI-1640 etc. sont sans protéine et la supplémentation en protéines est
fournie si nécessaire.

II. Composants de base des milieux

• Les milieux de culture contiennent un mélange d’acides aminés, glucose, sels,

vitamines et autres nutrients et sont disponibles chez de nombreux
fournisseurs soit sous forme de poudre soit sous forme liquide

• Les besoins pour ces composés varient en fonction des lignées cellulaires, de
ce fait, il existe un grand nombre de formulations. Chaque composant a une
fonction spécifique comme décrit ci-dessous:
 • Systèmes tampon

La régulation du pH est cruciale pour obtenir les conditions optimales de croissance et

est généralement obtenue grâce à l’un de ces deux systèmes tampon :

• Système tampon naturel

Système où le gaz CO2 équilibre le contenu en CO3/HCO3 du milieu de culture. Les

cultures utilisant un système tampon naturel doivent être maintenues à une
atmosphère contenant 5-10% CO2 dans l’air, généralement obtenu grâce à
l’utilisation d’un incubateur à CO2. Le système tampon naturel est généralement peu
coûteux et non toxique.

• HEPES

• Système tampon chimique utilisant un zwitterion. HEPES possède une

capacité tampon supérieure dans la zone de pH 7.2-7.4 et ne nécessite pas une
atmosphère gazeuse contrôlée. HEPES est relativement cher et toxique à des
concentrations élevées pour certains types cellulaires. HEPES augmente
également la sensibilité du milieu aux effets phototoxiques induit par
l’exposition aux lumières fluorescentes

• Rouge de Phénol

La plupart des milieux de culture disponibles commercialement contiennent du rouge

de Phénol comme indicateur de pH ce qui permet de contrôler constamment le
pH. Pendant la croissance cellulaire, le milieu change de couleur lorsque le pH
change du fait de la libération de métabolites par les cellules. A pH faible, le rouge
de phénol rend le milieu jaune alors qu’à des pH élevés le milieu tourne au violet.
Le milieu devrait être rouge vif pour un pH de 7.4 qui est optimum pour la
culture cellulaire. Cependant, il y a certains désavantages à l’utilisation du rouge de
phénol:

• Le rouge de phénol peut imiter l’action de certaines hormones stéroïdes, en

particulier, l’estrogène. Il est donc préférable d’utiliser un milieu sans rouge
de phénol pour les études sur cellules sensibles aux estrogènes tel que le tissu
mammaire.
 • La présence de rouge de phénol dans certaines formulations sans sérum
interfère avec l’homéostasie sodium-potassium. Cet effet peut être neutralisé
par l’introduction de sérum ou d’hormones hypophysaires bovines dans le
milieu.

• Le rouge de phénol interfère avec la détection dans les études en cytométrie de

flux.

• Sels minéraux

Les sels minéraux dans les milieux aident à maintenir l’équilibre osmotique des
cellules et aident à réguler le potentiel membranaire en apportant des ions sodium,
potassium et calcium

• Acides Aminés

Comme les acides aminés sont les composants des protéines, leur présence dans les
milieux de culture est donc indispensable. Les acides aminés essentiels doivent être
inclus dans le milieu de culture car les cellules ne peuvent pas les synthétiser elles-
mêmes. Ces acides aminés sont requis pour la prolifération cellulaire et leur
concentration détermine la densité cellulaire. La L-glutamine, un acide aminé
essentiel, est particulièrement importante en culture cellulaire. La L-glutamine
apporte de l’azote à NAD, NADPH et aux nucléotides et sert de source
secondaire d’énergie pour le métabolisme. La L-glutamine est un acide aminé
instable qui, avec le temps, est converti en une forme non utilisable par les cellules.
Elle doit donc être ajoutée au milieu juste avant l’utilisation .

-Des précautions doivent être prises quand la L-glutamine est ajoutée en quantité
plus importante que ce qui est nécessaire car sa dégradation induit une
accumulation d’ammoniac, et l’ammoniac a des effets délétères sur certaines
lignées cellulaires. Les concentrations de L-glutamine pour les milieux de culture de
cellules mammaliennes varient de 0.68 mM dans Medium 199 à 4mM dans le
Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium. Les milieux de culture d’Invertébrés peuvent
contenir jusqu’à 12.3 mM de L-glutamine. Les suppléments tel que glutamax sont
plus stables and peuvent remplacer la glutamine pour les cultures à long terme de
cellules à croissance lente.
 • Les acides aminés non-essentiels peuvent également être ajoutés au milieu de
culture pour remplacer ceux qui ont été épuisés pendant la croissance. La
supplémentation du milieu avec des acides aminés non-essentiels stimule la
croissance et prolonge la viabilité des cellules.

• Carbohydrates

Les carbohydrates sous la forme de sucres sont la source d’énergie majeure. La

plupart des milieux contiennent du glucose et du galactose, cependant, certains
contiennent du maltose et du fructose.

• Protéines et peptides

Les protéines et peptiques les plus couramment utilisés sont l’albumine, la

transferrine, et la fibronectine. Elles sont particulièrement importantes dans les
milieux sans sérum. Le sérum est une source riche en protéines dont l’albumine, la
transferrine, l’aprotinine, la fétuine, et la fibronectine. L’albumine est la protéine
majeure du sang à lier l’eau, les sels, les acides gras libres, les hormones et les
vitamines. Elle les transporte entre les tissues et les cellules. La capacité de liaison de
l’albumine en permet l’élimination convenable des substances toxiques du milieu
de culture. L’aprotinine est un agent protecteur dans les systèmes de culture de
cellules, stable à pH acide ou neutre. Elle est résistante aux températures élevées et à
la dégradation par les enzymes protéolytiques. L’aprotinine inhibe plusieurs sérine
protéases telle que la trypsine

• La fétuine est une glycoprotéine présente en grande quantité dans le sérum

fœtal ou de nouveaux nés par rapport au sérum d’adulte. C’est aussi un
inhibiteur de sérine protéases.

• La fibronectine est essentielle à l’adhésion cellulaire.

• La transferrine est une protéine de transport du fer qui permet l’apport

de fer à la membrane cellulaire.

• Acides gras et Lipides

Ils sont particulièrement importants dans les milieux sans sérum car généralement
fournis par l’ajout de sérum.
 • Vitamines

Beaucoup de vitamines sont essentielles à la croissance et prolifération cellulaire. Les

vitamines ne peuvent pas être synthétisées en quantité suffisante par les cellules et
sont donc des suppléments importants requis en culture cellulaire.

• Une fois de plus, le sérum est la source majeure de vitamines en culture

cellulaire, cependant, les milieux sont aussi enrichis avec différentes vitamines
afin d’être adaptés à une lignée cellulaire particulière. Les vitamines du groupe
B sont le plus souvent ajoutées pour stimuler la croissance.

• Oligo-éléments

Les oligo-éléments sont souvent ajoutés aux milieux sans sérum pour remplacer ceux
généralement trouvés dans le sérum. Les oligo-éléments tels que le cuivre, le zinc, le
sélénium et les intermédiaires de l’acide tricarboxylique sont des éléments chimiques
qui sont nécessaires en très faibles quantités pour une croissance cellulaire correcte.
Ces micro-nutrients sont essentiels pour de nombreux processus biologiques tels que
le maintien de la fonctionnalité des enzymes.

• Suppléments

Les milieux de croissance recommandés pour certaines lignées cellulaires

nécessitent des composants additionnels qui ne sont pas présents dans le milieu et
dans le sérum. Ces composants, suppléments, aident au maintien de la
prolifération et du métabolisme cellulaire normal. Bien que les suppléments tels
que les hormones, les facteurs de croissance et les substances de signalisation
soient nécessaires à la croissance normale de certaines lignées cellulaires, il est
toujours bon de prendre les précautions suivantes: l’addition de suppléments peut
changer l’osmolarité du milieu de croissance complet ce qui peut affecter
négativement la croissance cellulaire. Il est donc toujours important de revérifier
l’osmolarité après l’addition de suppléments. Pour la plupart des lignées
cellulaires l’osmolarité doit être entre 260 mOSM/kg et 320 mOSM/kg.

• La durée de vie du milieu de culture change après l’addition de suppléments.

Les milieux complets contenant des suppléments protéiques ont tendance à se
dégrader plus rapidement que les milieux de base.

•
• Antibiotiques

Bien que pas nécessaire à la croissance cellulaire, les antibiotiques sont souvent
utilisés pour contrôler la croissance des contaminants bactériens et fongiques.
L’utilisation routinière d’antibiotiques en culture cellulaire n’est pas
recommandée car les antibiotiques peuvent masquer les contaminations par les
mycoplasmes et les bactéries résistantes. De plus, les antibiotiques peuvent aussi
interférer avec le métabolisme de cellules sensibles.

• Le sérum dans les milieux

Le sérum est un mélange complexe d’albumines, de facteurs de croissance et

d’inhibiteurs de croissance. Le sérum est un des composants les plus importants
des milieux de culture et sert de source d’acides aminés, de protéines, de
vitamines (en particulier, les vitamines liposolubles telles que les vitamines A, D,
E, et K), de carbohydrates, de lipides, d’hormones, de facteurs de croissance, de
minéraux, et d’oligo-éléments. Le sérum provenant de fœtus ou de nouveaux nés
bovins est couramment utilisé pour soutenir la croissance des cellules en culture.
Le sérum fœtal est une source riche en facteurs de croissance et est approprié pour
le clonage de cellules et la croissance de cellules difficiles. Le sérum de nouveaux
nés(FCS) est utilisé dans les études d’inhibition du contact car il n’induit pas une
croissance cellulaire aussi rapide que le FBS. Les milieux de croissance normaux
contiennent généralement 2 à 10% de sérum. La supplémentation des milieux avec
du sérum a pour fonction :

• L’apport de nutrients de base (en solution et liés aux protéines).

• L’apport de facteurs de croissance et hormones impliqués dans la promotion

de la croissance et des fonctions spécifiques des cellules.

• L’apport de plusieurs protéines de liaison comme l’albumine, la transferrine,

qui peuvent transporter d’autres molécules dans les cellules. Par exemple,
l’albumine transporte les lipides, les vitamines, les hormones, etc. dans les
cellules.

• L’apport de protéines, comme la fibronectine, qui soutient l’adhésion

cellulaire au substrat.
• L’apport de facteurs de dissémination qui aident les cellules à se répandre
uniformément dans le flacon de culture avant de commencer à se diviser.

• L’apport d’inhibiteurs de protéases qui protègent les cellules de la protéolyse.

• L’apport de minéraux, comme Na+, K+, Zn2+, Fe2+, etc.

• L’augmentation de la viscosité du milieu qui protège les cellules de dommages

mécaniques pendant l’agitation des cultures en suspension.

• L’effet tampon.

Du fait de la présence simultanée de facteurs et d’inhibiteurs de croissance, le

rôle du sérum est très complexe. Malheureusement, en plus de servir
différentes fonctions, l’utilisation de sérum en culture cellulaire présente
plusieurs désavantages . (Table 2)

• Avantages

• Présence de facteurs de croissance et hormones qui stimulent la croissance et

les fonctions cellulaires

• Aide à l’adhésion cellulaire

• Agit comme facteur d’expansion

• Agit comme agent tampon permettant le maintien du pH du milieu de culture.

• Fonctionne comme protéine de liaison

• Minimise les dommages mécaniques causés par l’agitation des cultures

cellulaires en suspension

• Désavantages

• Manque d’uniformité dans la composition des différents sérums

• Peut contenir des inhibiteurs de croissance

• Augmente le risque de contamination

• La présence de sérum dans le milieu peut interférer avec la purification et
l’isolation de produits issus de la culture cellulaire