SOMMAIRE

SOMMAIRE........................................................................................................1

INTRODUCTION...............................................................................................2

I- Présentation des différents milieux de culture biologique...........................3

1- Différents types de milieux..........................................................................3

a- Milieux synthétiques ou définis..................................................................3

b- Milieux empiriques ou complexes..............................................................3

c - Milieu enrichis...........................................................................................4

II - Classification des milieux de culture...........................................................6

1- Classification des milieux de culture selon leur composition chimique.. 6

2- Classification des milieux de culture selon leur nature physique............7

3- Classification des milieux de culture selon leur utilisation......................8

4 - Classification des milieux de culture selon la méthode de préparation. 9

III- Constituants chimiques des milieux de culture.........................................9

CONCLUSION..................................................................................................12
INTRODUCTION

Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de

bactéries, de levures, de moisissures afin de permettre leur étude. En principe,
les cellules trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur
multiplication en grand nombre, rapidement, mais aussi parfois des éléments qui
permettront de privilégier un genre bactérien ou une famille. Ainsi, selon le but
de la culture, il est possible de placer les micro-organismes dans des conditions
optimales, ou tout à fait défavorables. Ceux-ci comprennent tous les milieux
normalement utilisés dans le laboratoire de diagnostic de microbiologie clinique
et pour l'examen de routine. Il se compose d'une base (agar-agar, eau, minéraux)
ainsi que d'un indicateur coloré de pH ou de réaction d'oxydoréduction pour
permettre de formuler des hypothèses sur le genre.

Notre étude portera sur trois axes majeurs que sont :

⁃ La présentation des différents milieux de culture biologique

⁃ La classification des milieux de culture

⁃ les constituants chimiques des milieux de culture.

I- Présentation des différents milieux de culture biologique.

1- Différents types de milieux

a- Milieux synthétiques ou définis

Composition connue exactement qualitativement et quantitativement. Ces

milieux sont utilisés essentiellement pour l'étude de besoins nutritifs d'un germe.
Peu sont utilisés couramment : Gélose pour auxanogramme, Citrate de
Simmons, Urée-Indole ... On les rencontre également pour la culture de micro-
organismes autotrophes chimio-lithotrophes telles que les cyanovacieres.

b- Milieux empiriques ou complexes

Composition connue partiellement car utilisation de matières premières plus ou

moins complexes : sérum, sang, peptone (hydrolysats pepsiques ou trypsiques de
matière organique - foie, viande, soja, caséine constituent la source azotée).

Milieux usuels : composition et préparation simple, peu coûteux et convenant à

un grand nombre de germes. Ex :

- Eau peptonnée, bouillon nutritif, dont les peptones sont simples, pour les
germes hétérotrophes ne présentant pas d'exigence particulière.
- TS, Columbia, Mueller-Hinton : peptones plus riches pour les germes plus
exigeants

Milieux enrichis : addition de suspensions riches en molécules organiques (sang,

sérum, extrait globulaire.). Cf plus loin.

Milieux sélectifs : contiennent des molécules empêchant la culture de certains

micro-organismes. Ils sont utilisés pour isoler les germes de produits poly-
microbiens. La nature des inhibiteurs est variable, il peut s’agir :

- de NaCI : milieu de Chapman à 75% pour Staphylococcus, bouillon hypersalé

à 65°% pour Enterococcus
- de sels biliaires (désoxycholate) : Mac Conkey, Hektoen pour
Enterobacteriaceae d’antibiotiques : gélose au sang + ANC (acide nalidixique,
colistine) pour les Strep tococcus.

- d'antiseptiques : gélose au cétrimide pour Pseudomonas Rma:

- On peut également augmenter la sélectivité des milieux en choisissant des

conditions de culture particulières.

Ex : la gélose au cétrimide placée à 42°C est plus sélective pour Pseudomonas

aeruginosa.

- On parle de milieu "électif" lorsqu'il ne contient pas d'agent inhibant mais qu'il
favorise la croissance d'un type de germes.

c - Milieu enrichis

- Milieu au sang frais : addition du sang défibriné stérile dans la gélose en

surfusion (~ 5%). Utilisation de sang de mouton indispensable pour le test de
camp) ou de cheval permet une meilleure expression de l'hémolyse de certains
Streptococcus du groupe D).

Intérêt :

- apport de tacteurs de croissance,

- activités peroxydase et catalase qui favorisent la croissance des germes qui en

sont dépourvus (Streptococcaceae),

- neutralisation de certains inhibiteurs contenus dans les peptones,

- lecture des caractères d'hémolyse dus à la présence de lécithinase =

acétylcholine estérase).

On parle d'hémolyse alpha (a) lorsqu'elle est incomplète (zone verdâtre autour
de la colonie), bêta (B) lorsqu'elle est totale, ou de souche non-hémolytique.
Limites : présence de transferrine qui peut mobiliser tout le fer disponible et
empêcher la croissance de certains.

- Milieu au sang cuit : préparation idem sang frais + chauffage 10 min à

75°C.
- Gélose chocolat : autoclavage d'un milieu de base + hémoglobine (milieu
moins riche que le précédent, souvent ajout de compléments poly-
vitaminiques)

Intérêts :

- la cuisson permet de libérer certains facteurs de croissance (telle que l'hémine

=

Précurseur de coenzyme, transporteur d'électrons des cytochromes ; NAD)

destruction de certains inhibiteurs libération du fer III de la transferrine.

- Jaune d'œuf : prélevée stérilement, la solution de jaune d'œuf est

additionnée aux milieux usuels pour permettre la recherche de la
lécithinase (milieu Baird-Parker pour Staphylococcus aureus)
- Lait : possibilité d'utiliser le lait, qui est stérile. Utilisé pour l'isolement et
le dénombrement des bactéries lactiques, pour la recherche de l'hydrolyse
de la caséine.

Avec la multiplication des analyses bactériologiques, se sont développés des

systèmes permettant d'associer rapidité, reproductibilité et faible coût : les
macro-galeries classiques ont été progressivement miniaturisées. On distingue
deux catégories de dispositifs :

- certains proposent un assemblage de milieux classiques prêts à l'emploi

disposés en mini tubes ou en compartiments juxtaposés dans un même
conditionnement.
Dans ce cas l'ensemencement se fait dans les mêmes conditions que pour la
galerie classique. Les temps d'incubation et la lecture sont équivalents d'autres
proposent un assemblage de cupules contenant des substrats déshydrates qui
sont régénérés avec la suspension de la bactérie à étudier.

Ces dispositifs nécessitent de travailler en conditions standardisées : densité et

quantité de l'inoculum, atmosphère d'incubation ...

La réduction du temps d'incubation est possible grâce au travail avec des

inoculum plus denses ou à l'utilisation de substrats artificiels

II - Classification des milieux de culture

Il existe une grande variété de milieux de culture, selon leur composition

chimique, leur nature physique, leur utilisation ou la méthode de préparation, les
milieux de culture peuvent être classés en plusieurs groupes.

1- Classification des milieux de culture selon leur composition chimique.

 ⁃ Milieu de culture empirique / Complexe / indéfini :

De composition connue seulement avec approximation, le milieu empirique

contient des ingrédients complexes, tels que l'extrait de levure ou l'hydrolysat de
caséine, dans des proportions inconnues. Exemple : Bouillon LB, gélose
Columbia, gélose Gassner, gélose Tryptycase soja.

 Milieu de culture synthétique / défini

Composition exactement connue, qualitativement et quantitativement. Ce sont
des milieux chimiquement définis préparés à partir de substances chimiques
pures. Un milieu synthétique est entièrement exempt de composants d'origine
animale (y compris les composants d'origine microbienne tels que l'extrait de
levure). Ces milieux sont très utiles pour étudier la physiologie, la nature
métabolique et les besoins nutritionnels des bactéries. Exemple : Gélose citrate
de Simons, milieu de glucose minéral.

2- Classification des milieux de culture selon leur nature physique

 Milieu de culture liquide

L'agar n'est pas ajouté lors de la préparation du milieu, la croissance se traduit

par un trouble, un dépôt ou une voile superficielle. La présence de plus d'un type
de bactéries ne peut pas être détectée et les cultures mixtes ne peuvent pas être
séparés. Exemple : bouillon nutritif, bouillon trypticase soja.

 Milieu de culture semi-solide

Contenant 0.5-0.75 % d’agar de consistance molle, il est utilisé pour démontrer

la motilité bactérienne. Exemple : Milieu mannitol mobilité.

 Milieu de culture solide

On obtient un milieu solide en ajoutant un agent gélifiant, "l’agar-agar" ou

gélose, à un milieu liquide. Il permet l'identification des bactéries en étudiant les
caractères des colonies (morphologie, pigmentation, l'hémolyse...) et Les
cultures mixtes peuvent être séparées. Exemple : Gélose nutritive, Gélose
trypticase soja, Gélose Cled.

 Milieu de culture biphasiques

Le milieu contient à la fois une partie solide et une partie liquide dans une seule
bouteille. L'inoculum est ajouté au milieu liquide et lorsque des sous-cultures
doivent être faites, la bouteille est simplement inclinée pour permettre au liquide
de s'écouler sur le milieu solide.

3- Classification des milieux de culture selon leur utilisation

 Milieu de culture simple

Les milieux de cultures simple, base, sont ceux qui peuvent être utilisés pour la
culture de bactéries non exigeantes. Généralement utilisé dans le diagnostic de
routine en laboratoire pour l'isolement primaire des bactéries. Ce type de milieu
peut être rendu plus riche, par l'ajout de suppléments, ou sélective, par l'ajout de
concentrations variables de chlorure de sodium. Exemple : Bouillon nutritif,
gélose nutritive et eau peptonée

 Milieu de culture enrichi

Ce sont des milieux utilisés pour l'obtention des bactéries dites « exigeantes » en
y ajoutant de suppléments sous forme de sang, de sérum, de jaune d'œuf, etc.
Exemple : Gélose au sang frais, gélose au sang cuit.

 Milieu sélectif et milieu d'enrichissement

Un milieu sélectif est formulé pour inhiber la croissance de certaines espèces

bactériennes. Ces milieux peuvent être formulés en ajoutant des réactifs sélectifs
supplémentaires, tels qu'une concentration saline élevée pour sélectionner les
halophiles, éosine-bleu de méthylène toxique pour les bactéries Gram-positives.

 Milieu différentiel

Le milieu de culture dit « différentiel » ou « indicateur » permet de distinguer

deux types de microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type
de milieu utilise les caractéristiques biochimiques d'un micro-organisme se
développant en présence de nutriments et/ou d'indicateurs spécifiques (tels que
le rouge neutre ou le bleu de méthylène) ajoutés au milieu pour indiquer
visiblement les caractéristiques déterminantes d'un micro-organisme. Exemple :
Gélose MacConkey (Par la fermentation du lactose), gélose Chapman (par la
fermentation du mannitol).

4 - Classification des milieux de culture selon la méthode de préparation

 Milieu prêt à l'emploi

Milieu de culture prêt à l'emploi est un milieu solide ou liquide fourni en boites,
flacons, tubes ou autres récipients, sous forme prête à l'emploi ou prête à
l'emploi après refusion et supplémentation.

 Milieu préparé à partir de formulations déshydratées

Un milieu de culture est un milieu sous forme sèche qui nécessite une
réhydratation et un traitement avant utilisation, aboutissant soit à un milieu
complet, soit à un milieu incomplet auquel des suppléments sont ajoutés avant
utilisation.

III- Constituants chimiques des milieux de culture.

La notion de milieu minimum : Un milieu minimum est un milieu comportant

les éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne, sous
une forme utilisable par des bactéries n'ayant pas d'exigence particulière : une
source de carbone et d'énergie, une source de potassium, de phosphore, d'azote,
de soufre, de magnésium, de calcium, de fer, d'oligo-éléments, d'eau et un
tampon pH.
 ⁃ Extraits de viandes

Extraits de viandes est préparé à partir de tissus d’origine animal sélectionnés

qui lui confèrent son excellente nutritive.

En association avec des peptones de différentes origines, l'extrait de viande

constitue un excellent complément nutritif destiné à l'élaboration de milieux de
culture variés. Il est habituellement incorporé à des concentrations allant de 0,2 à
1,0%. Ces infusions contiennent des acides aminés et des peptides de faible
poids moléculaire, des glucides, des vitamines, des minéraux et des métaux
traces.

⁃ Peptones

Les peptones sont des mélanges de composés solubles dans l’eau résultant de
l’action d’enzymes ou acide protéolytiques sur des matières protéiques. Elles
apportent au milieu de culture des acides aminés, des peptides (source d'énergie,
de carbone, d'azote) principalement.

La caséine est le plus souvent utilisée comme substrat protéique pour former des
peptones, mais d'autres substances, telles que la farine de soja, sont également
couramment utilisées.

⁃ Facteurs de croissance

L'incorporation de facteurs de croissance est utilisée pour enrichir les milieux de

culture pour réussir la culture des micro-organisme exigeants. Le plus souvent,
des mélanges de facteurs de croissance sont utilisés dans les milieux
microbiologiques :

• Hydrolysats : ce sont des peptones obtenues par une action

inorganique (Acide chlorhydrique) sur des protéines. Exemple : hydrolysat acide
de caséine.
 • Extraits de levures : L'extrait autolytique de levure est considéré
comme le principal facteur d'enrichissement des milieux de culture. Elle est
préparé sous forme d'extrait hydrosoluble de cellules de levure Saccharomyces
cerevisiae autolysées. Au cours de l'autolyse, les enzymes digestives endogènes
des levures décomposent la teneur en protéines. De plus, l'extrait de levure
fournit une source essentielle de vitamines du complexe B hydrosolubles, de
glucides et d'acide glutamique libre. En raison de sa teneur en glucides, il ne doit
pas être utilisé dans les milieux destinés à l'étude des fermentations sucrées.

• Produits biologiques : De nombreux milieux, en particulier ceux

utilisés en laboratoire clinique, contiennent des produits biologiques qui servent
de nutriments essentiels pour les micro-organismes exigeants. Exemple : Sang
ou des composants sanguins, oeufs, lait de vache écrémé, sérum de cheval ou de
bœuf.

⁃ Gélose ou Agar-agar

C’est un extrait d’algues rouges (rhodophycées) appartenant aux genres

Gelidium et Gracilaria, récoltées dans les mers du Japon ou de Nouvelle-
Zélande. Chimiquement, la gélose est un mélange de deux groupes de
polysaccharides dont l’un, dominant, est l’agarose : peu ou pas sulfaté, il a une
propriété gélifiante. La gélose se dissout dans l’eau vers 90°C, reste en surfusion
jusqu’à 45°C ; puis à température basse, elle forme un gel transparent plus ou
moins solide selon sa concentration dans l’eau
CONCLUSION

Il existe une variété de milieu de culture en bactériologie selon leur composition

chimique, leur nature physique et leur utilisation ou la méthode de préparation.
Avec la multiplication des analyses, se sont développés des systèmes permettant
d'associer rapidité, reproductivité et faible coût.