Compte rendu du stage de Tp de Microbiologie

Anne 2002-2003

Prparation des milieux et du matriel

Ltude des bactries a connu son plein dveloppement partir du moment o furent mises au point des mthodes permettant de les cultiver, les isoler, et de les identifier. Ces diffrentes oprations ncessitent lemploi de milieux de culture. Principales caractristiques dun milieu de culture Les microorganismes doivent trouver dans le milieu de culture et son atmosphre tous les lments chimiques les constituant, sous une forme approprie. Un bon milieu doit : Etre strile Etre nutritif : doit contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigs pour la croissance et lentretien des microorganismes. Contenir une quantit deau suffisante pour permettre le mtabolisme bactrien. Avoir un pH convenable. Rq : Un milieu contenant uniquement ce qui est ncessaire aux microorganismes est dit milieu minimum. Classification des milieux de culture Les milieux de culture sont classs en fonction de leur composition ou de leur utilisation. a) Classification selon la composition. 1. Milieux naturels ou empiriques Milieux complexes de composition mal dfinie. Leur origine est soit animale (extraits de viande, peptone), soit vgtale (pomme de terre, levure). 2. Milieux synthtiques Milieux composs de substances chimiques exactement dfinies 3. Milieux semi synthtiques Milieux synthtiques additionns dun produit naturel b) Classification selon lutilisation 1. Milieu usuels = milieu de base Milieu dun emploi aussi gnral que possible. Il nexiste cependant pas de milieu de culture universel 2. Milieu disolement Les milieux disolement peuvent tre : Des milieux de base Des milieux enrichis de produits biologiques Des milieux lectifs : Ce sont des milieux de culture permettant un dveloppement particulirement abondant de certains germes. Des milieux slectifs (ou denrichissement) : Ce sont des milieux dans lesquels on incorpore un inhibiteur chimique. Celui-ci, judicieusement choisi, entrave le dveloppement de la plupart des bactries except celui de lespce recherche. Ces milieux permettent donc disoler une espce bactrienne au milieu dun mlange de germes. 3. Milieu didentification Ces milieux permettent la mise en vidence des caractres biochimiques et donc de rsoudre les problmes didentification diffrentielle qui se posent entre des espces ou des genres voisins.

c) Classification selon leur prsentation 1. Milieux liquides Ce sont soit des bouillons nutritifs contenant des produits carns ou protiques, soit des solutions riches en produits synthtiques. Dans les deux cas la glose est totalement absente. La croissance microbienne est ralise dans des tubes, des ballons ou des erlenmeyers. Elle est suivie par turbidimtrie : un milieu limpide au dpart devient de plus en plus trouble lorsquun microorganisme se dveloppe. 2. Milieux solides Les milieux nutritifs solides peuvent tre identiques aux prcdents mais ils contiennent de la glose. Si il y a plus de 1% dagar on parle de milieu solide, si il y a moins de 1% dagar on parle de milieu semi solide. Ces milieux peuvent tre rpartis en botes de ptri, dans des tubes glose molle prise en culot, etc. La croissance microbienne se droule en surface ou en profondeur et est suivie par observation de laugmentation de la taille des colonies respectivement arobies et anarobies. Une cellule initiale se multiplie et donne une descendance de plusieurs millions dindividus tous identiques, formant une colonie.

Prparation des milieux de culture Sachant que de la prparation des milieux de culture dpend les rsultats de lanalyse microbiologique, un dfaut de fabrication, une strilisation mal conduite, risquent de perturber le travail. Il faudra donc apporter un grand soin leur fabrication. Les milieux de culture existent aujourdhui sous trois formes, soit, du plus coteux au plus conomique : - Le prt lemploi - Le prt couler - En poudre Durant ce Tp nous avons essentiellement utiliser des milieux en poudre du fait de leur moindre cot, ce sont soit un mlange des constituants de base, soit un des lments de base, dont le fabricant indique la dose peser pour un volume final de milieu. Les diffrentes tapes de la prparation de ces milieux consistaient en : - La pese - La dissolution des ingrdients - La mesure du pH - La rpartition - La strilisation des milieux (autoclave 121C pendant 20 min) Rq : Lagar tant un compos insoluble froid, il sera incorpor aprs la dissolution des ingrdients et la mesure du pH.

Les milieux utiliss durant ce Tp, leur rle et leur prparation Durant ce Tp nous avons utilis : Un milieu empirique sous forme solide: Glose nutritive (GN) Un milieu empirique sous forme liquide : Bouillon nutritif (BN) Deux milieux slectifs : Milieu losine et bleu de mthylne (EMB), Milieu Malt agar (MA) De leau physiologique Glose nutritive (GN): Relativement simplifie, sa formulation apporte les lments nutritifs ncessaires la croissance dune grande varit de germes non exigeants. Elle est utilise pour la culture et la numration des microorganismes ne prsentant pas dexigences particulires. Elle est constitue : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient broth) - glucose - agar Nous avons pes 20g de BN, 3g dextrait de levures, 5g de glucose, que nous avons placs dans un erlen de 2L et auxquels nous avons ajout 1L deau dminralise et plac sous agitation avec un barreau aimant afin de dissoudre les diffrents constituants. Nous avons alors vrifi que le pH se situait bien dans une gamme comprise entre 7 et 7.5. Cest donc aprs la dissolution des diffrents lments du milieu et ajustage du pH que nous avons incorpor les 15g dagar. Nous avons alors bouch lencolure de lerlen avec du coton card et plac une feuille daluminium autour avant de striliser le milieu lautoclave 121c pendant 20 min. Bouillon nutritif (BN) : Le bouillon nutritif contient exactement les mmes constituants que la glose nutritive, except le fait quon najoute pas dagar puisque cest un milieu liquide. Il est donc constitu de : - extrait de levure - bouillon nutritif (nutrient broth) - glucose Sa prparation est identique celle de la glose nutritive. Glose EMB (osine methylen bleu) : La glose EMB est constitue dosine Y et de bleu de mthylne qui sont des agents faiblement slectifs. Ils ninhibent que partiellement le dveloppement des microorganismes gram positifs tels que les Streptocoques fcaux. De plus ces colorants assurent la diffrenciation entre les germes lactose positifs et les germes lactose ngatifs, lorsque le milieu est lactos. Nous avons pes 18.75g afin de prparer 500 mL de ce milieu, auxquels nous avons ajout 500 mL deau dminralise. On a alors ajust le pH 6.8-7 laide de KOH concentr et strilis 121c pendant 20 min suivant le mme protocole que prcdemment.

Glose Malt agar : Elle est constitue : - extrait de malt - extrait de levure - glucose - agar Nous avions notre disposition sous forme de poudre la base du milieu malt agar qui contenait tous les constituants sauf lextrait de levure et le glucose. Le fabricant indiquait quil fallait peser 45g pour prparer un litre. Nous voulions prparer 500 mL, nous pesions par consquent 22.5g sur une feuille daluminium. Nous avons galement pes 1.25g dextrait de levure et 5g de glucose. Aprs avoir pes tous les constituants nous les avons transfrs dans un erlen dun litre et ajout 500 mL deau dminralise. Nous avons ensuite rajout 0.25g de Cloramphnicol avant de striliser 121C pendant 20 min. La slection des levures se ralise par lemploi du chloramphnicol Leau physiologique : Elle est obtenue par dissolution de 9g de Chlorure de sodium (NaCl) par litre deau distille. Elle constitue un milieu isotonique qui permettra la dissolution des microorganismes tout en maintenant la diffrence de pression osmotique de part et dautre de la membrane plasmique vitant ainsi la lyse.

Aprs strilisation nous avons procd ltape de rpartition des milieux. Nous avons coul les gloses de faon strile proximit de la flamme du bec Bunzen.

Familiarisation avec le monde microbien

Les Techniques de prparations microscopiques
Lobservation microscopique des microorganismes peut se faire sans coloration ou aprs coloration. Dans le premier cas, on examine des individus vivants : on apprcie ainsi la mobilit, la taille, la forme des germes ; dans un second cas, on prcise la forme et on dtaille les structures invisibles, par coloration, aprs fixation et desschage des prparations, oprations tuant les germes. Observation sans coloration : Etat frais Lobservation de ltat frais se ralise lobjectif x40, le conden seur descendu, et le diaphragme lgrement ferm. On observe ainsi sur un fond gristre des bactries brillantes. On met profit la proprit de rfringence des microorganismes pour les observer vivants. 1) Technique opratoire La technique opratoire consiste prparer une lame propre dgraisse et sche. Homogniser la suspension observer : prlever aseptiquement la Pipette Pasteur une goutte de culture : dposer cette goutte au centre de la lame. Rq : Si on part dun produit solide comme une colonie sur une boite de ptri par exemple, on dposera dabord une goutte deau au centre de la lame et on y suspendra une faible quantit de la colonie laide de lose. On recouvrira ensuite la goutte dune lamelle tout en vitant les bulles dair et les dbordements de liquide au-del de la zone dlimite par la lamelle. On observera sur fond clair avec lobjectif 40.

2) Interprtation Cette prparation permet dapprcier : Le nombre de bactries contenues dans le prlvement ; notion semi quantitative permettant de dire sil y a beaucoup ou peu de germes (renseignement utile ultrieurement pour choisir la quantit dinoculum convenable pour lobservation dun bon isolement et dune bonne culture). La forme des bactries

Coques ou cocci : lments arrondis, sphriques.

Bacilles : btonnets : lments allongs de taille variable.

Bacilles de taille moyenne

Bacilles grles

Gros bacilles trapus

Bacilles courts et arrondis : coccobacilles

Le mode dassemblage de bactries Isols Groups par deux : diplocoques En grappe ( Staphylocoques) En chanettes ( Streptocoques) En longue chanes Isols En courtes chanettes En chanes En palissades

Coques

Bacilles

 La mobilit Les cellules peuvent tre mobiles : la prsence de cils ( non visibles ltat frais) favorise le dplacement qui ne doit pas tre confondu avec le mouvement gnral du liquide ou avec le mouvement brownien si la temprature du liquide est trop leve (du fait de lclairage continu). Un corps microbien est mobile lorsquun individu observ traverse le champ du microscope ou lorsque deux individus se croisent.

Il ne faut pas oublier que dans un chantillon, il y a le plus souvent plusieurs types de bactries, ltat frais permet de savoir combien de types diffrents sont prsents. Dans dautres cas, cette observation permet de vrifier la puret dune culture. Il ne faut jamais oublier que les bactries sont vivantes. Lobservation de ltat frais est une tape indispensable et trs importante, qui apporte de nombreux renseignements et oriente dj le diagnostic et permet de passer ltape suivante : lobservation de prparations colores.

Observation aprs coloration Les observations aprs coloration se font lobjectif 100 limmersion, le condenseur relev fond, et le diaphragme ouvert entirement. Avant tout examen dun frottis color, il faut dans un premier temps raliser le frottis. 1) Prparation dun frottis On dpose une goutte de culture microbienne ou on suspend une colonie dans une goutte deau au centre dune lame. On tale la prparation avec loese de faon obtenir une couche mince On sche la lame. On fixe la prparation en crasant la flamme du bec 2 3 fois avec la lame. 2) Colorations Les colorants simples que lon emploie sont des colorants acides qui colorent uniformment les cellules, et des colorants basiques affinit pour le cytoplasme (fushine, violet de gentiane) Durant ce Tp nous avons ralis : Un examen aprs coloration diffrentielle dun frottis, cest la coloration de Gram. 2.1) Coloration de Gram Cest la coloration la plus utilise en microbiologie car elle permet de distinguer deux grands groupes de microbes : les Gram + et les Gram -. La distinction est base sur la diffrence de structure des parois mise en vidence par la double coloration. La lecture se fait avec lobjectif immersion. La coloration de Gram permet de classer les bactries en deux grandes catgories : - Les bactries Gram positif qui gardent la coloration violette aprs action de lalcool - Les bactries Gram ngatif qui sont dcolores par lalcool et teintes en rose plus ou moins vif par la fushine. Cette distinction, base de toute la taxonomie bactrienne repose sur une variation dans la structure de la paroi des bactries. En effet, la richesse en lipides de la paroi des bactries Gram ngatif permet lalcool de traverser cette paroi et de dissoudre le compos color, fix dans le cytoplasme, rsultat de laction co njointe du violet de gentiane et du lugol. Par contre, la paroi des Gram positifs, riche en peptidoglycane et pauvre en lipides est impermable lalcool et par consquent garde le complexe color violet.

2.2) La coloration des spores La coloration de spore permet de mettre en vidence les spores ou endospores, qui constituent les formes de rsistances de deux classes de bactrie : - Les Bacillus (arobie) - Les Clostridie (anarobie) La spore est rsistante la chaleur, la dessiccation, et aux radiations. Afin de la mettre en vidence il faut raliser une coloration chaud faisant intervenir du vert de Malachite, rincer lalcool, et faire une contre coloration la safranine.

Endospore

Les spores seront colores en vert et le cytoplasme des bactries en rose.

2.3) Coloration la nigrosine : La nigrosine est un colorant qui peut permettre la mise en vidence des cicatrices des bourgeonnements des levures. Sinon on lutilise lors dtat frais pour augmenter le contraste de la prparation. 2.4) Coloration lencre de chine : Lencre de chine est obtenue partir dune suspension de particules de charbon. Du fait de la taille leve des particules, celles -ci ne pntrent pas dans la cellule. On observe donc des cellules non colores sur un fond noir. Cette technique est une coloration ngative, puisquon ne colore pas les cellules, ainsi on peut mettre en vidence la prsence de capsules qui apparaissent blanchtre autour de la cellule qui elle est rfringente. La technique consiste placer sur une lamelle une goutte de la prparation et une goutte de colorant cte cte.

Et de dposer dessus une lamelle. Les deux gouttes se mlangeront, et on observera au grossissement x40.

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Observation dun mou de raisins

Le mou de raisin est un mlange en solution aqueuse de raisins crass. Afin dobserver les diffrentes catgories de germes prsents, nous avons raliser des techniques microscopiques dobservation.

Technique s dobservation

Etat Frais (G x40)

Nigrosine (G x 40)

Coloration de spore (G x100) On observe des bactries roses en forme de btonnet ne prsentant pas de spores, et des levures roses.

Coloration lencre de chine (G x 40) On observe des bactries et des levures. Les bactries ne possdent pas dhalo blanc caractrisant la prsence de capsule.

Observations

On observe des bactries en forme de btonnet qui ne possdent pas de mobilit. observe galement des levures On

On peut donc constater que le raisin possde plusieurs flores microbiennes : une dorigine bactrienne et lautre de type levure. Ces deux flores sont ncessaires la fabrication du vin.

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Observation dun jus de radis

Technique s dobservation Etat Frais (G x40) Nigrosine (G x 40) Coloration de spore (G x100) Coloration lencre de chine (G x 40) On observe quelques capsules.

Observations

On observe des protozoaires. On observe des arthrospores. observe galement du On pseudomyclium.

Slection des bactries formants des endospores dans la suspension de radis Les spores sont des formes de rsistances, afin de les mettre en vidence nous allons mettre dans des conditions de stress un aliquote de notre solution de jus de radis 90C pendant 20 min. Cette tape pour but de tuer toutes les formes vgtatives, et de slectionner uniquement les formes sporulantes. Par talement sur un milieu GN de notre aliquote chauff et aprs incubation, on a obtenu des colonies correspondantes aux bactries sporules. Nous avons ainsi confirm la prsence de spores et isol les bactries sporulantes.

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Etude de 6 souches de collection

Nom de la souche Aspect macroscopique Colonie blanche bord crnel de 0.5 cm de diamtre Colonie blanche-jaune, ronde, lisse, brillante, diamtre 1mm Coloration de spores Exospores verte et spores dformantes subterminales Coloratio n lencre de chine

Coloration la nigrosine Btonnet bouts carrs 1.5*4 Mobilit + ou par ciliature pritriche isol

Etat frais Btonnet bouts carrs 1.5*4 Mobilit + ou par ciliature pritriche isol

Gram

oxydase

catalase

Mobilit

Bacillu s megaterium

Bacille violet gram + Coque gram + violet, isol, par 2, en amas, ou en ttrade Bacille a gram variable Bacille rose Gram Isol ou par 2

+/-

Micrococcus flavus

Petit coque, immobile

Petit coque, immobile

Waksmania sp Petite colonie ronde, bombe pigmente en rose Colonie lisse, 1.5 mm de diamtre, rondes, bombes, bord rguliers, luisantes, jauntres Grande colonie plates de 2 3 mm de diamtre, transparente, bords frangs, aspect iris, nacr

Bacille 1*5 Isol Courte chanette Btonnet ovode, group par 2 ou isol Taille : 1-3

Bacille 1*5 Isol Courte chanette Btonnet ovode, group par 2 ou isol Taille : 1-3

Serratia marcescens

+++

Escherichia coli

Petit btonnet ovode de forme coccobacille Isol, par 2 Taille : 1

Petit btonnet ovode de forme coccobacille Isol, par 2 Taille : 1

Coccobacille rose gramIsol, par 2

Pseudomonas aeruginosa

Petit btonnet Isol, par 2 Taille : 5

Petit btonnet Isol, par 2 Taille : 5

Bacille rose Gram Isol, par 2

++

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Ralisation dune courbe de croissance

La croissance est dfinie comme laccroissement ordonn de tous les composants dun organisme. Chez les micro-organismes unicellulaires comme les bactries ou les levures, elle aboutit une augmentation du nombre dindividus rsultant dune division cellulaire. Cet accroissement est donc synonyme de multiplication, puisque au bout dun temps correspondant au temps de gnration, une bactrie peut donner naissance deux nouvelles bactries. Paralllement, cette croissance se traduit par un appauvrissement en divers mtabolites, et par laccumulation de dchets entranant la mort des cellules. Afin dtudier la croissance, nous avons valu le nombre de cellules en mesurant le trouble. Cest le procd le plus simple et le plus rapide. Cest une mthode optique gnrale, appele turbidimtrie, fonde sur la proprit que prsente toutes les solutions dabsorber une partie de lintensit dun faisceau de lumire qui la traverse. Cette proprit est base sur la loi de Beer Lambert ou log (I0/I) = Il en dcoule que labsorbance est proportionnelle la concentration. .l.c. Cependant cette loi nest plus valable aux fortes concentrations, cest pour cela que nous avons dilu nos chantillons lorsque la DO dpassait les 0.8. Linconvnient de cette technique cest quelle est incapable de diffrencier les cellules mortes des cellules vivantes et de mesurer des 6 concentrations microbiennes infrieurs 10 bactries/mL. Cest pour cela que nous avons ralis une prculture en milieu BN 24h auparavant. Celle-ci avait pour but dobtenir une culture jeune avec un fort inoculum, et aussi dhabituer la souche au milieu de culture, permettant ainsi de diminuer la phase de latence qui correspond au temps dadaptation de la bactrie. Nous avons ralis des courbes de croissance sur deux souches diffrentes : Un coque gram + : Micrococcus flavus Un bacille gram - : Escherichia coli Les courbes ont t obtenues en traant lvolution de la densit optique en fonction du temps, toutes les 30 minutes environ. La croissance est constitue de diffrentes phases, dont la phase exponentielle de croissance. Durant cette phase labsorbance, donc le nombre de cellules, augmente de faon exponentielle et ln (nb cellules) est proportionnel au temps. Cette phase permet de dterminer deux paramtres : - Le temps de gnration - Le taux de croissance nprien Cest ces paramtres que nous allons calculer ; ce sont des caractres propres chaque espce. Nous allons utiliser du papier semi-log ce qui permettra de reporter directement les valeurs de DO, tout en linarisant la phase exponentielle de croissance.

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Explication des diffrentes phases de la croissance On a remarqu que si on reprsente la fonction ln N = f (t), on obtient une zone linaire pendant la phase o N augmente (phase exponentielle de croissance).

Phase

Description Elle est facultative. Quand elle existe, elle correspond une phase d'adaptation des bactries au milieu. Les bactries ne se divisent pas (ou trop peu pour mesurer la variation). Elle est absente quand l'inoculum est jeune et que le milieu est le mme que le prcdent. Cette phase correspond au temps ncessaire aux bactries pour synthtiser les enzymes ncessaires pour dgrader le milieu et pour ajuster certains paramtres comme le pH.

Valeur de x (vitesse spcifique de croissance) en h-1 x = 0 (ln N = ln N o)

Phase de latence

Phase Les bactries se multiplient de plus en plus activement d'acclration Les bactries se multiplient leur rythme le plus lev. Le ln de N est Phase directement proportionnel eu temps. C'est la phase physiologique (production exponentielle d'antibiotiques et de toxines. La reprsentation est une droite d'quation : de croissance Phase de Lorsque les nutriments se rarfient, la croissance ralentit, le phnomne ralentissement s'accentue plus les nutrime nts se rarfient. La biomasse est stable. Deux explications sont envisageables : - Les bactries ne se divisent plus ; Phase - Il y a autant de bactries qui se divisent que de bactries qui meurent. stationnaire Elle peut tre due la disparition d'un ou plusieurs nutriments, l'acidification du milieu et, ou surtout l'accumulation de dchets toxiques. Phase de Les bactries ne se divisent plus, certaines meurent et sont lyses. Leur nombre dclin N diminue.

x (G )

x = max

x et tend vers 0

x = 0

x < 0

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Temps de gnration : Le temps de gnration (en min) est le temps de doublement de la population bactrienne, c'est l'intervalle de temps compris entre 2 divisions bactriennes en phase exponentielle..

Taux de croissance :

1) Escherichia coli : 1.1) Prculture :

Un jour avant de raliser notre courbe de croissance, nous avons ensemenc 2 mL de bouillon BN laide dun clone de la bactrie. Nous avons mis le tube incuber sous agitation au bain marie pendant la nuit 30C. 1.2) Exprience :

Dans un premier temps nous avons talonn le spectrophotomtre. Nous avons donc transfr dans une cuve 1mL du milieu BN restant contenu dans notre flacon, et nous avons talonn le spectrophotomtre. Ensemencement Pralablement nous avons mesurer la Do 600 nm afin davoir une estimation de la concentration de linoculum. On veut obtenir une absorbance infrieure 0.1 dans notre Bouillon nutritif de 100 mL au temps t=0 initial. Pralablement jai dilu la culture au 1/20me (50 dans un volume final de 1000L), ce qui a donn L une DO de 0.395 pour 1mL soit une DO de 7.9 pour lchantillon non dilu. 1 ml de la culture dans les 100 mL de bouillon nutritif donnerait donc une Do de 0.08. On a donc inocul les 100 ml de milieu BN laide de 1mL de la prculture. On a laiss la pipette cotonne qui nous a servi linoculation dans lerlen en la callant avec le coton card. On agite la solution pour lhomogniser et on prlve 1 mL pour raliser la mesure de labsorbance au temps t=0. On replace alors lerlen sous agitation au bain marie 30C, cest le temps zro de lexprience. Mesure de la croissance : Toutes les 30 minutes, on prlve 1 mL de la culture en cours afin de suivre lvolution de labsorbance et tracer la courbe de croissance. Rq : On a toujours utilis la mme cuve pour faire les mesures quon a rinc entre temps leau.

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Rsultats :

Temps 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Dilution Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune Aucune

DO avec Dilution 0,122 0,125 0,163 0,213 0,28 0,364 0,516 0,798 0.5 0.595 0.715

DO 0,122 0,125 0,163 0,213 0,28 0,364 0,516 0,798 1 1,19 1,43

On a dilu partir du temps t=240 min, car le spectrophotomtre ne donne plus de rponse linaire au-del dune absorbance de 0.8, ainsi que la loi de Beer Lambert qui nest plus valable. 2) Calcul des diffrents paramtres de la croissance Nom de la souche Temps de gnration (min) 75 Taux de croissance (min-1) 0.009min-1 0.54 h-1

Escherichia coli

On a pu constater sur le graphique une augmentation de labsorbance au temps t= 3h et ensuite une diminution au temps t= 3h30. Ce changement correspond une lvation de temprature et un retour la temprature initiale, on est pass de 28C 30C puis on est retourn 28C. De ce fait on a pu voir que le temps de gnration nest une constante pour un germe donn que dans des conditions donnes. Le temps de gnration est diffrent pour chaque microorganisme. On peut sen servir pour obtenir un nombre de cellules un temps donn.

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Etude microbiologique de produits

Ltude microbiologique dun produit pour but de mettre en vidence et de dnombrer les microorganismes prsents, comme les bactries, les levures, ou les moisissures par lutilisation de milieux slectifs adquats. Par la suite, ltude des caractres biochimiques permettra ventuellement de caractriser ces microorganismes. Les microorganismes contenus lintrieur du produit analyser doivent tre extraits puis ensemencs en milieu solide ou liquide. Le choix des milieux et des conditions de culture (temprature) est important et lutilisation de plusieurs milieux slectifs permettra disoler lensemble de la flore microbienne. On utilisera donc pour la recherche des bactries, le milieu GN. La recherche des entrobactries se fera sur milieu slectif au pH neutre : EMB La recherche des levures et moisissures se fera sur milieu complexe slectif au pH acide : Ma+chloramphnicol. Lextraction des microorganismes du produit analyser devra tre adapte au type de produit analyser. Pour un produit solide comme la terre, un broyat en prsence dun solvant facilitant la dispersion des cellules (eau physiologique) a t ralis. Pour le lait, milieu liquide, aucun traitement particulier na t ncessaire.

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1 Analyse microbiologique et dnombrement dun chantillon de sol

Extraction et analyse microbiologique dun chantillon de sol

1) Prlvement Afin de dterminer la flore prsente dans le sol, nous allons prlever de faon le plus strilement possible, un chantillon de terre afin de limiter lapport dautres contaminants. On veillera prlever une masse suprieure 10g. Puisque par la suite nous aurons besoin de deux fois 5g de terre, une pour dterminer le poids sec, lautre pour dterminer la flore prsente. 2) Extraction A partir de cet chantillon, nous allons peser deux fois 5g de terre. Le contenu de la premire pese sera plac dans un bcher et plac au four pasteur pendant 6h 180C afin de dterminer le poids sec. Le contenu de la deuxime pese est plac dans un mortier en prsence de 30 mL de solution dextraction (eau physiologique). Leau physiologique constitue un milieu isotonique qui empche la lyse des cellules, en maintenant une pression constante de part et dautre de la cellule. On broie alors laide dun pilon le produit, puis on transvase dans un tube gradu de 50mL. Lensemble de ltape dextraction se ralise dans des conditions striles autour du bec bunsen avec du matriel strile. Le pilon et le mortier sont rincs avec la solution dextraction afin de rcuprer toute la terre prsente. Puis le tube est complt 50 mL avec la solution dextraction. Nous tant tromp notre volume final tait de 53 mL .Lchantillon est homognis au vortex puis on laisse reposer pendant 15 min. 3) Calcul du poids sec Aprs avoir mis dans un bcher un poids connu et prcis de terre. On place celui ci au four pasteur pendant un temps minimum de 6h. Ainsi on saffranchira du taux dhydratation de la terre qui varie en fonction des conditions atmosphriques et du lieu de prlvement. Ceci est ncessaire pour comparer des chantillons prlevs des lieux diffrents, puisquon ne prend plus en compte que la masse de la terre sche. Masse du bcher 46.73g Masse terre humide = 4.97g Masse du bcher + terre humide 51.70g Masse bcher + terre sche 47.99 Masse terre sche = 51.7-47.99=3.71g On dispose donc de 3.71g de terre sche. Il y avait donc ((4.97-3.71)/4.97)x100=25% dhumidit dans la terre. Pour la suite des calculs on considrera que la masse de terre humide tait de 5g. 4) Dilutions -1 -9 Les microorganismes en suspension sont dilus en cascade de 10 10 . Le transfert de 1mL de la er suspension prpare prcdemment dans le 1 tube contenant 9 mL de solution de dilution -1 constitue la dilution 10 . On homognisera laide dun vortex et on procdera de la mme -1 manire, en prlevant 1 mL dans le tube 10 pour le transfrer dans le tube 2, on homognise, et ainsi de suite.

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5) Ensemencement A partir des dilutions, les microorganismes dilus sont tals sur botes de milieu nutritifs et inoculs en milieu nutritif liquide. 6) Dnombrement Afin de dterminer le nombre de microorganismes contenus dans notre chantillon de terre, nous allons utiliser deux techniques de dnombrement : Une technique de comptage sur boite Une technique statistique : le test de Mac Grady faisant intervenir un paramtre : le MPN (most popular number) ou NPP (nombre le plus probable) 6.1) Comptage sur boite Afin de dnombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considrer que chaque colonie ou clone visible correspond un microorganisme dpos sur la bote lors de ltalement. Vue que certains microorganismes peuvent tre pluricellulaire, on ne peut considrer que chaque clone provient dune seule cellule originelle. On utilise donc le terme dUFC (unit formant colonie) pour rapporter le rsultat obtenu On ralisera donc des talements en surface de 0.1mL des diffrentes dilutions prcdemment prpares, en inoculant 3 botes par dilution. Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une bote ntant pas statistiquement fiable, seules les botes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes. Le milieu MA va servir la multiplication des champignons Le milieu GN va servir une multiplication non slective des bactries Le milieu EMB va servir la prslection de notre souche isole dentrobactrie Milieu MA Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-3 0 1 3 1.33 10-4 0 0 0 10-5 0 0 0

Afin davoir un nombre statistiquement correct, on considre un nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -3 qui donne un nombre de 1.33 colonies. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par consquent : N = 1.33 x 10 3 x 10 = 1.33 x 104 UFC/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux levures. Milieu GN Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne
-5

10-5 1 1 0 0.75

10-6 0 0 0

10-7 0 0 0

10-8 0 0 0

10-9 0 0 0

La dilution 10 donne un nombre de 0.75 UFC. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par consquent : N = 0.75 x 10 5 x 10 = 7.5 x 105 bactries/mL dans le sol. Il y aurait donc 7.5 x 105 bactries, toutes flores confondues, dans un mL de suspension de terre.

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Milieu EMB Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-2 84 111 105 100 10-3 6 13 10 10 10-4 0 0 1

Afin davoir un nombre statistiquement correct, on considre un nombre comptable entre 30 et -2 300 colonies. La dilution 10 donne un nombre de 100 UFC. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par consquent : 2 5 N = 100 x 10 x 10 = 1 x 10 bactries/mL dans le sol. Ces germes correspondraient aux Entrobactries. 6.2) Test de Mac Grady (NPP: technique du nombre le plus probable) Une utilisation de lanalyse statistique peut tre faite pour obtenir des rsultats plus prcis en milieu liquide. Cette technique utilise trois essais par dilution. Cest la mthode du nombre le plus probable (NPP), drive des tudes de Mac Grady, qui consiste interprter les rsultats en comparant les trois essais et leurs rsultats. Il sagit dune interprtation probabiliste. Aprs incubation des tubes, on notera pour chaque essai si le rsultat est positif ou ngatif. Et, chaque dilution, on affectera un chiffre gal au nombre de tubes positifs. On groupe ensuite en nombre de 3 chiffres la suite de chiffres obtenue, en commenant par le chiffre obtenu pour la plus faible dilution. Dilution Tube 1 Tube 2 Tube 3 Nb de tube + 10-4 + + + 3 10-5 + + 2 10-6 + 1 10-7 0 10-8 0 10-9 0

Ici nous obtenons les nombres : 321 210 100 On choisi le nombre le plus grand possible et si possible infrieur 330 (car cela correspond une meilleure rpartition dans les dilutions). Pour lchantillon de sol le nombre significatif est 321 pour la dilution 10 -4. On lit la valeur correspondante n dans la table, on obtient un NPP de 15 La concentration de bactrie dans notre chantillon de sol est: Nb bactrie = (n/10 )= 1.5 x 10 bactries/mL de la dilution 10On dpart on avait 53 mL dans lesquels on prlev 0.5 mL, ce qui correspond : 5 7 (1.5 x 10 x 53)/0.5 = 1.59 10 bactries/ml Dans nos 53ml de dpart, il y avait 5g de terre humide soit 3.71g de terre sche. Le nombre de bactrie par gramme de terre sche est : 7 6 1.59 10 / 3.71 = 4.28 10 bactries / gramme de terre sche. 6 Notre chantillon de sol une concentration en bactrie de 4.28 10 bactries/ gramme de terre sche.
-4 5 4

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2 Analyse microbiologique et dnombrement dun chantillon de lait cru

1) Dilutions Nous avons prpar une gamme de dilution en NaCl 0.9% de 10 -1 10-4. Pour cela nous avons plac au pralable 4.5 mL de NaCl dans chaque tube. Nous avons homogniser lchantillon de lait cru, prlever 0.5 mL et dilu dans le tube 1 (10 -1). Nous avons bien homognis entre chaque prlvement, et transvaser 0.5 mL du tube 1 vers le tube 2. Nous avons rpt cette opration jusquau tube 4 (10-4) en ralisant une dilution en cascade de 10 en 10. 2) Enrichissement/slection A partir des dilutions 10 10 , nous allons procder ltape denrichissement slection grce lutilisation de milieux slectifs. Pour cela nous allons inoculer 0.1 mL sur les milieux GN MA EMB, en utilisant trois botes par dilution. 3) Comptage sur boite Afin de dnombrer des microorganismes sur milieu solide, il faut considrer que chaque colonie ou clone visible correspond un microorganisme dpos sur la bote lors de ltalement. Vue que certains microorganismes peuvent tre pluricellulaire, on ne peut considrer que chaque clone provient dune seule cellule originelle. On utilise donc le terme dUFC (unit formant colonie) pour rapporter le rsultat obtenu Un nombre trop faible ou trop important de colonies sur une bote ntant pas statistiquement fiable, seules les botes contenant entre 30 et 300 colonies seront prises en comptes 4) Rsultats Milieu MA (Slection des champignons) Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-2 164 180 198 181 10-3 20 8 11 13 10-4 0 0 12 4
-2 -4

Afin davoir un nombre statistiquement correct, on considre un nombre comptable entre 30 et 300 colonies. On prendra donc pour le calcul la dilution 10 -2 qui donne un nombre de 181 colonies. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par consquent : 2 4 N = 181 x 10 x 10 = 1.81 x 10 UFC/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux levures.

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Milieu GN (dveloppement non slectif de la totalit de la flore) Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne 10-2 inc inc inc inc 10-3 inc inc inc inc 10-4 276 262 300 280

La dilution 10 donne un nombre de 280 UFC. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par consquent : 4 7 N = 280 x 10 x 10 = 2.8 x 10 bactries/mL dans le lait cru. 7 Il y aurait donc 2.8 x 10 bactries, toutes flores confondues, dans un mL de ce lait cru.

-4

Milieu EMB (dveloppement slectif du genre Entrobactrie) Dilution Bote 1 Bote 2 Bote 3 Moyenne
-3

10-2 inc inc inc inc

10-3 444 Pb Pb 444

10-4 Pb Pb Pb Pb

La dilution 10 donne un nombre de 444 UFC. Sachant que nous avons tal 0.1 mL de chaque dilution sur le milieu, il a donc par consquent : 3 6 N = 444 x 10 x 10 = 4.44 x 10 bactries/mL dans le lait cru. Ces germes correspondraient aux Entrobactries.

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Identification dun bacille gram oxydase Rf : lait 2

Origine : lait Isolement partir de EMB Vrification du genre Enterobacteriacea a) Ngrosine La coloration la nigrosine a pu mettre en vidence la forme bacillaire de la bactrie. b) Coloration de Gram On a observ des bacilles roses gram -. c) Encre de Chine La coloration lencre de chine na pas rvl la prsence de capsule. d) Oxydase La bactrie ne possde pas loxydase. Tous ces tests confirment bien la prsence dune Entrobactrie Vrification du type fermentaire : Hugh et Leifson Les entrobactries dgradent les oses, en particulier le glucose, par voie fermentaire en produisant des acides organiques. Pour mettre en vidence la fermentation dun sucre, il suffit donc de rechercher la variation de pH du milieu grce un indicateur color. Grce au milieu Hugh Leifson, nous allons tudier la voie dattaque du glucose. Ce milieu, faiblement pepton, contient du glucose la concentration de 1% et du bleu de bromothymol comme indicateur de pH. Il est prsent en culot, du fait de sa consistance molle. Aprs rgnration (limination de lO2 dissous par passage au bain marie) et refroidissement, on a ensemenc par piqre centrale 2 tubes en parallle : - un tube est recouvert dhuile minrale, il est dit ferm :F - lautre est laiss au contact de lair : il est dit ouvert :O Les rsultats obtenus permettent de distinguer plusieurs catgories de bactries. Bactries acidifiant le milieu : - acidification dans les deux tubes : bactries fermentatives. - acidification en surface dans le tube ouvert : bactries oxydatives. Bactries ne modifiant pas le pH du milieu : bactries inactives.

Culture et virage au jaune en O et F

Culture et virage au jaune en surface dans O seul

Peu ou pas de culture en F , culture en O mais pas de virage

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Dtermination de la sensibilit de la bactrie aux antibiotiques

1) Dfinition Antibiotique : Cest une substance chimique produite par un microorganisme qui est capable dinhiber la croissance (bactriostase) ou de tuer (bactricide) certaines bactries. De nombreux antibiotiques sont susceptibles dtre obtenus par synthse, de ce fait, la discrimination entre antiseptique et antibiotique repose essentiellement sur leur mode daction : Un antibiotique est lectif, dirig uniquement contre les bactries, agit rapidement et faible dose. Alors quun antiseptique est global, dtruisant la fois les germes et les cellules vivantes. 2) Antibiotiques utiliss et leurs cibles Les agents antimicrobiens peuvent tre classs en familles daprs leur origine, leur spectre daction, leur mode daction.

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Durant ce Tp nous avons test trois antibiotiques : - Ttracycline - Ampicilline - Pnicilline Ces trois antibiotiques ont des cibles diffrentes : Antibiotiques inhibiteurs de la synthse protique : Diffrentes classes d'antibiotiques agissent en interfrant avec la synthse protique bactrienne, et ce, au niveau de l'une des trois tapes principales de la traduction : - l'initiation - l'longation - la terminaison Les ribosomes procaryotes prsentent un coefficient de sdimentation de 70S (50S pour la sous-unit lourde et 30S pour la sous-unit lgre). La sous-unit 50S comporte les ARN ribosomaux (ARNr) 5S et 23S alors que la sous-unit 30S intgre l'ARNr 16S (impliqu dans la reconnaissance de la squence de Shine-Delgarno de l'ARN messager, aboutissant l'initiation de la traduction). Les ttracyclines sont des antibiotiques isols de souches de Streptomyces , et aujourd'hui obtenus par hmisynthse. Les ttracyclines inhibent la synthse protique en empchant la liaison de l'aminoacyl-ARNt la sous unit 30 S du ribosome bactrien. Ce sont des composs bactriostatiques trs large spectre. Nanmoins, leur usage est aujourd'hui limit par l'mergence de rsistances. Les ttracyclines doivent leur nom leur structure ttracyclique commune (noyau naphtacne-carboxamide), sur laquelle viennent se greffer des substituants au niveau des positions indiques par un astrisque dans la figure cidessous.

Ttracycline hydrochlorure (masse molculaire : 480,9)

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Les -Lactamines : Les -lactamines sont des inhibiteurs de la synthse de la paroi bactrienne. Ces composs n'agissent donc que sur des bactries se multipliant activement. Durant ce Tp, nous avons utilis deux lactamines : - La pnicilline - Lampicilline

La pnicilline appartient la famille des lactamines. Lorsque les bactries gram+ ou gramsont en croissance et traites par des pnicillines, la synthse de leur paroi est stoppe. On peut observer que les cellules saccroissent mais que la paroi diminue progressivement. La pression osmotique augmente lintrieur de la cellule, qui finit par clater. Au niveau du peptidoglycane les pnicillines empchent lincorporation des peptides dans les chanes polysaccharidiques de la paroi. Il se forme alors un complexe non fonctionnel [peptidasepnicilline]. La pnicilline empche la construction de la paroi en bloquant deux enzymes : Transpeptidases qui a pour rle de faire rentrer les ttrapeptides Carboxypeptidase, qui dcroche la 2me D-Ala.

Lampicilline est aussi appele aminopnicilline. Elle appartient galement la famille des lactamines comme la pnicilline, et possde le mme mode daction. Elle arrte le processus de transpeptidation qui lie les peptidoglycannes de la paroi bactrienne. Les bta lactamines se lient et inactivent des cibles enzymatiques situes sur la paroi interne de la membrane bactrienne: les protines de liaison des pnicillines : transpeptidases, carboxypeptidases, endopeptidases. Les bta lactamines inactivent galement des inhibiteurs endognes des autolysines bactriennes.

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3) Antibiogramme par la mthode des disques Lantibiogramme est lexamen de pratique courante qui permet dtudier commodment sur une souche bactrienne lactivit bactriostatique dantibiotique choisi en fonction de leur spectre dactivit et dapprcier les rsistances acquises. Principe : La culture bactrienne est ralise la surface dune glose GN. Des disques primprgns dune dose connue dantibiotique sont dposs la surface de la glose. Lantibiotique diffuse horizontalement et verticalement partir du disque en crant un gradient de concentration minima inhibitrice. Les caractres de sensibilit ou de rsistance de la souche bactrienne en seront dduits. La mesure du diamtre de la zone dinhibition de la bactrie peut tre relie la concentration de lantibiotique ce niveau : cette concentration est la concentration minima inhibitrice ou CMI de la souche pour cet antibiotique. Technique de lantibiogramme : Les diffrentes tapes de la ralisation de lantibiogramme sont standardises ; Il y a lensemencement : on verse 0.2 mL la surface du milieu quon rparti a laide dun rteau ou de billes de verre. On laisse scher les botes Ensuite nous appliquons les disques : Les disques ne doivent pas tre trop prs les uns des autres, et ils ne doivent pas tre dplacs une fois poss. On veillera ne pas les chauffer avec la pince flambe. Il faut en dernier lieu quil y ait prdiffusion avant dincuber la bote : on laisse les botes temprature ambiante, puis on les incubent 18h ltuve 37C. Lectures et interprtation : Aux diamtres mesurs autour du disque, permettant lestimation de la CMI, on peut associer les diamtres critiques eux-mmes correspondant deux concentrations critiques, concentration critique suprieure et concentration critique infrieure. La comparaison de la CMI aux deux concentrations critiques permet de dterminer le caractre sensible (S), intermdiaire (I) ou rsistant R de la souche. La comparaison des diamtres permettra la mme opration : - diamtre dinhibition (correspondant la CMI) > diamtre de la concentration critique infrieure souche sensible S - diamtre dinhibition < diamtre de la concentration critique suprieure : souche rsistante - diamtre dinhibition compris entre les deux diamtres des concentrations critiques : souche intermdiaire. mm

CMI mg/L

Concentration critique infrieure

Concentration critique suprieure

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Rsultats :

Sigle de lATB TE AM P

Nom de lantibiotique Ttracycline Ampicilline Pnicilline

Diamtre dinhibition (mm) 20 Pas de halo Pas de halo

Interprtation Par rapport au diamtre > 19

Interprtation CMI CMI < 4mg/L

Rsultat S R R

Schma explicatif pour la ttracycline :

19 S I

17
mm

R
CMI mg/L

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4) Dtermination de la CMI, mthode en tubes 4.1) Dfinition de la CMI La CMI est la concentration minimale inhibitrice. Cest, pour un temps donn dapplication de lantibiotique, la concentration la plus faible en antibiotique pour laquelle on nobserve aucune croissance ( x= 0). 4.2) Principe de la dtermination de la CMI Il consiste placer dans un mme inoculum de la souche tudier (prsente en tubes), des concentrations croissantes dantibiotiques selon une progression dordre 2 et en prsence dun tmoin sans antibiotique. Les tubes sont incubs 37 C pendant 24 H la concentration du premier tube ne prsentant pas de culture correspond la CMI. 4.3) Schma montrant la prparation de la galerie de dilution et lensemencement de dilution et lensemencement de la gamme Afin de dterminer la CMI (concentration minima inhibitrice), nous allons raliser une gamme de dilution de lantibiotique. On va donc prparer 10 tubes tube 2 9 contenant 5 mL de milieu BN Tube 1 contenant 10 mL de milieu BN Rien dans le tube 10

Dans le tube 1, nous allons rajouter de la ttracycline afin davoir une concentration finale de 150 g/mL. Pour cela, on dispose dune solution initiale 10 mg/ml. CiVi = CfVf Vi = (CfVf)/Vi Ci : concentration initiale en ATB : 10 mg/mL Cf : concentration finale en ATB 150 g/mL Vf : volume du tube : 10 mL Vi : volume de solution mre prlever Vi = (150.10 x 10) / (10.10 )= 0.15 mL soit 150 L Il faudra donc introduire 150 L de la solution mre dantibiotique dans le tube 1 afin dobtenir une concentration de150 g/mL. Ensuite, il sera ralis une dilution gomtrique de raison 2 de lantibiotique. Nous prlverons aprs homognisation 5 mL du tube 1 que nous transvaserons dans le tube 2. Cette tape sera rpte jusquau tube 10.
-6 -3

30

Ce nest quaprs dilution de lantibiotique que nous allons incorporer la bactrie. Tube [ATB] g/mL Rsultat 1 150 2 75 3 37.5 4 18.75 5 9.375 + 6 4.6875 + 7 2.34375 + 8 1.171875 + 9 0.5859375 + 10 0.5859375 +

Absence de culture : Prsence dune culture : + La prsence ou labsence de culture se traduit par la prsence ou non dun trouble due un dveloppement bactrien.

4.4) Lecture de la galerie (reprsentation, dtermination de la CMI en g.mL )

-1

Tmoin

Le tube contenant 18.75 g/mL est le premier ne prsentant pas de culture, pour notre souche la concentration minimale inhibitrice est de 18.75 g/mL.

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5) DETERMINATION DE LA CMB 5.1) Dfinition de la CMB La CMB est la concentration minimale bactricide. Cest pour un temps donn la plus faible concentration pour laquelle le nombre de bactries survivante est infrieur 1/10 000 (ou 0,01%). 5.2) Schma de la technique de dtermination de la CMB Afin de dterminer la CMB : concentration minima bactricide, nous allons taler une goutte de nos tubes 1 6 qui ont servi raliser le test de la CMI. Afin de vrifier que lorsque il ny a plus de trouble, cela signifie quil ny a plus de culture et donc quon atteint la CMB.

Incubation : 37 C, 24 h. 5.3) Lecture : schma de lobservation de la glose

6 5 4 3 2 1

On observe une dcroissance du nombre de bactrie dun demi de 6 1, correspondant aux dilutions de lantibiotique, mais en aucun cas il y a inhibition de la croissance traduisant un effet bactricide de la part de lantibiotique.

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5.4) Rsultat de la CMB La concentration minimale CMB est suprieure 150 UI.mL -1. 6) Conclusion des deux rsultats CMI et CMB trouvs La CMI est trs infrieure la CMB (CMI << CMB), on peut en conclure que lantibiotique, vis vis de cette souche est bactriostatique (cest dire quil inhibe la souche mais ne la tue pas). Les concentrations dites bactriostatiques permettent la population bactrienne de se dvelopper mais en ralentissant la croissance ; alors que les concentrations dites bactricides permettent de rduire le nombre initial de bactries.

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Ralisation de la galerie API20E : La galerie API est un ensemble miniaturis dune vingtaine de tests biochimiques. Ces systmes sont varis et chacun cible lidentification dun groupe particulier de bactries. Nous allons utiliser dans ce Tp une galerie API20E qui cible lidentification du groupe des Entrobactries. Prparation de linoculum : On a prlev laide de loese quelques colonies frachement isoles sur le milieu GN ensemenc la veille avec la souche identifier. On introduit ces bactries dans un tube contenant 5 mL deau physiologique et on homognise bien laide dun vortex. Inoculation de la galerie :

Cupule Tube

Il faut remplir tubes et cupules des tests CIT VP GEL, et remplir uniquement les tubes des autres tests. Il faudra crer une anarobiose dans les tests ADH LDC ODC H2S URE en rajoutant de lhuile de paraffine dans leur cupule. Afin dviter la dshydratation de la galerie celle-ci sera place dans une bote dincubation contenant des alvoles quon remplira deau afin de crer une atmosphre humide. Puis incube 24h minimum 37C. Lecture : La lecture de certains tests ne se fait pas directement : Dans la cupule TDA, il faudra rajouter une goutte du ractif TDA ; une couleur marron indique une raction positive Une goutte du ractif IND sera ajoute dans la cupule IND. Un anneau rouge traduira une raction positive. Une goutte de ractif VP1 et VP2 sera ajout la cupule VP. Une couleur rose apparaissant au bout de 10 min indique une rponse positive. Rq : si la cupule GLU est positive, on pourra raliser le test de la nitrate rductase en rajoutant Nit1 et Nit2, puis du zinc si la raction est ngative afin de mettre en vidence la prsence ventuelle dune nitrate rductase ainsi que son stade doxydation (NO 2 ou N2).

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Rsultats :

En comptabilisant les rsultats positifs et ngatifs on obtient un profil numrique : 12055735 qui correspond Rahnella aquatilis

Quelques informations sur la bactrie trouve

Rahnella aquatilis tait prcdemment connu comme Enterobacter cloacae-like class H2. Cest dans les annes 80 quelle est venue rejoindre la famille des Enterobacteriaceae . Cest une bactrie qui se rencontre quexceptionnellement dans les fces et qui peut se multiplier dans des eaux de boisson de qualit relativement bonne.

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Correspondance DO600 et nombre de cellules/ml Afin de dterminer la correspondance entre la DO et le nombre de cellules par mL Nous allons suspendre un peu de notre bactrie dans un tube contenant de leau physiologique. Aprs avoir dilu lchantillon au 1/20me ; on mesure la DO. On obtient : 0.08 dunit dabsorbance. Ce qui correspondrait une DO de 1.6 si lchantillon ntait pas dilu. En se basant sur le fait que : 8 1 Do 10 cellules/mL au maximum On peut estimer le nombre de cellules : 8 1.6 DO 1.6 x 10 cellules/mL Sur un milieu, on considre un nombre comptable entre 30 et 300 UFC. Je choisi donc de calculer la dilution adq uate afin dobtenir 160 colonies. 8 6 La dilution de rfrence correspondante est : 1.6 x 10 / 160 = 10 Fautes de botes de milieu de culture nous navons pu encadrer cette dilution, nous avons raliser les dilutions 10 -6 et 10 -7 en ensemencent en surface 2 botes par dilution avec 0.1 mL de la dilution. Nous avons obtenu les rsultats suivants : 10-6 Inc Inc Inc 10-7 1600 1600 1600

Bote 1 Bote 2 Moyenne Ce qui correspond un nombre de : 1600 x 10 7 x 1/0.1 = 1.6 x 1011 cellules/mL

Une Do de 1.6 correspond 1.6 x 10 11 Cellules/mL 11 Donc 1 x 10 cellules/mL correspondent une DO de 1 Pour Rahnella aquatilis une DO de 1 correspond une population de 1 x 10 cellules/mL
11

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Actinomyctes
LES MICRO-ORGANISMES DU SOL: SOURCE PRINCIPALE DES ANTIBIOTIQUES Les producteurs d'antibiotiques les plus fconds sont les Actinomyctales, un ordre de bactries filamenteuses qui sont prsentes dans le sol. Elles produisent plus de la moiti des antibiotiques.Les actinomyctes sont des bactries filamenteuses, ramifies, communment rencontres dans la nature (sol, eau). Les Actinomyctes sont des Bactries dont la croissance donne lieu des colonies constitues dhyphes, cest --dire de filaments qui irradient, par croissance centrifuge, tout autour du germe qui leur a donn naissance. Cela explique leur dnomination : le mot Actinomyctes provient de deux substantifs grecs et signifie Champignons rayons ou Champignons rayonnants . Les formes les plus volues des Actinomyctes rivalis ent en complexit morphologique avec les moisissures (Champignons imparfaits) mais en diffrent radicalement puisque, comme toutes les autres Bactries, ce sont des Procaryotes (cellules sans enveloppes autour du matriel gntique). Un corollaire de leur structure cytologique est le diamtre de leurs hyphes qui est de lordre de 0,5 mm, soit approximativement un dixime de celui de la plupart des hyphes fongiques. Les Actinomyctes sont les plus prolifiques de tous les micro -organismes en tant que producteurs dantibiotiques. Parmi les espces appartenant aux diffrents genres dActinomyctes, les Streptomyces sont les plus importants producteurs dantibiotiques et autres mtabolites secondaires. On peut estimer que 75% des antibiotiques isols des Actinomyctes sont produits par des Streptomyctes - Les aminoglycosides (streptomycine, nomycine, kanamycine, gentamicine). - Les macrolides (rythromycine) ; - Les ansamycines (rifamycine) ; - Les bta-lactames (thinamycine) ; - Les peptides (viomycine, thiostrepton, actinomycine, pristinamycine) ; - Les anthracyclines (adriamycine) ; - Les ttracyclines (chlorttracycline, oxyttracycline) ; - Les nuclosides (puromycine) ; - Les polynes (nystatine, candicidine, amphotricine B) ; - Les polythers (monensine). Afin de mettre en vidence la prsence de la scrtion dun antibiotique, nous allons dans un premier temps vrifier une des caractristiques de lespce : la prsence dune structure filamenteuse caractristique. Pour cela nous disposons sur une glose GN, de 8 souches qui ont t isoles partir de nos diffrents chantillons de sol.

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Aprs observation microscopique, on constate que les souches 1 et 5 ne sont pas filamenteuses. En parallle nous avons observ au gram une colonie sur milieu au char bon. Cest un milieu slectif des actinomyctes. Les actinomyctes ont un aspect macroscopique caractristique :

Ceci nous a permis dobserver leur structure filamenteuse en spirale et ainsi caractriser lappartenance ou non des souches 1 8 lespce.

Afin de voir la prsence dantibiotiques produit par les actinomyctes, on coule une surcouche BN + agar 0.5% + microorganisme testeur (9mL de BN + agar et 1 mL de culture) Nous avons ralis cela sur 5 souches diffrentes : Escherichia coli Bacillus megaterium Serratia Marcescens Micrococcus flavus Pseudomonas aeruginosa 1 2 3 4 5 6 7 20 mm 16 mm 8

Escherichia coli Bacillus megaterium Serratia Marcescens Micrococcus flavus Pseudomonas aeruginosa
23 mm

8 mm

On peut constater que la souche 7 scrte un ou plusieurs antibiotiques auxquels Escherichia coli et Micrococcus flavus sont sensibles. On peut constater que la souche 4 scrte galement un ou plusieurs antibiotiques auxquels Bacillus megaterium et Micrococcus flavus sont sensibles.

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Les champignons microscopiques (myctes) se divisent en deux groupes : - Les champignons unicellulaires ou levures - Les champignons filamenteux ou moisissures

Les Champignons microscopiques

Levures

1) Les levures On appelle levures les champignons microscopiques de type unicellulaire ou prsentant dans leur cycle biologique une phase cellulaire prpondrante. Il en existe deux classes : - ascomyctes : Les spores sont contenues dans un sac (ascospore) - basidiomyctes : Les spores se retrouvent dans des structures externes (basides). Possdant un polymorphisme frquent au niveau de la taille ou de lorganisation : formes mycliennes ou pseudo mycliennes ; et pouvant parfois tre polynucl chez les levures faisant des mycliums . Cest donc sur ces critres morphologiques et physiologiques que nous allons nous baser pour identifier les levures. La forme, la taille, le mode de reproduction (sexu ou asexu), sont donc une partie des caractres didentification des levures. 2) Le dnombrement direct La mthode directe seffectue laide dune cellule de comptage, on dnombre tous les germes arobies ou anarobies, vivants ou morts. Les germes sont dnombrs laide dune lame spciale appele cellule de comptage . Elle comporte un quadrillage calibr ou rseau. Sur la lame, on compte les cellules dans plusieurs champs microscopiques. Le rsultat du dnombrement sexprime en nombre de cellules par mL.

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2.1) La cellule de Thoma

Le quadrillage de la cellule de Thoma est constitue dun grand carr de 1mm de ct (rstu) divis en 400 petits carrs de 0.05 mm de ct. Certains petits carrs sont regroups par 16 en carrs moyens de 0.2 mm de ct, spars les uns des autres par une range de petits carrs stris (rstu).

40

Lorsque la lamelle plane est dpose sur la plate-forme centrale, la profondeur de la chambre est de 0.1 mm.

La chambre correspondant au grand carr a un volume de : V = 1 * 1 * 0.10 = 0.1 mm

3

Le paralllpipde correspondant au carr moyen a un volume de : V = 0.20 * 0.20 * 0.10 = 0.004 mm3

Ici, nous appliquons la technique de comptage directe aux levures. 3) Comptage des levures la cellule de Thoma Rsultats : En comptant dans un carr moyens nous trouvons :

14 20 20 19

33 20 17 19

34 9 17 16

33 27 20 15

Observation de levures en cellule de Thoma

Ce qui fait un total de 323 levures dans un volume de 0.004 mm soit dans 4.10 Le nombre de levures par mL est donn par la formule : N= 323/4.10 -6 Il y a donc 8.1 x 107 levures/mL

-6

mL

41

4) Observation de levures de collection

Nom

Taille (m) 10 5 5 5 7 5 9 6

Forme Sphrique Ovode Sphrique (unicellulaire) Apicule Ovode Sphrique Sphrique cylindrique

Mode de division Bourgeonnement Bourgeonnement Bourgeonnement Bourgeonnement Bourgeonnement Bourgeonnement

Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces lactis Pichia scolyti Klockera apiculata Saccharomyces oviformis Debaromyces sp Trichosporon sp

Formation de Pseudomyclium Pseudomyclium Tubes germinatif s

Pseudomyclium Myclium Tubes germinatifs Arthrospores

Schizosaccharomyces octosporus
Cest une levure qui se divise par fission. Il contient des asques avec 8 spores

Sporobolomyces salmonicolor
Cest une levure ovode, qui se divise par bourgeonnement. La spore se situe au bout dun pdicelle, et est remplie de liquide. Lorsque la pression est trop forte, la spore est jecte. Cest ce qui se traduisait par les petites gouttelettes sous le couvercle de la bote.

Schma :

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5) Observation de nos levures A partir de nos isolements ralis sur milieux Malt agar +Cloramphnicol, nous avons pu isoler 3 levures diffrentes provenant du lait. Souche 1 2 3 Taille (m) 3 3 3 Forme Ovode Ovode Ovode Mode de division Bourgeonnement polaire Bourgeonnement polaire Myclium Bourgeonnement polaire

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Moisissures

1) Gnralits On dsigne sous le nom vaguement scientifique de moisissures toute une srie de champignons appartenant en ralit des groupes taxonomiques trs divers. Tout aussi prolifiques que les bactries, les moisissures sont capables de se dvelop per et de s'adapter des conditions les plus extrmes. Il en existe plusieurs dizaines de milliers d'espces. Ces champignons microscopiques sont pluricellulaires, composs de filaments ou hyphes constituant un ensemble appel myclium. Ce myclium peut porter des structures de reproduction avec des spores souvent nombreuses, dont la dimension peut varier de 1 plusieurs dizaines de microns, suivant les espces et le type. Il existe deux modes de reproduction: sexu et asexu(s). Dans le cas de la reproduction asexue, le champignon met une multitude de spores minuscules. L'identification se fait, entre autres, en fonction des caractristiques du "porteur de spores " ou conidiophore (asexu). En l'absence de conidiophore, on parle de myclium strile, car l'identification n'est pas ralisable. Les moisissures sont connues pour les substances anti-bactriennes quelles scrtent : les antibiotiques ; elles synthtisent galement des toxines, ou mycotoxines, et des substances volatiles pouvant tre hautement nuisibles pour la sant. L'identification des espces repose sur des critres morpho-ontogniques qui accordent une grande importance l'aspect macroscopique du champignon (aspect, couleur et odeur des colonies), la morphologie des spores et l'ontognie de ces spores, c'est--dire la conidiogense (aspect, couleur et structure des conidiophores). 2) La mthode dobservation

Le plus souvent, l'observation microscopique des moisissures ne requiert aucune coloration. Cependant, en mettant un colorant, on peut mettre en relief certaines structures. Les deux colorants les plus utiliss sont le "bleu coton" et le "lactofuschine". 2.1) Le colorant utilis

Bleu coton lactique

Cest une solution 0,1% de bleu coton dans de lacide lactique pur ou dilu de moiti. Il colore le contenu cellulaire et certaines ornementations sporiques et permet la mise en vidence de la "cyanophilie" (coloration bleue des spores ou des hyphes par le colorant).

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2.2) La prparation La mthode consiste dcouper au du champign on, laide dun scalpel un petit morceau rectangulaire.

De le dposer sur une lame sur la tranche et denlever au maximum la glose en surplus.Aprs il suffit de mettre dessus une petite goutte de colorant, et de dposer une lamelle. A laide dune allumette on tapotera dessus afin dcraser la prparation. On pourra saider de la veilleuse du bec bunsen pour rchauffer la glose, en faisant attention ne pas trop chauffer. La prparation sobserve comme un tat frais, au grossissement x40.

3) Observation de nos souches 3.1) Souche n1

Colonie : thalle bleu vert, daspect poudreux, colonie rase, marge blanche. Revers orang. Hyphes : cloison nombreuses septomyctes Conidies : Elles sont de forme sphrique, de 2 de large, ne possdent pas de cloisons, paroi lisse et vert clair. 3.2) Souche 2 Colonie : arienne, avec des spores noires, poilue, grise, filamenteuse, possdant un revers jauntre peu color, trs envahissante Hyphes : Ils sont assez gros, de taille homogne 10-20 m, peu cloisonns siphomyctes Conidies : Elles sont de forme ovale 4x7-10, ne possdent pas de cloison, de couleur jaune-gris. Lornementation est fine et lgrement rugueuse Larrangement peu tre diffrent :

Columelle 45

4) Observation de souches de collection Geotrichum (Septomyctes) Colonie : thalle blanc croissance rapide, blanc lisse, souvent d'aspect membraneux ou velout, odeur doutre. Revers clair. Hyphes : septs rampants, embranchements dichotomiques de 8-10 m d'paisseur. Conidies : rectangulaires de taille 5-103-6 m 2010 m, formes par dsarticulation des hyphes fertiles, les chanes sont le plus souvent ariennes, riges.

Myclium

Arthrospore ou arthroconidie

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Aspergillus

Colonie : marron -noire avec marge blanche, rase, plisse dessous, revers jaune. Hyphes : Deux types 1-5 m et 10-15m d'paisseur. Conidies :

Ttes conidiennes bisries (quelquefois unisries) radies, de couleur vert jaune vert-olive, rondes de taille 3-4 m, lisse, en chanette, et ne possdant pas de connectif visible,
unicellulaire. Conidiophore :

Conidiophores pouvant atteindre 1mm, parois rugueuses renfle en vsicules sphriques lgrement allonges, de 25-45 m de diamtre.
Spores : exognes

Phialides : verdtres, de 6-104-6 m, groupes sur les trois quarts suprieurs de la surface de la vsicule.

Phialide Conidie Mtule

Spore ou conidie

Conidiophore

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