Les milieux de culture en bactériologie

1- Définition

Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-organismes peuvent se multiplier. Il doit
donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié ce qui implique :
- couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter la source de carbone
et d’énergie ;
- présenter un pH voisin du pH optimal ;
- présenter une force ionique optimale (le milieu peut être isotonique mais ce n’est pas
obligatoire).

2- Les différents types de milieux

Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences nutritives des micro-
organismes. On distingue généralement :

- les milieux synthétiques de composition exactement connue, qualitativement et

quantativement. Ces milieux sont surtout utilisés pour l’étude des bactéries autotrophes ou
pour étudier les besoins nutritifs d’un germe. Ils sont rarement utilisés en routine à l’exception
de quelques uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen, Urée-Tryptophane…
- Les milieux empiriques de composition connue seulement avec approximation car dépendant
des matières premières utilisées : extrait de viande ou de levure, peptones, sucres et
éventuellement liquides biologiques (sérum, sang…) mais qui conviennent aux
micro-organismes étudiés. Ce sont les milieux les plus employés aujourd’hui. Exemple : LB,
Columbia, Gassner, Tryptycase soja, Chocolat, …

Une autre distinction de milieu se fait par la consistance de ceux-ci. En effet, les micro-organismes se
développent parfaitement dans les milieux liquides mais l’isolement bactérien nécessite des milieux solides afin
de séparer les différents germes présents dans un prélèvement. On obtient les milieux solides en ajoutant un
agent gélifiant à un milieu liquide. Les produits les plus utilisés sont :

* l’agar-agar ou gélose : il s’agit d’un polygalactoside sulfaté présentant la propriété de former avec l’eau un
gel solide à une température inférieure à environ 60 °C tout en étant liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste
en surfusion (liquide) jusqu’aux environs de 45°C. D’autre part, très peu de micro-organismes sont capables
d’hydrolyser l’agar. Il s’agit donc du procédé le plus utilisé pour fabriquer des milieux solides, l’addition de
diverses autres molécules ne posant aucun problème particulier dans ce milieu aqueux. Les milieux solides
destinés à être coulés en boîte de Pétri ou en tube ont une teneur en gélose assez élevée (15 g.L -1) tandis que les
géloses molles ou semi-solides sont peu gélosées (3 à 5 g.L-1) et présentent une consistance intermédiaire.

* La gélatine : dérivé de l’osséïne, la gélatine après traitement est solide mais présente deux inconvénients
majeurs : elle se liquéfie à une température très faible (34-35 °) et peut être hydrolysée par de nombreux
micro-organismes. Son utilisation est donc délicate et historique.

* Œufs entiers coagulés. cette méthode n’est utilisée que pour le milieu de Jensen et ses dérivés.

* Sérum de bœuf coagulé par la chaleur. outre sa capacité de solidification du milieu, il apporte de
nombreuses molécules utilisables par les germes. Cependant, son emploi est restreint a des milieux comme le
milieu de Loeffler.

3- Préparation des milieux de culture

La préparation des milieux de culture conditionne les résultats de l’analyse microbiologique. Un défaut de
fabrication, une stérilisation mal conduite risquent d’annuler les efforts ultérieurs des techniciens. Un grand soin
doit donc être apporté à leur fabrication.

Il est indispensable de lire attentivement les conseils du fabricant. La conservation des poudres doit se faire à
l’abri de l’humidité car elles sont très hygroscopiques (captent les molécules d’eau atmosphérique).
Le protocole général est le suivant :

- prévoir le volume de milieu nécessaire ;

- mesurer la masse nécessaire de poudre et d’éventuels additifs.
- mettre les poudres en suspension dans le volume de diluant (eau distillée en général) inférieur
au volume nécessaire ;
- chauffer pour dissoudre si necessaire en agitant (à ébullition en général) ;
 - ajouter le complément de diluant ;
- rectifier le pH par addition de NaOH ou HCl à 1 ou 0.1 mol.L -1 à l’aide d’un pH-mètre sauf si
le fabricant indique le contraire ;
- conditionner, en prenant garde à la solidification d’un milieu contenant de l’agar et en
respectant les contraintes de volume pour certains milieux ;
- stériliser, éventuellement à l’autoclave ou par filtration, assez rapidement après la fabrication.
attention, certains milieux ne doivent pas être autoclavés (Hektoen, SS,…). Il est possible de
stériliser par utilisation, dans certaines conditions, d’un four à micro-ondes (technique
KORANO) ;
- à la sortie de l’autoclave, certains milieux doivent être inclinés (Gélose inclinée, Kliger-
Hajna…) ou supplémentés en composés ne supportant pas la stérilisation. Dans ce cas, attendre
que le milieu atteigne 45-50°C, ajouter stérilement le complément et agiter avant de
conditionner ;
- stocker les milieux à l’abri de la lumière. Pour les milieux liquides se méfier de leur
inclinaison car du liquide risque éventuellement de sortir du tube et de provoquer une
contamination de l’ensemble du lot.

Le conditionnement peut être :

- en tube de faible diamètre et court (ADH, LDC, ODC) ou long (VF) ;

- en tubes normaux ;
- en tube de grand diamètre ;
- en flacon (hémocultures)
- en boîte de Pétri (conservation limitée au réfrigirateur ou en chambre froide, boîtes retournées
pour éviter la condensation sur le couvercle). La conservation au froid est possible pour une
durée plus longue à condition de placer les boîtes en emballages scellés comme les boîtes de
milieux prêts à l’emploi.
- Des bouchons à vis étanches sont préférables au coton pour éviter la déshydratation.

4- Description de quelques milieux

3-1 Les milieux non sélectifs

On regroupe sous ce vocable tous les milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en général de
préparation assez simple et généralement peu coûteux. Ces milieux contiennent une base nutritive constituée de
molécules azotées (acides aminés, facteurs de croissance diverses…) provenant de l’hydrolyse de produit
d’origine vivante (animale, végétale, mycélienne) comme les peptones, les extraits de viande ou de levure.
Suivant l’origine des peptones, les micro-organismes se developpant sont différents ; les peptones simples et de
viande permettent la culture de germes n’ayant pas d’exigences nutritives particulières comme les
Staphylococcus, les Enterobactéries, les Pseudomonas, les Vibrio, les Bacillus… Au contraire, les peptones
riches et les différents extraits permettent la pousse de micro-organismes plus exigeants comme par exemple les
Streptococcus, les Pasteurella, les Corynebacterium, les Neisseria etc….

Souvent, les milieux non sélectifs comportent une molécule et son système de révélation (sucre le plus souvent)
ce qui permet une première discrimination des genres mais ce n’est pas obligatoire.

Voyons quelques exemples :

Le milieu LB (bouillon ou gélose)(milieu Luria Bertoni)

Peptone neutres 10 g.L-1

Extrait de levure 5 g.L-1
Chlorure de sodium 10 g.L-1
(Agar 15 g.L-1)

Ce milieu simple permet la pousse de la plupart des germes couramment rencontrés ( Micrococcacea,
Enterococcus, Bacillus, Enterobacteriaceea, Pseudomonaceae, Alcaligenaceae, Vibrionaceae) Il ne donne
aucun renseignement biochimique.

Le milieu Tryptycase-Soja (bouillon ou gélose)

Peptone trypsique de caséïne 15 g.L-1

Peptone papaïnique de soja 5 g.L-1
Chlorure de sodium 5 g.L-1
(Agar 15 g.L-1)

Ce milieu un peu plus riche permet la pousse de germes un peu plus exigeants que le milieu précédent.
(notamment, les Brucella, les Pasteurella, certains Streptococcus…)
 La Gélose lactosée au bromo-crésol pourpre (GL BCP)

Peptones neutres 5 g.L-1

Extrait de viande 5 g.L-1
Lactose 5 g.L-1
Bromocrésol pourpre 25 mg.L-1
Agar 15 g.L-1

Ce milieu, très proche du milieu LB, permet la pousse des mêmes germes. Cependant la présence de lactose et
d’un indicateur de pH (BCP) permet de différencier les germes LACTOSE + (jaune) des germes LACTOSE –
(violet).

La gélose Mueller-Hinton

Infusion de viande de bœuf 300 ml.L-1

Peptone de caséine 17.5 g.L-1
Amidon de maïs 1.5 g.L-1
Agar 17 g.L-1

Ce milieu riche est la gélose de référence pour la réalisation d’antibiogramme selon la méthode de Kirby-Bauer.
Sa composition (notamment la concentration en magnésium, en calcium, en thymine et en thymidine), son
épaisseur sont standardisées (norme standards M6-P du NCCLS). Il permet la pousse de nombreux
micro-organismes

3-2 Les milieux non sélectifs enrichis

Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des liquides ou suspensions riches en molécules
organiques diverses : du sang, du sérum, du liquide d’ascite, de l’extrait globulaire, des suppléments
polyvitaminiques… Les qualités nutritives peuvent être améliorées par dénaturation thermique des constituants,
en particulier pour le sang. Ils permettent la pousse de nombreux germes exigeants ou très exigeants. Les plus
utilisées sont les géloses au sang frais ou au sang cuit, et la gélose chocolat.

Les géloses au sang frais et au sang cuit

L’addition de sang au milieu de base peut avoir plusieurs buts :

- apporter des facteurs de croissance nécessaire au micro-organisme étudié
- neutraliser certains inhibiteurs contenus dans les petones des milieux
- neutraliser, du fait de l’action peroxydasique et catalasique de l’hémoglobine, des ions superoxydes ou
des peroxydes toxiques produits par le micro-organisme (intéressant en particulier pour les bactéries
catalase – comme les Streptococcaceae)

Par ailleurs, il permet la lecture d’un caractère important lors de la détermination du germe : l’hémolyse.
Le sang peut être d’origines diverses : cheval, mouton, lapin, homme, bœuf (attention certains germes présentent
un type d’hémolyse sur un sang et un autre type d’hémolyse avec un autre sang). Il est à ajouter à raison de 5 à
10% au milieu de base (Columbia, Tryptycase soja, Mueller Hinton, cœur cervelle). Celui-ci ne doit pas contenir
de glucose, car il inhibe les hémolysines.
Pour obtenir une gélose au sang cuit, on porte le mélange liquide à 75°C pendant 10 minutes en agitant. Après
refroidissement à 45°C on coule en boîtes de Pétri.
La cuisson du sang se justifie par la libération de certains facteurs de croissance et la destruction de certains
inhibiteurs. En effet, il y a libération de fer III, NAD et NADP (concentration proche de 40 mg.L -1), destruction
de la NAD hydrolase…

La Gélose chocolat

La gélose chocolat et la gélose au sang cuit sont différentes par leur préparation mais leurs usages est similaire.
Cependant, la gélose chocolat est plus pauvre en facteurs de croissance que la gélose au sang cuit car elle ne
contient que l’hémoglobine du sang et la cuisson est plus énergique. C’est pour cette raison qu’elle est souvent
supplémentée à l’aide de solutions polyvitaminiques, polyioniques et glucosées.

La préparation est plus simple que celle de la gélose au sang cuit. En effet, la base (Mueller-Hinton le plus
souvent) et une solution d’hémoglobine (concentration finale 10 g.L -1) sont melangées et autoclavées
directement. Après refroidissement, on ajoute le supplément stérilement et on coule en boites de Pétri

Exemple de composition du mélange PolyVitex de BioMérieux® :

Cobalamine (vit B12) 10 mg.L-1

L-Glutamine 10 000 mg.L-1
Adénine 1000 mg.L-1
Chlorhydrate de guanine 30 mg.L-1
Ac. Para amino benzoïque 13 mg.L-1
L-Cystine 1100 mg.L-1
Glucose 100 000 mg.L-1
NAD 250 mg.L-1
Thiamine pyro-phosphate 100 mg.L-1
Nitrate de fer III 20 mg.L-1
Chlorhydrate de thiamine 3 mg.L-1
Chlorhydrate de cystéine 25900 mg.L-1

3-3 Les milieux sélectifs

Les milieux sélectifs sont des milieux empêchant la culture de certains micro-organismes. Ils sont utilisés pour
l’isolement bactérien dans des produits polymicrobiens. La sélection peut être chimique ou antibiotique. Ce sont
des milieux riches ou non et donnant souvent un ou plusieurs caractères biochimiques d’orientations permettant
une identification plus simple des germes.

La gélose Gassner

La gélose de Gassner est une gélose sélective des germes Gram négatifs non exigeants (Enterobacteriaceae,
Vibrionaceae, Pseudomonaceae, Alcaligenaceae) Son activité sélective est due au Jaune métachrome. Par
ailleurs, il contient du lactose et du Bleu à l’eau (indicateur pH) qui permettent de différencier les germes
LACTOSE + (bleu) des germes LACTOSE – (jaune). Utilisé en Belgique et en Allemagne ce milieu est
remplacé par la gélose Mac Conkey (ou Drigalski) ailleurs.
 Souche Lactose + Souche Lactose -

La gélose Mac Conkey

Cette gélose est équivalente à la gélose de Gassner. En effet, elle permet la pousse des mêmes germes et donne le
caractère LACTOSE. Les différences viennent de la méthode d’inhibition (sels biliaires et cristal violet) et de
l’indicateur pH ( Rouge neutre : colonies LACTOSE + rouges et colonies LACTOSE – jaunes ou incolores)

La gélose de Chapman

Cette gélose permet la pousse sélective des germes de la famille des Micrococcaceae (Staphylocoques et
Microcoques). Son activité inhibitrice sur les autres germes est due à la forte concentration en chlorure de
sodium. Elle contient également du mannitol et un indicateur pH (rouge de phénol) qui permettent de lire le
caractère MANNITOL de chaque colonie : colonies rouges/fushia MANNITOL -, colonies jaunes MANNITOL
+.

Souche mannitol + Souche mannitol -

La gélose au Sang ANC

C’est une gélose Columbia au sang frais à laquelle a été ajoutés deux antibiotiques : l’acide nalidixique et la
colistine ce qui permet d’inhiber l’ensemble des Gram négatifs. Il s’agit donc d’une gélose sélective des Gram
positifs. Elle est très fréquement utilisée lors de prélèvements buccaux ou pharyngés mais peut être employée
dans de nombreux autres cas.

La gélose d’Edwards

Ce milieu sélectif des Streptococcus est essentiellement utilisé pour la recherche et la différenciation des
Streptocoques responsables de mammites chez le bovin. En effet, l’action du cristal violet et du sulfate de
thallium inhibent tous les autres germes. De plus, ce milieu permet de différencier les Streptococcus agalactiae
(colonies incolores ou bleues sous lampe UV) des Streptocoques du groupes D de Lancefield (colonies noires)
par la présence d’esculine.

En lumiere du jour : En lumiere UV :

 Le milieu de Schiemann (ou YERSINIA CIN)

La recherche des Yersinia (et particulièrement Yersinia enterocolitica et Y. pseudotuberculosis) se fait sur cette
gélose sélective. L’action sélective est due à la combinaison d’un mélange d’antibiotiques (Cefsulodine, Irgasan,
Novobiocine) et d’une incubation particulière à 30°C. Les colonies rouges sont MANNITOL +, les colonies
incolores sont MANNITOL -.

3-4 Les milieux d’enrichissement

La présence de certaines bactéries à pouvoir pathogène spécifique dans un prélèvement, a une signification
pathologique indiscutable, même si elles sont peu représentées. C’est le cas par exemple des Salmonella, des
biotypes entéropathogènes, de Yersinia enterocolitica, des vibrions cholériques ou encore des Listeria ou des
Enterocoques. Quelques fois, leur proportion peut être minime par rapport à celle de la flore commensale et leur
présence ne peut être révélée par un isolement (sélectif). L’absence de colonies suspectes sur l’isolement sélectif
ne suffit pas pour affirmer l’absence de ces bactéries dans le prélévement. C’est pourquoi un enrichissement est
mis en route en même temps que l’isolement (sélectif).

Enrichir, c’est augmenter la représentation (proportion) d’un sous-groupe de micro-organismes dans un

ensemble plus vaste.

Un milieu d’enrichissement réunit deux caractéristiques :

- il contient des molécules à action sélective inhibant totalement ou partiellement la culture des
micro-organismes non recherchés ou utilise une température d’incubation particulière, ou encore une
atmosphére particulière ;
- il est liquide (bouillon) afin que son action sélective s’exerce sur une population importante et
homogène.

Prenons l’exemple d’un mélange Salmonella-Coliformes dont le rapport entre les deux populations est de 1/10 10.
L’étalement sur un milieu sélectif nous donne une colonie de Salmonella pour 10 8 colonies de coliformes : il sera
impossible de l’exploiter Supposons que les coliformes soient inhibés à 99% par les agents sélectifs (la donnée
chiffrée est tout à fait fictive). Dans un milieu d’enrichissement, les populations évoluent comme suit si l’on ne
tient pas compte des différences de taux de croissance :
1ère génération 1/108
2ème génération 1/106
3ème génération 1/104
4ème génération 1/102
5ème génération 1/100 = 1 égalité des populations de Salmonella et de Coliformes.
Un isolement réalisé à partir de ce dernier sera exploitable…

Enrichissement en Salmonella

Il existe plusieurs milieux pour l’enrichissement en Salmonella . Les plus utilisés sont les bouillons au sélénite,
de Müller-Kauffman ou de Rappaport. Ces milieux utilisent le sélénite, le tétrationate ou le vert malachite
comme agent inhibant. On peut par ailleurs améliorer l’efficacité du bouillon en incubant à 42-43°C.

Bouillon Rappaport-Vassiliadis

Enrichissement en Vibrio (notamment V.cholerae)

On utilise la faculté de ces germes à pousser en milieu alcalin afin d’enrichir un prélèvement. Le milieu le plus
utilsé est l’eau peptonée alcaline (pH= 8.4)

Enrichissement en Listeria et Yersinia

Il n’existe pas de milieux spéciaux pour enrichir un prélèvement en Listeria ou Yersinia. On utilise un bouillon
nutritif ou un bouillon trypticase-soja que l’on incube à 4°C. En effet, seuls ces germes continuent de se
multiplier « normalement » à cette température.

Enrichissement en Enterococcus

Les Streptococcus du groupe D de Lancefield ont une importance en microbiologie alimentaire car ils signent
souvent une contanimation fécale. Présents parfois en très faible quantité, on utilise le bouillon de Rothe afin
d’en augmenter le nombre dans un prélèvement.. En effet, celui-ci contient de l’azide de sodium qui inhibe la
quasi totalité des germes sauf les Enterococcus…