Techniques de

culture au laboratoire

Université 20 Aout 1955-Skikda.

OMBM

Dr. Nadjet ENNAGHRA

03.02.2021
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 Table des
matières
Objectifs 3

Introduction 4

I - I. Les milieux de culture en bactériologie 5

1. 1. Définition ................................................................................................................................................... 5

2. 2. Les différents types de milieux ............................................................................................................... 5

2.1. L'enrichissement : ................................................................................................................................................................... 8

II - II. Techniques d'isolement et d'identification 9

1. 1. Principe ..................................................................................................................................................... 9

2. 2. Isolement sur boîte de Pétri .................................................................................................................... 9

3. 3. Isolement sur gélose inclinée ............................................................................................................... 10

III - III. Identification biochimique 12

1. 1. Caractères enzymatique ....................................................................................................................... 12

2. 2. Caractères biochimiques ...................................................................................................................... 13

 Objectifs
Ce cours a pour objectifs de :

- Connaître les différents milieux de culture des micoorganismes.

- Maîtriser les différentes techniques d'isolement des différents types des

microorganismes.

-Mettre en évidence l'identification des microorganismes par différentes

méthodes.

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 Introduction

La culture microbienne est une technique de laboratoire de développement contrôlé de micro-organismes,

croissance in vitro, en principe d'une seule souche bactérienne. Ces cultures facilitent donc l'étude des
souches bactériennes

Les techniques de culture sont nombreuses ; elles varient en fonction :

• de la nature du prélèvement : surfaces, pus, sécrétions, selles, organes, broyages ...

• des buts de l'étude : identification, dénombrement, antibiogramme...

• de la précision attendue : dans le cas de bactéries pathogènes par exemple,

• des moyens à disposition du chercheur : matériel, temps, ...

Parmi les techniques fréquemment employées, on trouve l'ensemencement d'une souche en boîte de Petri,
tube à essai, ou galerie : Il s'agit de placer des bactéries à la surface ou à l'intérieur d'une gélose. Les
géloses contiennent des éléments nécessaires à la croissance bactérienne, des produits inhibiteurs qui les
rendent sélectifs et des indicateurs (pH et colorants) qui les rendent différentiels. On place les cultures
microbiennes à une température favorable (en général 35 °C) pendant environ une journée (24 heures)
dans une atmosphère, soit aérobie, anaérobie ou microaérophilie. Les bactéries ainsi obtenues serviront à
une série de tests permettant de déterminer, selon le(s) but(s) de l'étude :

• le dénombrement des micro-organismes (dans le cas d'un contrôle sanitaire par exemple) ;

• l'identification de la bactérie dans le cas d'une souche pure, ou des bactéries présentes (par exemple pour
trouver l'agent responsable d'une infection) ;

• la réalisation d'un antibiogramme, afin de déterminer la sensibilité des bactéries, et de trouver un

traitement adapté à une infection.

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 I. Les milieux de culture en bactériologie

I. Les milieux de
culture en I
bactériologie

1. Définition 5
2. Les différents types de milieux 5

1. 1. Définition
Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-organismes peuvent se
multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié ce qui implique :

-Couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter la source de carbone et
d'énergie ;

-Présenter un pH voisin du pH optimal ;

-Présenter une force ionique optimale (le milieu peut être isotonique mais ce n'est pas obligatoire).

2. 2. Les différents types de milieux

Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences nutritives
des micro-organismes. On distingue généralement :

a. Les milieux synthétiques

de composition exactement connue, qualitativement et quantativement. Ces milieux sont surtout

utilisés pour l'étude des bactéries autotrophes ou pour étudier les besoins nutritifs d'un germe. Ils sont
rarement utilisés en routine à l'exception de quelques uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen,
Urée-Tryptophane...

b. Les milieux empiriques

de composition connue seulement avec approximation car dépendant des matières premières utilisées
: extrait de viande ou de levure, peptones, sucres et éventuellement liquides biologiques (sérum,
sang...) mais qui conviennent aux micro-organismes étudiés. Ce sont les milieux les plus employés

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 2. Les différents types de milieux

aujourd'hui. Exemple : LB, Columbia, Gassner, Tryptycase soja, Chocolat, ...

Une autre distinction de milieu se fait par la consistance de ceux-ci. En effet, les micro-
organismes se développent parfaitement dans les milieux liquides mais l'isolement bactérien
nécessite des milieux solides afin de séparer les différents germes présents dans un
prélèvement.

On obtient les milieux solides en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide. Le gélifiant le
plus utilisé est l'agar-agar ou gélose : il s'agit d'un polygalactoside sulfaté présentant la propriété
de former avec l'eau un gel solide à une température inférieure à environ 60 °C tout en étant
liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste en surfusion (liquide) jusqu'aux environs de 45°C.
D'autre part, très peu de micro-organismes sont capables d'hydrolyser l'agar. Il s'agit donc du
procédé le plus utilisé pour fabriquer des milieux solides, l'addition de diverses autres molécules
ne posant aucun problème particulier dans ce milieu aqueux. Les milieux solides destinés à être
coulés en boîte de Pétri ou en tube ont une teneur en gélose assez élevée (15 g.L-1) tandis que
les géloses molles ou semi-solides sont peu gélosées (3 à 5 g.L-1) et présentent une
consistance intermédiaire.

c. Les milieux non sélectifs

On regroupe sous ce vocable tous les milieux ne contenant aucune molécule inhibitrice. Ils sont en
général de préparation assez simple et généralement peu coûteux. Ces milieux contiennent une base
nutritive constituée de molécules azotées (acides aminés, facteurs de croissance diverses...)
provenant de l'hydrolyse de produit d'origine vivante (animale, végétale, mycélienne) comme les
peptones, les extraits de viande ou de levure.

d. Les milieux non sélectifs enrichis

Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des liquides ou suspensions riches en
molécules organiques diverses : du sang, du sérum, du liquide d'ascite, de l'extrait globulaire, des
suppléments polyvitaminiques... Les qualités nutritives peuvent être améliorées par dénaturation
thermique des constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la pousse de nombreux germes
exigeants ou très exigeants. Les plus utilisées sont les géloses au sang frais ou au sang cuit, et la
gélose chocolat.

Exemple Les géloses au sang frais et chocolat

L'addition de sang au milieu de base peut avoir plusieurs buts :

- apporter des facteurs de croissance nécessaire au micro-organisme étudié

- neutraliser certains inhibiteurs contenus dans les petones des milieux

- neutraliser, du fait de l'action peroxydasique et catalasique de l'hémoglobine, des ions superoxydes

ou des peroxydes toxiques produits par le micro-organisme (intéressant en particulier pour les
bactéries catalase, comme les Streptococcaceae)

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 Par ailleurs, il permet la lecture d'un caractère important lors de la détermination du germe : l'hémolyse.

Le sang peut être d'origines diverses : cheval, mouton, lapin, homme, bœuf (attention certains germes
présentent un type d'hémolyse sur un sang et un autre type d'hémolyse avec un autre sang). Il est à
ajouter à raison de 5 à 10% au milieu de base (Columbia, Tryptycase soja, Mueller Hinton, cœur
cervelle). Celui-ci ne doit pas contenir de glucose, car il inhibe les hémolysines.

e. Les milieux sélectifs

Les milieux sélectifs sont des milieux empêchant la culture de certains micro-organismes. Ils sont
utilisés pour l'isolement bactérien dans des produits polymicrobiens. La sélection peut être chimique ou
antibiotique. Ce sont des milieux riches ou non et donnant souvent un ou plusieurs caractères
biochimiques d'orientations permettant une identification plus simple des germes.

f. Les milieux d'enrichissement

La présence de certaines bactéries à pouvoir pathogène spécifique dans un prélèvement, a une

signification pathologique indiscutable, même si elles sont peu représentées. C'est le cas par exemple
des Salmonella, des biotypes entéropathogènes, de Yersinia enterocolitica, des vibrions cholériques
ou encore des Listeria ou des Enterocoques. Quelques fois, leur proportion peut être minime par
rapport à celle de la flore commensale et leur présence ne peut être révélée par un isolement (sélectif).
L'absence de colonies suspectes sur l'isolement sélectif ne suffit pas pour affirmer l'absence de ces
bactéries dans le prélèvement. C'est pourquoi un enrichissement est mis en route en même temps que
l'isolement (sélectif).

Remarque
Enrichir, c'est augmenter la représentation (proportion) d'un sous-groupe de micro-organismes dans
un ensemble plus vaste.

2.1
.

Un milieu d'enrichissement réunit deux caractéristiques :

- il contient des molécules à action sélective inhibant totalement ou partiellement la culture des micro-
organismes non recherchés ou utilise une température d'incubation particulière, ou encore une
atmosphère particulière ;

- il est liquide (bouillon) afin que son action sélective s'exerce sur une population importante et
homogène.

Une source de fer: on emploie le citrate de fer (le citrate a pour rôle de maintenir le fer en solution)

Une source d'oligo-éléments: sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti

Une source d'eau, indispensable à toute forme de vie: on utilise l'eau distillée (stérile)

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 Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: KH2PO4 par exemple

En l'absence de l'un de ces composants, les bactéries ne se développent pas, car elles ne peuvent
synthétiser ces produits.

C'est l'adjonction de facteur(s) de croissance approprié(s) qui permet à des bactéries exigeantes de se
développer.

2.2. L'enrichissement :

est une étape qui se réalise quand on veut favoriser la croissance du germe recherché. Cette étape se
réalise en milieu liquide avec qui possède des agents sélectif du germe recherché et des inhibiteurs
des autres.

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 II. Techniques d'isolement et d'identification

II. Techniques
d'isolement et II
d'identification

1. Principe 9
2. Isolement sur boîte de Pétri 9
3. Isolement sur gélose inclinée 10

1. 1. Principe
Isoler consiste à séparer les divers microorganismes d'un mélange.

L'isolement permet :

D'isoler une ou plusieurs souches contenues dans un mélange : il y aura autant de colonies
différentes que de souches différentes.

De vérifier la pureté d'une souche étudiée : une souche pure ne donnera qu'un type de colonie.

L'isolement peut être réalisé par épuisement, en étalant le produit initial à la surface d'un milieu solide
approprié. Pendant l'incubation, chaque micro-organisme déposé se multiplie pour donner un clone de
cellules identiques. Lorsque les micro-organismes sont suffisamment éloignés, le clone se développe
abondamment pour produire une colonie. Une colonie correspond à un amas de cellules identiques à la
cellule mère. Pour réussir un isolement, il faut donc parvenir à disperser suffisamment les cellules
microbiennes (dimension de l'ordre du μm) pour que, après croissance, les colonies (dimension de
l'ordre du mm) qui en sont issues ne se touchent pas.

2. 2. Isolement sur boîte de Pétri

Écrire son numéro de poste, la date et l'identifiant du mélange ou de la souche sur le couvercle
de la boîte.

Sur le fond de la boîte, dessiner le patron suivant :

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 3. Isolement sur gélose inclinée

Prélever la suspension bactérienne à l'aide d'une anse ou d'une pipette Pasteur boutonnée
stérilisée en effleurant une colonie isolée ou en trempant dans la suspension.

Ouvrir la boîte et déposer la pointe de l'anse ou de la pipette au point initial (partie 1).

Faire des stries serrées sans rayer la gélose sur la partie 1.(Eventuellement, stériliser l'anse si la
suspension est trop dense)

Tourner la boîte d'un quart de tour et faire des stries serrées sur la partie 2.

Tourner la boîte d'un quart de tour et faire des stries larges sur la partie 3.

Stériliser l'anse ou jeter la pipette. Refermer la boîte et la déposer dans l'étuve, couvercle vers le
bas.

Fig. 01 : Technique d'isolement sur les boites de Petri.

3. 3. Isolement sur gélose inclinée

Noter son numéro de poste, la date et l'identifiant du mélange ou de la souche sur chacun des
trois tubes. Les noter 1, 2 et 3.

A l'aide d'une anse stérilisée ou d'une pipette Pasteur boutonnée stérilisée, faire un prélèvement
en effleurant une colonie isolée ou en trempant l'extrémité dans la suspension bactérienne.

Ouvrir le tube 1, stériliser le col et introduire l'anse ou la pipette chargée jusqu'à la base de la
gélose pour déposer cette culture au fond. Remonter en faisant glisser la pointe de l'instrument
à la surface de la gélose. Veiller à ne pas rayer la gélose. Faire des stries serrées.

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 3. Isolement sur gélose inclinée

Sortir l'instrument du tube 1. Stériliser le col du tube et refermer.

Ouvrir le tube 2 et réaliser l'isolement sans stériliser ni recharger l'instrument.

Procéder de même avec le tube 3.

Stériliser l'anse ou jeter la pipette Pasteur. Mettre les tubes à l'étuve.

Fig. 02 : Technique d'isolement sur la gélose inclinée

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 III. Identification biochimique

III. Identification
biochimique III

1. Caractères enzymatique 12
2. Caractères biochimiques 13

1. 1. Caractères enzymatique
a. Test de catalase (pour les staphylocoques)

C'est une enzyme décomposant l'eau oxygénée en eau et en oxygène gazeux. La méthode consiste à
prélever une colonie du germe à étudier sur l'extrémité d'une pipette Pasteur fermée que l'on plonge
ensuite dans un millilitre d'eau oxygénée. Le dégagement de bulles gazeuses signe la présence de
l'enzyme (Figure 3).

Fig. 3: Test de catalase (+)

b. Test de coagulase (pour les staphylocoques)

Le test mettant en évidence l'aptitude des bactéries à coaguler le plasma est le principal test
caractérisant S. aureus.

Le test de détection consiste à incuber pendant 4 heures à 37°C un mélange de plasma oxalaté de
l'homme et de la souche à tester, de préférence à partir d'une culture en gélose Chapman

L'apparition d'un caillot est observée en inclinant le tube à 90°C. Le test de la coagulase, il existe de
très rares souches de S. aureus non sécrétrices de coagulase. (Figure 4).

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 2. Caractères biochimiques

Fig. 04 : Test de coagulase.

c. Test d'oxydase

La recherche de l'oxydase s'effectue avec des disques prêts à l'emploi du commerce. Déposer le
disque sur une lame porte-objet, l'humidifier avec deux gouttes d'eau distillée stérile et écraser la
colonie testée sur le disque. Une réaction positive se traduit par un virage rapide du réactif de l'incolore
au violet (Figure 5)

Fig. 05: Test d'oxydase (+).

2. 2. Caractères biochimiques
La galerie API 20 E

La galerie API 20 E est un système pour l'identification des Entérobactéries et autre bacilles Gram
négatif, utilisant 20 tests biochimiques standardisés et miniaturisés, ainsi qu'une base de données
(Figure 6).

a. Principe

La galerie API 20 E comporte 20 micro-tubes contenant des substrats sous forme déshydratée. Les
tests sont inoculés avec une suspension bactérienne. Les réactions produites pendant la période
d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.

b. Mode opératoire

L'opération s'effectuée selon les étapes suivantes :

• Réunir fond et couvercle d'une boite d'incubation et répartir environ 5 ml d'eau distillée dans les
alvéoles pour créer une atmosphère humide.

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 2. Caractères biochimiques

• Remplir tubes et cupules des tests : |CIT |, |VP |, |GEL|, avec la suspension bactérienne.

• Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.

• Créer une anaérobiose dans les tests : ADH, LDC, ODC, URE, H2S en remplissant leurs cupules
avec l'huile de paraffine.

• Refermer la boite d'incubation, coder et placer à 37 °C pendant 18-24 heures.

c. Lecture

Noter sur la fiche de résultat toutes réactions spontanées. Si le glucose est positif et/ou si 3 tests ou
plus sont positif : révéler les tests nécessitant l'addition de réactifs.

-Test VP : ajouter une goutte de réactif VP1 et VP2. Attendre au minimum 10 minutes. Une couleur
rose franche ou rouge indique une réaction positive.

-Test TDA : ajouter une goutte de réactif TDA. Une couleur marron foncée indique une réaction
positive.

-Test IND : ajouter une goutte de réactif de Kowacks. Un anneau rouge obtenu en 2minutes indique
une réaction positive.

La lecture de ces réactions se fait selon le profil numérique à l'aide du catalogue analytique API 20E.

Fig. 06 : La galerie API 20 E.

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