TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N.

M1 EDP

Module : Microbiologie du sol

M1 Ecophysiologie et Développement des plantes
Enseignent responsable : Dr Ghanem Nadra

Protocol 1 : Matériel utilisé en microbiologie

1. Introduction
La microbiologie ; domaine d’études s’intéressant aux organismes de taille
microscopique, en particulier aux bactéries, aux protozoaires, aux virus ainsi qu’à certains
champignons (levures) et algues unicellulaires de petite taille.

L'étude microbiologique d'un sol, faisant suite à la caractérisation physico-chimique de

celui-ci, devra donc s'intéresser aux points suivants :
 Numération totale des microorganismes ; répartition au sein des grands groupes
taxonomiques (Bactéries, Actinomycètes, Champignons a Algues) et, éventuellement,
détermination des espèces au moyen de tests morphologiques, sérologiques et
nutritionnels.
 Evaluation des groupements fonctionnels au niveau des différents cycles (Azote,
Carbone, Soufre, etc..).
Avant le développement des techniques moléculaires, l’identification et la classification
taxonomique de bactéries nécessitaient leur isolement, leur mise en culture et leur
caractérisation sur la base de critères morphologiques, physiologiques, métaboliques,
biochimiques et écologiques.
Un laboratoire de microbiologie nécessite différent matériels pour dénombrer, classer et
identifier les microorganismes.

2. l’objectif et le but
L’objectif de ce TP est de familiariser l’étudiant avec un laboratoire de microbiologie, son
équipement et son fonctionnement.
3. Pratiques de sécurité standard en microbiologie

Le personnel de laboratoire travaillant en contact avec des agents infectieux peut contracter
des infections par le biais d’accidents ou d’incidents ignorés.

Les infections contractées dans le laboratoire interviennent lorsque, par inadvertance, des
germes sont avalés, inhalés ou introduits dans les tissus.

1
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

Ces pratiques nécessitent que :

• Le personnel de laboratoire dispose d’une formation spécifique sur la manipulation des
agents pathogènes et travaille sous la direction de chercheurs compétents ;
• L’accès au laboratoire est limité lors de la réalisation des manipulations ;
• Des précautions extrêmes sont prises en ce qui concerne les objets pointus contaminés;
• Certaines manipulations produisant des aérosols infectieux ou des risques d’éclaboussures
sont effectuées en utilisant des vêtements et un équipement de protection.
Les directives de sécurité données ci-dessous s’appliquent à tous les laboratoires de
microbiologie quel que soit le niveau de bio-sécurité.
3.1. Limiter l’accès au laboratoire
Mettre des pancartes ou signaux de type «biohasard» sur toutes les portes de laboratoire et sur
tout l’équipement (incubateurs, hottes, réfrigérateurs, congélateurs) utilisé pour le travail de
laboratoire.
3.2. Lavage des mains
Équiper chaque laboratoire d’un évier pour se laver les mains. Se laver souvent les mains est
l’une des procédures les plus efficaces pour éviter de contracter des infections dans le
laboratoire. Les mains doivent être lavées avec un savon bactéricide avant de sortir du
laboratoire ou après avoir touché du matériel infectieux.
3.3. Repas
Il est interdit de manger, de boire ou de fumer dans les zones de travail. La nourriture doit être
gardée à l’extérieur de la zone de travail dans des espaces prévus uniquement à cet effet. Ne
pas laisser d’objets personnels tels que les sacs à main ou les lunettes sur les paillasses.
3.4. Prélèvement par la bouche avec la pipette
Tout pipetage par la bouche est strictement interdit. Utiliser une poire ou une propipette.
3.5. Objets pointus
Faire extrêmement attention avec des objets pointus contaminés, notamment les aiguilles et
les seringues, les lames, les pipettes, les tubes capillaires et les bistouris.
3.6. Aérosols
Exécuter attentivement toutes les procédures pour éviter la création d’éclaboussures ou
d’aérosols. Éviter les techniques qui ont tendance à produire des aérosols.

2
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

4. Le matériel utilisé en microbiologie

4.1. Matériels de stérilisation
La Stérilisation est effectuée par différentes méthodes :
- par produits chimiques : tel que la javel, alcool, solution saline……
- par filtration : filtration consiste à faire un liquide à travers une membrane filtrante qui
retient les éléments solides et les bactéries en suspension dans ce liquide.
- par chaleur :
 le four l’acteur principal utilisé pour la stérilisation de la verrerie.
 le bec bunsen assure la stérilisation de l’air du laboratoire, fils des anses de
platine et le tube essai lors des manipulations (voir figure 2).
 L’autoclave est le moyen de stérilisation à température et pression très élevées
des milieux liquides tel que l’eau distillée, milieux de cultures liquides, semi-
liquide, bouillon etc.…(voir figure 1).

Un stérilisateur d'antenne chirurgicale Rodwell Sapphire Autoclave, Un exemplaire d'autoclave

avancée de la Première Guerre mondiale moderne avec cuve carrée et porte automatique
coulissante

Un autoclave simple
Figure 1. Types d’autoclaves pour stérilisation
3
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

Figure 2. Zone de stérilisation d’un bec benzène

4.2. Matériels de culture
- Milieux de cultures : un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules,
de bactéries, de levures, de moisissures afin de permettre leur étude. En principe, les cellules
trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur multiplication en grand
nombre, rapidement, mais aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un genre
bactérien ou une famille. Ainsi, selon le but de la culture, il est possible de placer les micro-
organismes dans des conditions optimales, ou tout à fait défavorables.
Il se compose d'une base (agar-agar, eau, minéraux, etc.) ainsi que d'un indicateur coloré
de pH ou de réaction d'oxydoréduction pour permettre de formuler des hypothèses sur le
genre (figure 3).
Il existe aussi des bouillons de culture qui possèdent la même fonction, mais ces milieux
ne contiennent pas d'agar-agar, ils sont donc totalement liquides (figure 4).
- Boites de Pétri : ce sont des récipients ronds en verre et qui servent pour la culture des
microorganismes. On utilise aussi des boites de pétri stérilisées jetables (voir figure 5).
- Tubes à essais : sont utilisés pour la préparation des milieux de cultures et des dilutions
comme ils peuvent contenir des réactifs. Ils doivent être accompagnés des portoirs (figure 6).

4
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

Figure 3. Quelques types de milieux solides

Figure 4. Quelques types de milieux de cultures

Figure 5. Boîtes de Pétri en verre et en plastique contenant un milieu à base d'agar pour
la culture de bactéries

5
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

Figure 6: Set de tubes à essai sur portoir

- Balance de précision : un laboratoire de microbiologie doit contenir une balance précise de
2 à 4 chiffres après virgule. Elle est utile lors des préparations des milieux de cultures sélectifs
(figure 7).

Figure 7. Types balances de précision

-Anse de platine : ou aiguille d’inoculation c’est un outil utilisé pour ensemencement des
milieux. Elle est composée d’un fil de platine terminé par une boucle fermée et monté sur un
manche métallique destiné à prélever une culture de micro-organismes en vue d’un repiquage
ou d’un frottis (figure 8).

Figure 8 : Anse de platine ou aiguille d’inoculation

6
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

- Un réfrigérateur : est utile pour conservation et refroidissement des préparations pour les
milieux de culture.
- Le congélateur : utile pour des conservations prolongées.
- Le bain-marie : c’est un bac métallique équipé d’une résistance plongée dans l’eau distillée.
Il sert à réchauffer et liquéfier les milieux de culture solide (figure 9).

Figure 9 : Bain marie de laboratoire

- Distillateur ou Déminéralisateur : c’est un appareil pour la distillation ou la
déminéralisation de l’eau utilisée pour les dilutions et la préparation des milieux de cultures
(figure 10).

Figure 10 : Evolution des types de distillateur d’eau de laboratoire

7
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

- Les pipettes graduées et micropipettes : elles ont des formes et des volumes différents
(figure 11). Après chaque utilisation elles sont lavées séchées, enveloppées dans du papier
Kraft, puis stérilisation au four à 180°C pendant 30mn.

Figure 11. Différents types de pipettes

- Pipettes Pasteur : sont des tubes fins généralement en verre dont l'extrémité a été effilée
pour obtenir une pointe ouverte d'un diamètre ad hoc ou adapté. Elle se caractérise par la
facilité de stérilisation à flamme, et est d’une capacité d’1ml (figure 12).

Figure 12. Pipettes Pasteur avec un embout permettant de prélever un liquide

- Verreries : bêcher, erlenmeyer, éprouvettes, fiole jaugées, ballons, entonnoirs (figure 13).

8
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

Figures 13. Différents types de verrerie de laboratoire

4.3. Matériel d’incubation
- L’étuve est une enceinte utile dans un laboratoire de microbiologie. Elle est munie d’un
thermostat pour le réglage d’ température (figure 14). Elle est utilisée pour toute incubation.
- un réfrigérateur pour incubation doit être utilisé seulement pour incubation des milieux
ensemencés.

Figure 14 : Etuve ou Incubateur

9
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

4.4. Réactifs et colorants

Des fois il est indispensable d’utiliser des réactifs chimiques et des colorants à fin de
visualiser certaines composantes des cellules bactériennes ou fongiques sous microscopie.
Des réactifs pour la microscopie : Les réactifs provoquent des changements de couleur mais
observables uniquement sur des éléments microscopiques tels que des spores, des hyphes, des
cystides, des asques, etc.. Pour se faire, il faut déposer une goutte du liquide choisi sur une
lame porte objet. On y transfère ensuite le fragment de champignon à observer, puis on
recouvre le tout d’une lamelle couvre objet sur laquelle une toute petite goutte du milieu de
montage aura été auparavant déposée afin d’éviter l’emprisonnement de bulles d’air. Enfin on
tapote doucement la surface de la lamelle à l’aide de l’extrémité molle d’une gomme par
exemple et l’on place la préparation sous le microscope.
Exemple : réactif de Melzer, lugol, potasse, acide lactique, acide sulfurique, acide nitrique,
benzaldéhyde, vanilline, etc.
Des colorants et milieux d’observations : Les colorants sont utilisés pour mieux visualiser les
éléments microscopiques des champignons sous le microscope. Ainsi par exemple, outre son
fort pouvoir de coloration des parois cellulaires, le rouge Congo ammoniacal qui est un des
colorants les plus utilisés pour les observations courantes a aussi des propriétés regonflantes et
ramollissantes. Tout comme les réactifs microscopiques, les colorants sont des milieux
d’observations dont le choix dépend essentiellement de trois facteurs : le groupe auquel
appartient le champignon à observer, le type de cellules à mettre en évidence et la destination
de la préparation.
Exemple : rouge-congo ammoniacale, rouge neutre, rouge ponçeau, phloxine, éosine, bleu
coton, bleu de Crésyl, noir de chlorazol, trypan bleu, violet cristal, jaune thiazol, lactophénol,
carmin d’indigo, Fuschine de Ziehl, glycérine, eau bidistillée, alcool polyvinylique, etc.
Ces produits sont conditionnés dans des flacons compte-gouttes ronds en verre brun,
de 10 ml ou 5ml.

4.5. Matériel d’identification

4.5.1. Le microscope : est un appareil utilisé dans l’observation des différents micro-
organismes (voir figure 15).

10
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

Précaution à prendre lors de l’emploi du microscope

-s'assurer de la propreté des parties optiques (oculaires, objectifs, lentille frontale du

condenseur...). Si nécessaire les essuyer avec du papier Joseph.
- abaisser la platine pour y déposer la lame (après avoir nettoyé à l'alcool, la partie inférieure
de la lame)
- choisir une intensité lumineuse moyenne
- utiliser les objectifs en ordre croissant de grossissement x 4, x 10,x 60, x 100
- régler l'éclairage à l'aide des diaphragmes et du condenseur
- remonter la platine en regardant latéralement afin d'amener la lame à quelques mm de
l'objectif choisi.
- descendre doucement la platine à l'aide de la vis micrométrique jusqu'à la vue de l'objet à
observer
- pour utiliser des objectifs plus forts que celui choisi précédemment, centrer la zone à
observer, changer d'objectif, régler l'éclairage.

Figure 15. Microscope

4.4.3. Les lames et les lamelles : elles sont utilisées pour les observations microscopiques.
Les lamelles sont jetées après utilisation par contre les lames sont récupérées (figure 16).

Figure 16. Lames et lamelles pour microscopes

11
 TP1 Microbiologie du sol Dr Ghanem N. M1 EDP

4.5. Matériel de dénombrement et comptage

C’est un appareil pour comptage d’un nombre élevé de colonies cultivés dans une boite de
pétri.

Figure 17. Un compteur de colonies

5. conclusion
Le laboratoire de microbiologie du sol est un laboratoire équipé principalement par un
appareillage, produits et verrerie permettant l’accès à une multitude de résultats concernant le
monde microscopique vivant dans les différents environnement (Biosphère, hydrosphère,
pédosphère et atmosphère).

12