Licence pro QSR2A

TOXICOLOGIE
Mthodes de dtection des contaminants
chimiques dans les aliments
Introduction
1. Les mycotoxines
2. Les substances antimicrobiennes
3. Les pesticides
4. Les composs N-nitross
5. Les mtaux lourds
 Mthodes de dtection des
contaminants chimiques dans les
aliments
Introduction
Linscurit alimentaire : risques microbiologique /
chimique
Nature et origine des contaminants chimiques :
- Synthtiss par lorganisme vivant consomm

- Synthtiss par des micro-organismes contaminants

- Apports volontairement :

- Contaminants environnementaux

 Mthodes de dtection des
contaminants chimiques dans les
aliments
Introduction : paramtres des tudes
toxicologiques
 Mthodes de dtection des
contaminants chimiques dans les
aliments
Introduction : tablissement des normes
La Commission du Codex Alimentarius, cre en 1963 par la
FAO et l'OMS, met au point des normes alimentaires, des
lignes directrices et des codes dusages internationaux et
harmoniss visant protger la sant des consommateurs et
assurer des pratiques loyales dans le commerce des
aliments. Elle encourage aussi la coordination de tous les
travaux relatifs aux normes alimentaires entrepris par des
organisations gouvernementales et non gouvernementales.
http://www.codexalimentarius.org/
 Mthodes de dtection des
contaminants chimiques dans les
aliments
Introduction : les LMR
Les limites maximales de rsidus (LMR) sont les niveaux suprieurs de concentration
de rsidus de pesticides autoriss lgalement dans ou sur les denres alimentaires
et les aliments pour animaux. Elles sont fondes sur les bonnes pratiques agricoles
et visent garantir le niveau dexposition le plus faible possible pour les
consommateurs.
Le rglement (CE) n 396/2005 tablit les LMR des pesticides autoriss dans les
produits dorigine vgtale ou animale destins lalimentation humaine ou
animale. Les limites maximales de rsidus, qui reprsentent des seuils toxicologiques
critiques, sont tablis la suite dune valuation complte.
Lunit PRAPeR de lEFSA est charge dvaluer les risques associs aux LMR,
conformment la lgislation. En 2007, lunit PRAPeR a aid la Commission
europenne tablir des LMR europennes temporaires, marquant un premier pas
vers lharmonisation des LMR nationales.
Les tats membres sont tenus deffectuer des contrles officiels sur les rsidus de
pesticides afin de respecter la rglementation relative aux limites maximales de
rsidus.

http://www.efsa.europa.eu/fr
 Mthodes de dtection des
contaminants chimiques dans les
aliments
Introduction : exemples de mthodes
danalyse
 1. Les mycotoxines
1.1. Gnralits
Les mycotoxines sont des mtabolites secondaires scrts par des
moisissures appartenant principalement aux genres
Elles sont produites sur une large varit de denres alimentaires avant,
pendant et aprs rcolte.
 1. Les mycotoxines
1.1. Gnralits

Le risque mycotoxicologique a exist ds la mise en place de productions agricoles

organises. Lergotisme est cit dans lAncien Testament de la Bible.
Certains tombeaux gyptiens ont galement t suspects de contenir de
lochratoxine A, responsable de la mort mystrieuse darchologues.
Cest seulement en 1960 que les premires mycotoxicoses ont pu tre mises en
vidence en Grande-Bretagne o plus de 100 000 dindes sont mortes de ncroses
importantes du foie provoques par une famille de molcules appeles aflatoxines.
Depuis, de nombreuses mycotoxines ont t dcouvertes, le dernier grand groupe
tant, en 1988, les fumonisines.
En France, les pturages peuvent tre coloniss par les champignons du genre
Claviceps responsable de lergotisme, du genre Pythomyces produisant de la
sporidesmine l'origine de leczma facial, du genre Neotyphodium entranant la
formation de gangrne sche et/ou de troubles nerveux, ou du genre Rhizoctonia
capable de synthtiser de la slaframine l'origine de sialorrhe chez les ruminants.
 1. Les mycotoxines
1.1. Gnralits
Les mycotoxines sont labores par des champignons lors
de quatre processus diffrents :




En raison de la diversit de leurs effets toxiques et de leurs
proprits synergiques, les mycotoxines prsentent un
risque pour le consommateur daliments contamins.
Le mtabolisme des mycotoxines est complexe et comprend
plusieurs voies de bioactivation et de dtoxication rgies
par des mcanismes de biotransformation rsultant de
laction denzymes de lhte et de la flore microbienne
prsente dans le tube digestif. Une partie des toxines ou de
leurs mtabolites peut se fixer dans les tissus biologiques ;
la majorit est limine par voie
 1. Les mycotoxines
1.1. Gnralits
Des moisissures peuvent se dvelopper sur les plantes :


et produire des toxines qui pourront avoir des consquences
nfastes sur le consommateur de produits vgtaux
contamins.
A ce risque s'ajoute celui d'une prsence ventuelle de
rsidus toxiques dans les produits animaux destins
la consommation humaine, lait ou viande, lorsque les
animaux reoivent des aliments contamins.
La rduction des risques passe par :

 1. Les mycotoxines
1.2. Biosynthse des mycotoxines
Le mtabolisme secondaire diffre du primaire par la nature
alatoire de son activation et par la diversit des composs
forms et la spcificit des souches impliques. Il n'est pas li
la croissance cellulaire mais rpond gnralement des
signaux issus de l'environnement du champignon.
Mtabolisme primaire :

Mtabolisme secondaire :

La contamination fongique des plantes et la synthse de toxines
dpendent de conditions environnementales :




 1. Les mycotoxines
1.2. Biosynthse des mycotoxines
Les fourrages et les crales sont naturellement en contact avec
des spores fongiques avant, pendant et aprs la rcolte, durant le
transport et le stockage. Les rongeurs, oiseaux, insectes
interviennent dans le processus de contamination en provoquant des
lsions physiques dans les tissus vgtaux qui favorisent la
pntration des spores.
La croissance fongique est rgie par de nombreux paramtres physico-
chimiques :





La principale moisissure rencontre au champ appartient au genre
Fusarium. Bien qu'elle soit surtout prsente dans les crales, on peut
la rencontrer galement dans les fourrages sur pied ou rcolts.
Selon les espces et lenvironnement, Fusarium spp peut produire :



 1. Les mycotoxines
1.3. Structure et classification des
mycotoxines
Six groupes de mycotoxines sont produits par Aspergillus,
Penicillium et Fusarium. La structure chimique des
mycotoxines est trs diversifie, ce qui explique leurs effets
biologiques diffrents :
 1. Les mycotoxines
1.4. Bioconversion des mycotoxines
En fonction de lefficacit de labsorption gastro-intestinale et du
mtabolisme hpatique, les mycotoxines et leurs mtabolites sont
prfrentiellement excrts par les voies urinaire (mycotoxines
hautement absorbes et mtabolises comme lAFB1) et fcale
(toxines peu absorbes ou limines par voie biliaire).
Les ruminants sont globalement plus rsistants la plupart des
mycotoxines grce au rle dtoxifiant de la population microbienne
du rumen. Les principales toxines ingres par les ruminants sont
donc modifies dans le tube digestif des ruminants avant d'tre
excrtes par la voie biliaire. Le ruminant est donc naturellement
protg, mais la prsence de rsidus toxiques dans les produits
animaux que sont le lait et la viande, constitue un risque pour le
consommateur.
Lpithlium intestinal, le foie et les reins sont le sige de
biotransformations dun grand nombre de composs. Il s'agit de
ractions de rduction, doxydation, dhydrolyse et de conjugaison.
Ces ractions diminuent la toxicit et augmentent la solubilit dans
leau des mycotoxines, ce qui facilite leur excrtion dans l'urine (et
dans le lait).
 Mtabolisme de
laflatoxine B1
dans le foie
(adapt de Swick
1984 et Neal
1998).
 1. Les mycotoxines
1.5. Effets des mycotoxines
Chez lanimal, leffet cancrogne de cinq mycotoxines, aflatoxines
(AFB1 et AFM1), ochratoxine A (OTA), moniliformine, sterigmatocystine a
t prouv. Chez lHomme, les aflatoxines et lOTA ont t classes
comme cancrognes avres par le Centre International de Recherche
contre le Cancer. La fumonisine B1 (FB1) est actuellement classe dans la
catgorie des cancrognes probables et pourrait entrer prochainement
dans la classe des cancrognes. Des donnes toxicologiques rcentes sur
la patuline classent cette dernire parmi les toxines risque.
 1. Les mycotoxines
1.5. Effets des mycotoxines
Les aliments sont frquemment contamins par plusieurs moisissures
capables de produire chacune plusieurs toxines. Or, des effets de
synergie peuvent exister entre toxines. Ainsi, lacide fusarique accrot
la toxicit des fumonisines (DMello et Mc Donald 1997), et celle du
DAS et du DON (Smith et al 1997). L'association de la ZEN et de lacide
fusarique augmente de 2 5 fois leur passage mutuel dans le lait
chez le rat (Porter et al 1998). Une interaction entre la FB1 et le DON
induit un accroissement de la quantit de protines dans le sang,
alors que celle impliquant la FB1 et la T-2 conduit une augmentation
du taux de calcium (Kubena et al 1997a) ou du taux dhmoglobine et de
lhmatocrite (Kubena et al 1995).
 1. Les mycotoxines
1.5. Effets des mycotoxines
Une contamination aigu par les aflatoxines provoque des signes importants de lsions du foie (Pier
1992). Laflatoxicose entrane une accumulation dacides gras dans le foie, les reins et le coeur, et peut
tre l'origine d'encphalopathies et d'oedmes (Pfhol-Leszkowicz 2000). Les aflatoxines agissent
comme des intercalants ADN en crant des liaisons avec les bases guanines ce qui entrane la mort de
la cellule ou sa transformation en tumeur maligne (Riley 1998).
Des ochratoxicoses ont t dceles chez lHomme et chez le porc. Elles ont rarement t observes
chez les ruminants du fait de la capacit des microorganismes du rumen hydrolyser lOTA. Les
toxicoses aigus se caractrisent selon Chu (1974) par des dommages rnaux, une anorexie
accompagne d'une perte de poids, des vomissements, une temprature rectale leve, lapparition de
conjonctivites, une dshydratation, un affaiblissement gnral et la mort de l'animal deux semaines
aprs ladministration de la toxine (Marquardt et Frohlich 1992). LOTA peut inhiber le mtabolisme du
glucose et de linsuline, ce qui entrane laccumulation de glycogne dans le foie. L'OTA a des proprits
immunotoxiques et carcinognes en diminuant le nombre de cellules 'Natural Killer' responsables de la
destruction des cellules tumorales, ce qui contribue augmenter sa capacit induire des carcinomes
rnaux et hpatiques (Luster et al 1987). Elle a galement un effet inhibiteur sur les lymphocytes B et T.
Les effets de la ZEN sont domins par des troubles de la reproduction et des modifications physiques
des organes gnitaux identiques ceux de loestradiol : oedmes et hypertrophie des organes gnitaux,
diminution du taux de survie de lembryon chez les femelles en gestation, diminution des quantits de
LH et de progestrone produites affectant la morphologie des tissus utrins, diminution de la production
de lait, fminisation des jeunes mles par diminution de la production de testostrone et infertilit.
Les fumonisines provoquent des lsions profondes du foie, du tractus gastro-intestinal, du systme
nerveux et des poumons (Riley 1998).
La patuline est potentiellement carcinogne et mutagne. La patuline altre la permabilit ionique
et/ou la communication intracellulaire, engendrant un stress oxydatif et la mort cellulaire (Riley 1998).
Les trichothcnes provoquent une perte de poids, des vomissements, des dermatoses svres et des
hmorragies pouvant aller jusqu' la mort de l'animal. Tout comme les aflatoxines, ils possdent des
proprits immunosuppressives intervenant la fois sur le systme immunitaire des cellules et sur le
nombre de macrophages, de lymphocytes et d'rythrocytes (Riley 1998).
La T-2 et la DON inhibent la synthse protique et entranent la mort des cellules de diffrents organes.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
Les mycotoxines sont, en gnral, prsentes ltat de traces dans
les aliments (cest--dire en quantit infrieure au ppb, soit infrieure
au g/kg).
Il existe toute une panoplie de mthodes fondes essentiellement sur le
principe de la sparation chromatographique des molcules puis de
leur dtection par spectrophotomtrie ou par fluorimtrie. Les
mthodes physico- chimiques comme la chromatographie sur couche
mince (CCM), la chromatographie gazeuse (CPG) ou la chromatographie
liquide haute performance (CLHP) permettent la quantification des
mycotoxines.
Les techniques immuno-chimiques de type ELISA permettent soit une
dtection de type prsence ou absence (rsultat qualitatif), soit une
dtection semi-quantitative ou quantitative de la mycotoxine. Les
techniques immunochimiques sont souvent qualifies de rapides car de
nombreux chantillons peuvent tre analyss la fois en 3 4 heures.
Combines une tape pralable de purification par
chromatographie dimmunoaffinit, ces techniques ont pu tre
valides au niveau international. Ces principes danalyse sont
actuellement retenues dans la plupart des mthodes officielles et font
lobjet de normes franaises (normes AFNOR), europennes (normes EN)
ou internationales (normes ISO).
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
Les aliments reprsentent une matrice complexe : des
tapes de prparation des chantillons sont
ncessaires :




Souvent longues et manuelles, ces tapes doivent tre
optimises pour chaque type de matrice.
Lanalyse des mycotoxines tant une analyse de traces, on
procde une tape de purification puis de
concentration de lextrait, par exemple par passage sur
cartouches de silice greffe ou non (cas des aflatoxines, de
la patuline), ou sur rsines changeuses dions (cas des
fumonisines).
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
Le dveloppement de limmunopurification sur colonnes
dimmunoaffinit a considrablement amlior la spcificit et les
seuils de dtection et de quantification des mthodes danalyse
des mycotoxines. Le principe de cette technique
dimmunopurification repose sur lutilisation de lanticorps comme
ractif daffinit. Lanticorps antimycotoxine est tout dabord
immobilis sur un support qui a souvent lapparence dun gel
remplissant une microcolonne, conditionn laide dun tampon.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
Colonnes dimmunoaffinit :
http://fr.aeschemunex.com/tests-automates-microbiologie,18/101,colonnes-
immunoaffinite.html

http://www.romerlabs.com/fr/products/mycotoxins/immunoaffinity-columns/
http://www.libios.fr/mycotoxines.html
http://www.jle.com/e-docs/00/03/FE/08/article.phtml
http://www.neogeneurope.fr/FoodSafety/FS_NT_Index.html
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
La CCM : premire technique employe
Inconvnients :
-
-
Avantages :
-
-

-
-
-
-
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
Principe de la chromatographie :

La sparation est fonde sur la

distribution des soluts entre les deux
phases non miscibles
(stationnaire/mobile). Alors que la
phase mobile tend entraner les
espces sparer dans son
mouvement, la phase stationnaire
tend les retarder. Il en rsulte que
les analytes ont, pour la plupart, des
vitesses de dplacement diffrentes
et infrieures celle de la phase
mobile, do la notion de rtention et
la possibilit de sparation.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
Principe de la chromatographie sur couche mince

On dpose sur la phase fixe une petite quantit du mlange sparer et on met
cette phase au contact de la phase mobile. La phase mobile migre de bas en haut,
par capillarit, le long de la phase fixe en entranant les constituants du mlange.
Cest le phnomne dlution, qui permet la sparation des constituants du
mlange analyser. Chaque constituant migre dune certaine hauteur,
caractristique de la substance, que lon appelle rapport frontal ou rtention
frontale (Rf) :

Rf =
Chaque tache correspond un constituant et on lidentifie par comparaison du Rf
avec un tmoin (une mme substance migre la mme hauteur dans des
conditions opratoires identiques).
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments La phase mobile se
Chromatographie sur couche mince
dplace par capillarit
(chromatographie
planaire). Lanalyste
exploite les distances
parcourues par
chaque espce temps
de dveloppement
donn : quand le front
de solvant a parcouru
une distance fixe, on
repre la position de
chaque solut, par
rvlation par un
systme adquat et on
dtermine le rapport
des vitesses de
dplacement que lon
identifie comme tant
identique celui des
distances parcourues ;
on tudie la
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
Exemple de CCM :
Corn samples are ground and extracted.
The extracts are then spotted onto a TLC
plate. One TLC plate can be spotted with
extracts from several corn samples. The
TLC plate is developed, dipped into an
aluminum chloride solution and heated.
The mycotoxins are then visualized by
viewing the plate under long-wave
ultraviolet irradiation (black light).
Mycotoxin standards are also available
making it possible to visually estimate the
quantity of the mycotoxins present. The
corn sample illustrated below contains
aflatoxin at approximately three times the
standard.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
La phase stationnaire peut tre dispose dans une colonne et la phase
mobile percole celle-ci dbit (ou pression) constant : cest la
chromatographie sur colonne. Lanalyste exploite les diffrences de vitesses
de dplacement des diffrentes espces en dterminant le temps mis par
chacune pour parcourir une longueur gale celle de la colonne (les soluts
sont injects en mlange une extrmit de la colonne et dtects
lautre) : on tudie la distribution isoplane des espces (cest--dire
distance parcourue fixe).
Dans la chromatographie en phase liquide (CPL) : la phase mobile est
constitue dun solvant pur ou le plus souvent dun mlange plus ou moins
complexe de solvants de grande puret ; elle est introduite sur la colonne
dbit constant par un systme de pompage.
La technique CLHP est la plus utilise depuis une vingtaine dannes. Cest
la mthode de choix pour lanalyse des mycotoxines. Les mthodes par
CLHP sont quantitatives et grce leur couplage la dtection par
fluorescence, elles peuvent atteindre des limites de dtection aussi basses
que la dizaine de ng/kg.
La LC-MS est de plus en plus utilise pour effectuer des confirmations et des
identifications de mycotoxines par identification des ions-fils et comparaison
des banques de donnes spectrales. Cette technique est trs coteuse par
lachat de lappareil, sa maintenance et la ncessit dun personnel
hautement spcialis.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
CLHP
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
CLHP
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
CLHP : HPLC Analysis of Fusarium Mycotoxins
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
CLHP : Chromatogram of a standard mixture showing the
separation of 10 mycotoxins : aflatoxins B1, B2, G1 and G2,
citrinin, cyclopiazonic acid, mycophenolic acid, ochratoxin
A, penicillic acid, penitrem A
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
CPG
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est rserve
ltude des mycotoxines qui peuvent tre volatilises. Elle convient
plutt la classe des trichothcnes mais elles sont difficiles
calibrer et valider.
La phase mobile est un gaz, dit gaz vecteur, et les soluts sont
introduits sur la colonne directement sil sagit dun chantillon
gazeux ou aprs volatilisation dans la chambre dinjection
chauffe sil sagit dun chantillon liquide (ventuellement
aprs dilution ou dissolution dans un solvant adquat).
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
CPG
GCMS/MS
chromatogram of a
naturally
contaminated wheat
semolina at
55.4gkg1of DON
showed in full scan
mode (A), the mass
spectrum of DON (B)
and the
characteristic
transitions viewed in
MRM mode (C)
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les
aliments
Mthodes immunochimiques
utilisation dun anticorps spcifique dirig contre la mycotoxine
recherche.
fix sur un support inerte (tubes ou puits de plaque de micro-titration en
polystyrne, billes de verre, membrane)
capture des molcules de mycotoxine ventuellement prsentes dans le
milieu ractionnel
raction de type antigne-anticorps
ajout dun systme enzymatique, en gnral coupl un second anticorps
(conjugu)
transformation dun substrat chromogne en produit color
densit de la coloration mesure par photomtrie proportionnelle ou
inversement proportionnelle (suivant la configuration du test) la quantit
de mycotoxines contenues dans lchantillon.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
Mthodes immunochimiques
Les trousses de dosage permettent une dtermination quantitative de la teneur en
mycotoxine par test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). En gnral, elles se
composent dune plaque de microtitration en polystyrne de 96 puits au fond desquels
sont fixs de faon covalente les anticorps. Ces trousses de dosage permettent
ltablissement dune gamme talon. Malgr la ncessit deffectuer une extraction et
une purification de la mycotoxine partir des chantillons, ces tests se ralisent en 3-4
h avec une limite de dosage en gnral infrieure au ppb. Il existe de telles trousses de
dosage pour laflatoxine B1, lochratoxine A, la zaralnone, la toxine T-2, la
doxynivalnol et les fumonisines.
Les techniques immunochimiques de dosage ou de dpistage sont en gnral
commercialises sous forme de kits ou trousses de dosage et sutilisent selon des
protocoles danalyse dexcution simple sur un grand nombre dchantillons la fois.
Cependant, dans le cadre de lanalyse des aliments, il convient de rester prudent devant
lapparente facilit dutilisation de ces techniques car linterprtation des rsultats nen
est pas moins dlicate. Les risques de ractions croises sont inhrents lutilisation
danticorps comme outil de dtection : la reconnaissance dautres molcules de
structure chimique proche, en particulier des mtabolites de la molcule doser,
ventuellement prsents dans le milieu ractionnel, provoque lapparition de faux
positifs qui entranent une surestimation des rsultats. En outre, lextraction des
mycotoxines ncessite des solvants (mthanol, actonitrile, chloroforme...) et des traces
de solvant dans lextrait analys par test ELISA peuvent aussi tre une cause de
production de faux positifs.
 1. Les mycotoxines
1.6. Recherche des mycotoxines dans les aliments
Dcontamination des effluents
Aprs analyse au laboratoire, il est ncessaire de dcontaminer les extraits
dchantillons contamins et les restes de solutions talons avant limination, ainsi que
la verrerie avant rutilisation. Pour cela, diffrentes mthodes de dcontamination ou
de dgradation des mycotoxines (en particulier aflatoxines) dans les rejets de
laboratoires ont t tudies par le Centre international de recherche sur le cancer.
Lune de ces mthodes utilise lhypochlorite de sodium en prsence dactone. Son
champ dapplication comprend les solutions stocks daflatoxines ou les solutions dilues
en solvant organique ou en milieu aqueux, les chantillons biologiques, la verrerie, les
piluliers, les plaques de CCM, les vtements de laboratoire de protection. Il existe
cependant une suspicion de toxicit des produits de dgradation qui a conduit
rechercher dautres procds de dcontamination.
Ainsi, une mthode au permanganate de potassium en conditions alcalines qui convient
tout un ensemble de mycotoxines comme la patuline, lochratoxine, la citrinine, la
strigmatocystine mais aussi pour les aflatoxines B et G ne produit pas de drivs
mutagnes. Ce procd dcontamine plus de 99,9 % les solutions aqueuses ou
organiques ou bien la forme solide des mycotoxines cites. Ce procd a t valid
pour la dcontamination dune solution de patuline par une analyse collaborative.
La dgradation des aflatoxines par le permanganate de potassium en milieu acide a
galement t mise au point mais son utilisation est maintenant dconseille car ce
ractif produit en milieu acide des ions Mn2+ potentiellement mutagniques.
 1. Les mycotoxines
1.7. Rglementation