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PHYTOREMEDIATION DES METAUX Laurence MARQUES Universit Montpellier 2 FLBI455 A- Les caractristiques de la pollution mtallique B- Bases de la physiologie des

mtaux chez les plantes C- La phytoremdiation C1- la phytostabilisation exemple du projet europen Difpolmine dans lAude C2- la phytovolatilisation C3- la phytodgradation C4- la phytoextraction les plantes hyperaccumulatrices de mtaux les limites la recherche D- Deux exemples approfondis de physiologie des mtaux D1- la tolrance laluminium D2- la tolrance au cadmium

LE STRESS METALLIQUE EST UN STRESS ABIOTIQUE

UV

Heavy metals

Laurence Marqus UM2

LA POLLUTION METALLIQUE DES SOLS EST UN PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE

Ingestion directe Contact cutan


Alimentation animale Alimentation vgtale Eau Poisson Ingestion/conta ct cutan Inhalaltion, vapeur, poussire

Laurence Marqus UM2

LES CONTAMINANTS MAJEURS DES SOLS

POLLUTION INORGANIQUE :
1940 1910

 engrais (nitrate, phosphate)  mtaux (Cd, As, Hg, Pb, Ni, Zn) et radiolments POLLUTION ORGANIQUE :     hydrocarbures solvants chlors pesticides composs nitrs

Nriagu, 1996, Science

Laurence Marqus UM2

ORIGINE DE LA CONTAMINATION DIFFUSE DES SOLS ET DE LEAU EN FRANCE


Polluants dans les nappes phratiques Hydrocarbures Pb Zn Cr Metaux Cu As Ni Cd
Rapport de l'Acadmie des sciences n42, Aot 1998

Rpartition (%) 35,4 9 7,5 6,6 6 5,4 4 3 7,5 15,6

Solvants Autres
http://www.senat.fr/rap/l00-261/l00-26182

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LES METAUX ET LA BIOLOGIE

 Cr, Al, As, Cd, Hg, Pb SONT NON-ESSENTIELS


sont prsents en excs

et TOXIQUES

 Fe, Zn, Mg, Mn, Cu sont ESSENTIELS mais peuvent devenir TOXIQUES lorsquils

Relativement faible DISPONIBILITE des mtaux du sol pour les plantes car les
ions (petites molcules charges) ne peuvent pas traverser les membranes biologiques par simple diffusion.
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Exemple du fer
Carence Excs

symptomes de chlorose

Symptomes de bronzing

Lhomostasie des mtaux doit tre finement contrle pour viter les effets dltres.
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LA POLLUTION METALLIQUE EST UNE POLLUTION TERMINALE

NE MARCHE PAS .

DEUX SOLUTIONS POSSIBLES :

DILUTION
ou

CONCENTRATION et CONFINEMENT
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Pollution des sols par les mtaux lourds

Problmes socioconomiques

Pression forte sur les vgtaux Problme de sant publique Rduction de biodiversit Slection de vgtaux tolrants et/ou hyperaccumulateurs

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Ancien bassin de dcantation St Laurent-le-Minier (34)


Zn contamination Zn, Cd and Pb contamination

Thlaspi caerulescens: petite brassicace hyperaccumultrice de Zn et de Cd


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LES IONS METALLIQUES DANS LES PLANTES

Redistribution/ Stockage
transporteurs transmembranaires: INFLUX chlateurs

Translocation
transporteurs transmembranaires: EFFLUX chlateurs

Absorption --> transporteurs transmembranaires: INFLUX

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Transporteurs de mtaux identifis chez les plantes


ATPases ABC Antiport cations/H+

famille CDF

ATPases type-P

famille ZIP
(Clemens S. (2001) Planta, 212:475-486)

famille NRAMP

Influx : entre dans le cytoplasme Efflux : sortie du cytoplasme (vers lapoplasme ou les compartiments intracellulaires)
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Les chlateurs connus pour jouer un rle dans la tolrance aux mtaux: dtoxification et stockage

 Acides organiques: citrate, malate, oxalate (Al, sve brute)  Acides amins: histidine (Ni)  Nicotianamine (Ni)  Phytochelatines (Cd, vacuole)  Metallothionines (Zn, Cu, cytoplasme)

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PHYTOREMEDIATION : FROM GREEN TO CLEAN


La remdiation physique et chimique des sols contamins par les mtaux lourds est un procd lourd et trs chers ( plus de 1.5 M / ha).

 Les plantes utilisent lnergie solaire pour pomper les mtaux

 Les racines explorent de grands volumes de sols

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PHYTOREMEDIATION : un ensemble de technologies vertes et durables


PHYTOVOLATILISATION
Se

SHOOTS
=

PHYTOEXTRACTION

solar-driven pump
Zn

Zn

dust =air pollution

herbivory = food chain entrance


RHIZOSPHERE (roots + microbes) = sensor + extractor

PHYTODEGRADATION PHYTOSTABILISATION

. .. . . . . . . .. . . . . . . . .. . .. .. . Zn .. . Pb Pb . .. uptake
TNT

leaching

ground water pollution


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PHYTOREMEDIATION : un ensemble de technologies vertes et durables

SHOOTS
=

solar-driven pump

dust =air pollution

herbivory = food chain entrance

PHYTOSTABILISATION

. . . . . . . .. . ... . . Pb Pb . ..
TNT

. .. . .. ..

..

RHIZOSPHERE (roots + microbes) = sensor + extractor

leaching

ground water pollution


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PHYTOSTABILISATION

OBJECTIF:
Utilisation des plantes pour viter la dispersion de la pollution

CARACTERISTIQUES:
Efficace pour prvenir le lessivage vers les zones non pollues Efficace contre lrosion olienne Les espces choisies doivent possder un systme racinaire tendu, tre tolrantes aux mtaux mais non accumulatrices pour viter lentre dans la chaine alimentaire

LIMITES:
La pollution est toujours prsente Survie des plantes

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Ralisations

IRD New Caledonia Plantations de peupliers Espces endmiques

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Le site de la Combe du Saut Salsignes (Aude)


Ancienne mine dor, ce site est fortement pollu par larsenic, une pollution endmique fortement aggrave par lexploitation de la mine dor Usine metaleurope en 2002

2006
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Concentration dans les sols en surface

Ruisellement la Combe du Saut

Concentration dans les eaux de ruissellement

Eau potable : 10

g / l

0,01 ppm

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Le projet europen Difpolmine

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Amendement = grenaille de fer

Deux parcelles dessai avec sans grenaille

Lgumineuse et gramine utilises pour le repeuplement

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Vue arienne du site en 2006

Image numrique de la maquette du projet

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PHYTOREMEDIATION : un ensemble de technologies vertes et durables

SHOOTS
=

solar-driven pump

dust =air pollution

herbivory = food chain entrance

PHYTODEGRADATION

. .. . . . . . . . . . . . . .. . . ..
TNT

. .. . .. ..

..

RHIZOSPHERE (roots + microbes) = sensor + extractor

leaching

ground water pollution


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PHYTODEGRADATION

AIM: Transform pollutants into non toxic products CHARACTERISTICS:

Phytodegradation
organic pollution

is the technology of choice to remediate

A cleaning up of the site is achieved Both plant cells and rhizospheric microbes
degradation

participate to the

LIMIT:

METALS CANNOT BE PHYTODEGRADATED

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PHYTOREMEDIATION : un ensemble de technologies vertes et durables


PHYTOVOLATILISATION
Se

SHOOTS
=

solar-driven pump

dust =air pollution


PHYTOVOLATILISATION
Se

herbivory = food chain entrance

. .. . . . . . . . . . . . . .. . . ..

. .. . .. ..

..

RHIZOSPHERE (roots + microbes) = sensor + extractor

leaching

ground water pollution


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PHYTOVOLATILIZATION

AIM: Dilute pollutant in the atmosphere CHARACTERISTICS:

 Plants can naturally volatilize Se : DMSe is volatil  Microbes can naturally volatilize Se and Hg: Hg0 is volatil  Cleaning up of the site is achieved
LIMIT:

Se and Hg are the only metals that can be volatilized

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Construction de marais artificiels

Exemple de la raffinerie de ptrole Chevron Richmond (Californie):: le marais phytovolatilise 89% du Se relargu par la raffinerie.
http://epics.ecn.purdue.edu

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Phytovolatilisation du slnium
MODELE DE PRELEVEMENT ET METABOLISATION DU Se Le Se est mtabolis par les enzymes de la voie dassimilation du sulfate. Il se forme de la SeMet qui peut tre mthyle en DMSe VOLATIL. Les marais sont des biotopes dans lesquels le Se est naturellement fortement volatilis

ROLE DES BACTERIES DANS LACCUMULATION DU Se PAR LES PLANTES


Axenic Plus bacteria
No Se 20 M Se

(Terry N, Plant Physiol., 1999, 119, 565)

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PGM et nouveaux procds de remdiation

merA protine bactrienne Hg(II) toxique Hg0 VOLATILE et moins toxique

Problme de la dissmination des PGMs


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PHYTOREMEDIATION : un ensemble de technologies vertes et durables

SHOOTS
=

PHYTOEXTRACTION

solar-driven pump
Zn

Zn

dust =air pollution

herbivory = food chain entrance


RHIZOSPHERE (roots + microbes) = sensor + extractor

. .. . . . . . . .. . ... .. .. . . .. . Zn .. . . .. uptake
leaching

ground water pollution


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PHYTOEXTRACTION

AIM: Extraction of the pollutant from the soil using the solar-driven force and concentration in aerial harvestable part of the plant CHARACTERISTICS:

It does not transform the pollutant Use in the case of terminal pollution as
metallic pollution

It needs TRANSLOCATION from root to


shoot what is a great limiting factor

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LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX

Niemeyera (Sebertia) acuminata


Le sve bleue

20% de nickel en poids secs dans la sve !

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LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX


Arabidopsis halleri : zone urbaine prs de lancienne usine Metaleurope Auby (59), hyperaccumulateur de Zn et Cd

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LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX


Thlaspi caerulescens: petite brassicace hyperaccumulatrice de Zn, de Ni et de Cd Ancien bassin de dcantation St Laurent-le-Minier (34)

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LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE MTAUX

Accumulation dans les parties ariennes : jusqu plusieurs % / g MS sans effet nfaste Hyperaccumulation: teneur foliaire > teneur racinaire

Augmentation de la translocation

Augmentation de labsorption racinaire

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Exploration du sol par les racines

Thlaspi caerulescens

Whiting et al., New Phytol., 2000

Homogeneous Zn pollution

No pollution

Zn pollution
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Diffrences de prlvements racinaires entre T. arvense et T. caerulescens

Clonage dun transporteur de zinc impliqu dans le prlvement accru de ce mtal chez T. caerulescens
Pence et al., 2000, PNAS, 97, 4956

Complmentation fonctionnelle du transport de zinc dans le mutant de levure zrt1zrt2 (zhy3) par TcZNT1.

Expression transcriptionnelle de ZNT1

Rpartition racine / parties ariennes des mtaux

Thlaspi arvense plante non hyperaccumulatrice SHOOT


5%

Thlaspi caerulescens hyperaccumulateur de Ni SHOOT


89%

ROOT

ROOT

Teneur en Ni de plantes cultives sur 10 M NiSO4


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Localisation subcellulaire du zinc chez T. caerulescens

MEB aprs cryoxation et EDXMA

--> La localisation subcellulaire des mtaux est trs dlicate car les ions mtalliques sont trs mobiles dans les tissus.

Lhyperaccumulation est apparue plusieurs reprises dans diffrentes familles botaniques

Baker and Brooks (1989) Biorecovery 1 81-126

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LIMITE = LA NOTION DE BIOCONCENTRATION


Bioconcentration factor (BCF) = shoot [metal] / soil [metal]

Nombre de rcoltes requises pour diminuer de moiti la concentration en mtal dans 20 cm de sol

Plant biomass (t.ha-1)


Model calculation from McGrath and Zhao,Curr Opin Biotechnol, 2003

HYPERACCUMULATION ET BIOMASSE SONT TOUTES DEUX NECESSAIRES


Laurence Marqus UM2


Zinc absorb (kg/ha) 30,1 10,3 3,9 Nombre de rcoltes 13 37 96

Hyperaccumulateurs Thlaspi caerulescens Arabidopsis halleri Alyssum lesbiacum Non-accumulateurs Brassica napus Raphanus sativus

0,5 0,2

832 2046

Nombre de rcoltes pour passer de 444 300 mg zinc/kg sol (norme NF U 44-041)
(Baker et al., 1995)
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LE VERROU BIOLOGIQUE:
FORTE BIOMASSE FAIBLE TRANSLOCATION

TRES FAIBLE BIOMASSE FORTE TRANSLOCATION

Thlaspi caerulescens

Brassica napus : colza


Nombre de rcoltes requises pour diminuer la teneur du sol de 444 300 mg Zn.kg-1 (norme NF U 44-041)

832

15

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COMMENT OBTENIR DES PLANTES ADAPTEES A LA PHYTOEXTRACTION ?

- EXPLOITATION DE LA BIODIVERSITE

- GENETIQUE

- BIOTECHNOLOGIE: recherche fondamentale et PGM

Laurence Marqus UM2

EXPLOITATION DE LA BIODIVERSITE

Ma et al, Nature, 2001

Laurence Marqus UM2

GENETIQUE QUANTITATIVE

AIM: Identification and selection of metal


tolerance and/or hyperaccumulation traits

A. halleri

A. lyrata

hyperaccumulation are two distinct genetic traits (McNair, 1999 )

RESULTS: tolerance and

0,0

Mt2b

13,1

At5g08160

35,8 37,7

AthCDPK9 H9

50,0 53,6

AthDET1 MTP1-B

62,6 70,2 LD

AGG/CT-80

ZnTol QTL3

QTL analyses; marker assisted selection

81,0

At4-GA2

P. Saumitou-Laprade, Lille
Laurence Marqus UM2

BIOTECHNOLOGIE: utilisation de PGM

La surexpression de la nicotianamine synthase confre une forte tolrance au Ni

Ni content (mg/g DW)

Col

35S-TcNAS Col O ppm 70 ppm 700 ppm

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

Col 35S-TcNAS Col

0 ppm

70 ppm

700 ppm

Pianelli et al., 2005, Transgenic Research.

--> validation de cibles


Laurence Marqus UM2

SOLUTIONS FOR MULTI-METALLIC POLLUTION EXIST

Transgenic Indian mustards overexpressing -ECS display increased metal tolerance and shoot accumulation for Cd, Cr, Cu, Pb and Zn

APS = adenosine triphosphate sulfurylase GS = glutathione synthase -ECS = -glutamylcysteine synthase Plants are grown on aged polluted soil containing mixture of metals

Nature 395, 553 - 554 (1998)

Harvesting a crop of gold in plants


CHRISTOPHERW.N.ANDERSON*, ROBERTR.BROOKS*, ROBERTB.STEWART* & ROBYNSIMCOCK

US PATENTS Chaney, 1998, Method for phytomining of nickel, cobalt and other metals from soil, US Patent 5711784

La toxicit aluminique
LAl est le troisime lment le plus abondant sur terre. En sols acides la forme Al3+ trs phytotoxique domine. Ces sols reprsentent 40% des terres arables (+ acidication suite lutilisation excessive dengrais). Au niveau cellulaire, des concentrations symplastiques de lordre du nmol sont toxiques car Al3+ une constante dafnit pour lATP 107 fois plus importante que Mg2+. La constante de stabilit des complexes Al3+ -acides organiques est encore plus forte que celle de lATP et permet donc de chlater efcacement lAl3+ . Pour la racine en croissance la toxicit est trs forte au niveau de lapex racinaire.

Nature (1997), 390, 569

Detoxifying aluminium with buckwheat


Ma et al.

Rponse spcifique de Al. *Le sarrasin rsiste laluminium en protgeant lapex racinaire par scrtion dacide oxalique: ce mcanisme est commun toutes les plantes rsistantes lAl, seul le type dacide varie. * Le sarrasin accumule de lAl dans ses parties ariennes. La forme complexe avec lacide oxalique est une forme non toxique accumule dans les feuilles.

Les diffrents acides organiques qui dtoxifient lAl

Coloration de lAl dans les apex racinaires

Modle de scrtion dacides organiques par les racines en rponse lAl

Prlvement, transport et stockage de lAl chez le sarrasin: diffrents ligands organiques interviennent

La rsistance laluminium est contrle par lexcrtion dacide organique par lapex racinaire
La surexpression de citrate synthase confre une rsistance aluminique au tabac et la papaye

CSb

contrle

75

Al3+

200

1000

Papaye transgnique et tmoin cultives sur aluminium


(de la Fuente J. M. et al. (1997) Science 276: 1566-1568)

La rsistance au cadmium
-Glutamylcystine synthase

Glutamate + cystine + ATP ---> -glutamylcystine + ADP + Pi


Glutathion synthase

-glutamylcystine + glycine + ATP ---> glutathion + ADP + Pi


Phytochelatin synthase (Grill, 1989): en prsence de Cd, Ag, Bi, Pb, Zn, Cu, Hg, Au:

Plant Physiol. (1992) 100, 100

Cadmium-sensitive Mutants of Arabidopsis thaliana


Howden R and Cobbet S
- 15000 M2 (mutagnse EMS) cribles pour la sensibilit au cadmium dans un test de croissance racinaire. - 120 mutants isols. - 2 mutants conrms. - 1 seul locus cad1

mutation rcessive pas deffet maternel sgrgation 3:1 : locus mendlien unique le croisement entre les deux mutants montre que les deux mutations sont allliques.

Plant Physiol. (1995) 107, 1067

A Cadmium-Sensitive, Glutathione-Decient Mutant of Arabidopsis thaliana


Howden R et al.

-20000 M2 (mutagnse aux rayons X) cribles pour la sensibilit au Cd dans un test de brunissement racinaire - 1 mutant identi cad2

Glutathion -Cd +Cd Wild type cad2-1 cad1-1 231 41 225 154 30 567

Plant Physiol. (1995) 107, 1059

Cadmium-sensitive, cad1 Mutants of Arabidopsis thaliana Are Phytochelatin Decient


Howden R et al.

Total PCs Cd (M) 0 30 Wild type 5 150 cad2-1 1 16 cad1-1 5 37

Le locus CAD2 = la -Glutamylcystine synthase


Caractrisation biochimique des plantes
Strain Cystine
(nmol g-1 DW)

GC
(nmol g-1 DW)

GSH
(mol g-1 DW)

GCS
(nmol min-1 mg-1 protein)

WT cad2 pBI-GSHA pBI101

111 234 122 223

64 21 160 24

3 1,3 5,5 1,3

0,8 0,3 1,8 0,3

Cartographie RFLP du locus CAD2

Plant J, 1998, 16, 73

Le locus CAD1 = la phytochelatin synthase

Cette enzyme avait t caractrise biochimiquement en 1989 mais pendant dix ans personne navait pu cloner le gne correspondant.

En 1999, trois quipes publient simultanment le clonage par des approches toutes diffrentes

1- Equipe de Cobbett

Plant Cell (1999) 11, 1153

 cartographie du locus CAD1 par RFLP  un gne inconnu identifi  le squencage dans les diffrents mutants cad1 donne des mutations ponctuelles  complmentation du mutant cad1-3 par le locus CAD sauvage: a marche!  expression dans E. coli donne une enzyme fonctionnelle capable de synthtiser des PCs.  pas de rgulation transcriptionnelle par le Cd

2-Equipe de Schroeder

EMBO J (1999), 18, 3325

 transformation de S. cerevisiae par une banque de cDNA de racines de bl et criblage pour la rsistance au cadmium  accumulation de Cd2+ dans les levures transformes  purification de la protine correspondante  la protine correspondante une activit catalytique produisant des PC2 partir de milieu contenant du Cd et du GSH

3- Equipe de Ph. Rea

PNAS (1999), 96, 7110

 transformation du mutant de levure yap1 par une banque cDNA dA. thaliana, criblage sur des milieux toxiques en Cd et retransformation dans le mutant ycf1 pour les plasmides confrant tjrs une rsistance au Cd  clonage dun cDNA  purification de la protine correspondante  dmonstration de lactivit catalytique de lenzyme: production de PC partir de GSH en prsence de Cd

Mcanismes de dtoxication du cadmium par les phytochlatines