La microbiologie

du
milieu hydrique
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DCE/M
Sommaire
Quelques notions fondamentales importante de la microbiologie

Importance de l’étude approfondie des bactéries

Les microorganismes du milieu hydrique
Le contrôle bactériologique obligatoire et indispensable
Devenir des bactéries du milieu hydrique lors des
étapes de traitement
Méthodes d’étude des bactéries
Le prélèvement en bactériologie – transport et conservation
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DCE/M
Les méthodes en bactériologie de l’eau
Quelques notions
fondamentales
importante de la
microbiologie

Benabdallah.S
DCE/M
Qu’est ce que la microbiologie ?
La microbiologie :
Science ayant pour objet l’étude des microbes

Microbe ou microorganismes :
tous les organismes vivants, de petite dimension,
qui nécessite pour leur observation un microscope

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Qu’est ce que la microbiologie ?

La microbiologie englobe l’ensemble des disciplines

biologiques qui concernent ces micro-organismes,
notamment
la bactériologie, la virologie et la parasitologie.

La microbiologie, qui s’est développée avec la

microscopie,
microscopie étudie non seulement la morphologie des
micro-organismes, mais également leur mode de vie, leur
métabolisme, leur structure moléculaire, leurs éventuelles
propriétés pathogènes et leurs caractéristiques Benabdallah.S
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antigéniques
Naissance et essor de la microbiologie
La naissance de la microbiologie correspond à la
découverte, grâce au microscope, de l’existence
d’une vie minuscule, notamment dans des gouttes
d’eau ou autres surfaces :

c’est le naturaliste hollandais Antonie Van

Leeuwenhoek qui, le premier, en 1683, observe de
tels micro-organismes (bactéries et protozoaires),
qu’il baptise « animalcules ».
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Naissance et essor de la microbiologie
Le développement de la microbiologie est tout
particulièrement stimulé par les implications médicales de
la microbiologie. (touche la santé humaine)

Ainsi, les travaux des chercheurs permettent de mettre en

évidence un certain nombre de micro-organismes
pathogènes, des bactéries, des unicellulaires parasites, etc.

De plus, Pasteur, fait admettre un principe capital pour

l’avancement des recherches : les micro-organismes,
comme tous les autres êtres vivants, n’apparaissent pas Benabdallah.S
spontanément, mais à partir de « germes » existants DCE/M
Les microorganismes du milieu hydrique
Les eaux des ressources naturelles superficielles ou
souterraines à l’état naturel (sans traitement) contiennent
toutes sortes de microorganismes :

algues microscopiques
protozoaires (parasites)
champignons
bactéries
virus
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Nécessité de les classifier DCE/M
Classification simplifiée
Animaux

Algues
Eucaryotes
Structure complexe Protozoaires
et différenciée
Champignons

Algues bleu vert

Procaryotes Bactéries

Structure simple et
rudimentaire Eubactéries Benabdallah.S
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Principales caractéristiques des eucaryotes et procaryotes

 Procaryotes  Eucaryotes

 Bactéries  Algues –protozoaires – mycètes

 Taille de la cellule  Généralement 1 ou 2 µm de  Généralement 10 ou 100 µm de

long long

 Métabolisme  Anaérobies ou aérobies  Aérobies

 Organites  Peu ou pas  Noyau- mitochondries –

chloroplastes

 ADN  ADN cytoplasmique circulaire  ADN très long contenant de

nombreuses régions non codantes

 ARN et proteines  ARN et proteines synthétisées  ARN synthétisé et assemblé dans

dans le même compartiment le cytoplasme

 Cytoplasme  Pas de cytosquelette  Cytosquelette composé de

filaments proteiques

 Division cellulaire  Par de scissiparité  Par mitose

 Organisation  unicellulaire  Unicellulaire, et pluricellulaire

cellulaire
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Dimensions des microorganismes
virus
(10mµ)

bactéries
(1µ)

cellules
sanguines
(10µ)

protozoaires
(1mm)

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Les algues microscopiques ou phytoplancton

Non obligatoire à rechercher (normes)

Mais elles sont recherchées en générale pour :

•Déterminer le degré trophique ou de pollution des

pediastrum duplex
eaux superficielles susceptibles d'être utilisées pour
l'alimentation humaine 

•Contrôler l’efficacité des stations de traitement à

éliminer le plancton 

•Rechercher les causes éventuelles de goût et d'odeur

oocystis lacustris dans l'eau      

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 Les œufs de parasites
Non obligatoire à rechercher dans
l’eau potable (normes)
Mais elles sont de plus en plus recherchées en
générale pour

Strongles •Déterminer une présence suspecte

surtout des espèces parasites
pathogènes comme giardia et
cryptosporidium

• Détecter un problème de
Larves
fonctionnement de la station de Benabdallah.S
traitement notamment les filtres DCE/M
Les œufs de parasites (obligatoire- eau usée)

Le laboratoire de microbiologie procède

régulièrement à la recherche et dénombrement des
œufs d’helminthes dans les eaux usées pour :

vérifier la conformité de ses eaux par rapport aux recommandations

de l’OMS visant la protection des agriculteurs et des consommateurs

Le renforcement du contrôle de la qualité des eaux traitées.

Le contrôle de l’efficacité des stations d’épuration

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Les champignons microscopiques

Non obligatoire à rechercher

dans l’eau potable (normes)

Actuellement des études sont

en cours pour déterminer
leur action sur les goûts et
odeurs dans l’eau

Leur éventuelle toxicité

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Les virus

Non obligatoire à rechercher

dans l’eau potable (normes)

Actuellement beaucoup
d’études visent à rechercher
les entérovirus et les
bactériophages

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Les bactéries

Plan réglementaire : obligatoire à rechercher

dans l’eau potable (normes marocaines )

L’absence de bactéries
(germes tests témoin de contamination fécale)
indique la potabilité d’une eau

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Importance de l’étude
approfondie des
bactéries

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 Qu’est que les bactéries ?

Protistes inférieurs ou procaryotes invisibles à l ’oeil nu

peuvent être détruites par stérilisation
peuvent être responsables de certaines maladies...

les bactéries sont les plus petits organismes connus, doués de

métabolisme, capables de croître et de se diviser au dépend de
substances nutritives minérales ou organiques

l ’ordre de grandeur est le micron mais certaines bactéries

peuvent atteindre 50 µm. elles sont dans ce cas proches des
algues Benabdallah.S
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types de bactéries
Il est possible de classer les micro-organismes selon
leur capacité à provoquer ou non des maladies
infectieuses.

Certains microbes sont inoffensifs ou même utiles :

c’est le cas de ceux utilisés pour la fabrication de
produits alimentaires (fromage, vin, etc.)

D’autres sont pathogènes car ils peuvent provoquer des

maladies infectieuses s’ils sont transmis à l’homme
(bactérie diphtérique, virus de la rage, etc.) Benabdallah.S
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Place des bactéries dans le monde vivant
Exigence nutritionnelle simple

Pouvoir de multiplication considérable

Les bactéries

Représente une grande partie

de la biomasse terrestre

Plusieurs critères les différencient les unes des autres

Nécessité de classifier les bactéries Benabdallah.S

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Classification des bactéries
Dans la classification standard du monde vivant les
bactéries constituent celui des procaryotes, qui se
distinguent des eucaryotes par le fait que leur matériel
génétique (ADN) n'est pas isolé du reste du contenu
cellulaire par une membrane.

On connaît environ 1 600 espèces de bactéries, parmi

lesquelles on distingue deux grands groupes :
les archéobactéries et les eubactéries.
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Origine de la classification des bactéries
Les bactéries, sont généralement classées à partir de différents critères
morphologiques ou physicochimiques :

•la structure de la paroi cellulaire, qui permet de distinguer les bactéries à

parois fines, de type Gram négatif (Gram -), celles à paroi épaisse de type
Gram positif (Gram +), les formes dépourvues de parois et enfin, celles qui
présentent des parois constituées d'un matériau différent du polypeptide
typique de la plupart des bactéries ;

• leurs besoins en oxygène : les bactéries aérobies se développent en présence

d’oxygène, et les anaérobies en l’absence de cet élément ;

• leur aptitude à former des spores, qui permettent à certaines espèces de

résister à des conditions extrêmes ;
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• leur forme : sphérique (cocci ou microcoques), en bâtonnet (bacilles), ou DCE/M
spiralée (spirochètes).
Critères de classification des bactéries
Morphologiques Aspect des cellules ...

structurale Aspect de la paroi ...

Tinctoriaux Coloration de Gram...

Aérobies, anaérobies, hétérotrophes ...

Trophique

Métabolique Action sur les glucides, les lipides….

Sensibilité
À certains agents : oxydants,
antibiotiques ...
Résistance
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Structure des bactéries

capsule (éventuelle)

paroi cellulaire

membrane cytoplasmique

ribosomes

mésosome

appareil nucléaire

granules cytoplasmiques

vacuoles

cytoplasme
corpuscules métachromatiques

flagelle (éventuel)

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Morphologie des bactéries

diplocoque diplobacille

streptocoque streptobacille

diplostreptocoque batonnets
incurvés
ex: Vibrion

en tétrade spirilles

en grappe
ex: staphylocoque

exemples de formes exemples de

formes
sphériques en batonnets
COCCI BACILLE

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multiplication des bactéries

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Les bactéries pathogènes
Le pouvoir pathogène des bactéries varie considérablement
en fonction des espèces et dépend à la fois de la virulence
de la souche bactérienne et de l'état de l'organisme hôte,
c’est-à-dire de l’efficacité de son système immunitaire.

Il existe environ deux cents espèces de bactéries pathogènes

pour l'espèce humaine. Parmi les germes responsables des
maladies les plus graves, on trouve les bactéries du choléra,
de la fièvre typhoïde …

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Les microorganismes
du milieu hydrique

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DCE/M
Les bactéries du milieu hydrique : 3 origines
Origine purement aquatique : parfaitement adaptées aux
conditions de température et aux concentration des différents
nutriments

Origine terrestre avec des facultés d’adaptation ou de résistance

qui leur permettent de survivre et même se développer dans le
milieu aquatique

Origine animale ou humaine : ce sont des germes de contamination

le plus souvent fécales dont la température normale de
développement est de 37 °C environ et qui sont accoutumées à un
milieu nutritif riche en matière organique. On parlera de survie de
ces microorganismes dans l’eau et non de multiplication ou
développement Benabdallah.S
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transmission des microorganismes
La transmission par contact entre un sujet infecté et un sujet sain
Le contact est direct lorsqu’il y a attouchement entre un sujet malade et un sujet
sain
Le contact peut-être indirect, lorsqu’un objet a servi de lien entre le sujet malade
et le sujet sain. (seringue, …)

Les autres voies de transmission

– par aérosol ;
Dans ce cas, les micro-organismes pathogènes sont transmis par des gouttelettes
de mucus émises lorsque le sujet infecté tousse, éternue ou parle. Exemple : la
grippe.

– par l’eau ;
De nombreux germes pathogènes sont transmis par l’eau : choléra, amibes,
poliomyélite, etc. Benabdallah.S
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transmission des microorganismes
– par l’alimentation ;
Le lait et les produits laitiers provenant d’animaux infectés transmettent la
tuberculose bovine, la brucellose.

– par le sol ;
Le sol héberge de nombreux micro-organismes qui peuvent être transmis :
agents du charbon, du tétanos, etc.

– par des vecteurs animaux.

Il peut s’agir d’un simple transfert de microbes d’un animal infecté sur un sujet
sain ou sur un objet : la mouche transporte ainsi, sur ses pattes, des microbes
qu’elle récupère quand elle pond sur des matières fécales.

L’organisme est ainsi constamment confronté à la possibilité de pénétration

(contamination) d’éléments émanant de son environnement. Benabdallah.S
DCE/M
vie survie et mort des bactéries dans l’eau
Dans les eaux naturelles (souterraines ou de surface),
dans les eaux traitées (avant ou sans traitement)

La variété des bactéries rencontrées est infini

Sur le plan santé publique : Pathogènes

Indicateurs de pollution
Bactéries hétérotrophes Benabdallah.S
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vie survie et mort des bactéries dans l’eau

Pathogènes Peuvent survivre + ou – longuement

mais jamais se multiplier

Indicateurs de pollution Ex : E Coli :

survivent + ou – durablement

Bactéries hétérotrophes Appartiennent à plusieurs espèces

et groupes donc impossible
à classifier dans ce sens Benabdallah.S
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 caractéristiques des micro-organismes

Persistance dans l ’eau

dès qu’ils quittent l ’organisme hôte les µorg pathogènes perdent
graduellement de leurs vitalité et de leur pouvoir infectant .
Leur persistance dans l’eau dépend de plusieurs facteurs comme la
température, les UV…

dose infectante
en général dans l ’eau les pathogènes sont très dispersés

valeur guide
les pathogènes ne sont pas en solution mais sous forme de particules séparées
les pathogènes sont agglomérés et s ’attachent aux solides en suspension
la relation des doses à effet des pathogènes n ’est pas cumulative etc... Benabdallah.S
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 infections d ’origine hydrique
les germes pathogènes ont le pouvoir de s ’implanter, de se
multiplier chez l ’homme et de produire des troubles

dans le cas des maladies hydriques les agents contaminateurs

proviennent habituellement du tube digestifs de l ’homme ou de
l ’animal et sont éliminés principalement dans les matières fécales

pour déclencher une infection intestinale aigue, le micro-

organisme doit coloniser le tube digestif et à des doses ingérées
infectieuses
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Maladies / troubles / signes cliniques DCE/M
Les micro-organismes pathogènes de l ’eau
Maladies Agents

Origine bactérienne

Fièvres typhoîdes et paratyphoides Salmonella typhi

Salmonella paratyphi A et B

Dysenterie bacillaire Shigella

Choléra Vibro cholérae
Gastro-entériques aigues et diarrhées E. coli entérotoxinogène
Campylobacter jenujeni / coli
Yersinia enterocolitica
Salmonella sp
Shigella sp

Origine virale

Hépatites A et E Virus hépatite A et E

Poliomyélites Virus poliomyelitique
Gastro-entérites aigues et diarrhées Virus de Norwalk
Rotavirus
Astrovirus
Calicivirus
Coronavirus
Entérovirus
Adénovirus
Réovirus

Origine parasitaire

Dysenterie amibienne Entaomoeba histolytica

Gastro-entérites Giardia lamblia
Cryptosporidium Benabdallah.S
DCE/M
Le contrôle
bactériologique
obligatoire et
indispensable

Benabdallah.S
DCE/M
 nécessité du contrôle bactériologique

parmi tous les critères physiques, chimiques et microbiologiques

qui permettent de juger si une eau est potable , les critères
bactériologiques sont indispensables.

 l ’eau destinée à la consommation humaine ne doit pas contenir

de micro-organismes pathogènes, agents d ’infections humaines
redoutables

la grande majorité de ces µorg nocifs diffusent dans

l ’environnement aquatique par l ’intermédiaire de souillures
fécales humaines ou animales.

Benabdallah.S
DCE/M
 nécessité du contrôle bactériologique

Les µorg pathogènes pour l ’homme, susceptible de souiller

l ’eau de boisson sont par exemple :

les salmonelles,
•les vibrions cholériques,
• Yersinia
•entérovirus
•giardia
•kystes amibiens ...

Ces µorg sont difficiles à mettre en évidence dans

l ’eau car ils sont peu nombreux et parce que la
souillure n ’est le plus souvent qu ’intermittente Benabdallah.S
DCE/M
nécessité du contrôle bactériologique
Les µorg pathogènes sont difficiles à mettre en évidence dans l ’eau car
ils sont peu nombreux et parce que la souillure n ’est le plus souvent
qu ’intermittente

ces agents pathogènes sont d ’origine fécale

nécessité de trouver des germes plus facile à rechercher et ayant la même

origine fécale

germes témoins de contamination fécale

leur présence dans l’eau : doute sur la potabilité (en général, ces Benabdallah.S
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germes accompagnent les germes pathogènes )
germes témoins de contamination fécale
Les µorg les plus représentatifs sont :

 les coliformes totaux

les coliformes fécaux ou thermotolérants
les streptocoques fécaux

 grande importance sanitaire

spécificité et une sensibilité différente

recherche simultanée permet une meilleure

interprétation des résultats
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NB. L ’analyse est complétée généralement par la recherche de DCE/M

BHR (37°C et 22°C)

 Choix des germes témoins de contamination fécale en fonction de
leurs exigences
 épidémiologique :
les études devraient établir la relation qui existe entre un indicateur, sa nature, son taux et la
probabilité d ’apparition d ’infections dans une population

 écologique :
doit être spécifique d ’une contamination fécale, et être toujours absent d ’un environnement non
pollué. Doit exister avec d ’autres germes et être sensible
son taux doit être élevé , plus que celui des pathogènes

 bactériologique :
il doit être plus résistant aux désinfectants que les pathogènes. Il sera incapable de se multiplier
dans l ’eau
 taxonomique :
il doit être parfaitement reconnu et classé en tant qu ’espèce selon les critères bactériologiques en
cours
 techniques :
doit être facile à détecter, rapidement et au moindre coût. Doit être capable d se X° sur des milieux
usuels sélectifs ou non doit être identifiable sans ambiguîté à l ’aide de réaction ou de tests simple.
(Cf. techniques) Benabdallah.S
DCE/M
 les coliformes totaux

Ceux sont des Enterobacteriacea

bacille GRAM négatif
non sporulés
oxydase négative
aérobies ou anaérobies facultatif
capable de se multiplier en présence de sels biliaires
capables de fermenter le lactose avec production d ’acide
et gaz en 48 heures à une température de 35 à 37°C

il existe dans ce groupe des bactéries d ’origine fécale et

des bactéries d ’origine non fécale

limite l’utilité de ce groupe comme indicateurs de pollution

fécale Benabdallah.S
DCE/M
 les coliformes fécaux
Ceux sont des Enterobacteriacea
bacille GRAM négatif
non sporulés
oxydase négative
aérobies ou anaérobies facultatif
capable de se multiplier en présence de sels biliaires
capables de fermenter le lactose avec production d ’acide et gaz
en 48 heures à une température de 41 à 44°C
( germes thermotolérants)

exclusivement d ’origine fécale

groupe le plus important comme indicateurs de pollution fécale

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l ’identification poussée des espèces est importante, elle permet de classer DCE/M
ces CF selon leur origine
classification traditionnelle des coliformes d ’origine fécale

Genre espece remarque

Escherichia E.Coli

Klebsiella K. pneumoniae rare

K. oxytoca

Enterobacter E. cloacae
E. aerogenes rare

Citrobacter C. freundi
C. koseri
C. amalonatica

seul un petit nombre de genre et d ’espèces sont répertoriés dans

ce tableau

en réalité les données taxonomiques modernes (nouvelles

techniques de biologie) montrent que ce nombre est beaucoup plus
élevé : + de 50 espèces Benabdallah.S
DCE/M
classification moderne des coliformes d ’origine fécale
Coliformes d’origine Coliformes d’origine Coliformes isolés en
fécale aquatique ou tellurique clinique : colonisateurs
ou pathogènes
opportunistes
Escherichia E. fergusonii
E.Coli E. hermanii
E. vulneris
Citrobacter
C. frundii
C. koseri
C. amalonaticus
Enterobacter
E. cloacae E. amnigenus E. asburia
E. aerogenes E. dissolvens E. gergovia
E. intermedius E. hormaechei
E. nimipressularis E. sakazakii
E. taylorae
Klebsiella
K. oxytoca K. planticola K. ornithinolytica
K. pneumoniae salmonella K. terrigena K. ozenae

Yersinia
Y. enterocolitica Y. aldovae
Y. bercovieri
Y. frederiksenii
Y. intermedia
Y. kristensenii
Y. mollareti
Y. rohdei
Serratia S. fonticola
S. grimesii S. marcescens
S. liquefaciens S. osorifera
S. plymuthica
S. proteamaculans
S. rubidea
Budvicia aquatica Ewingella americana
Buttiauxella agrestis Kluyvera ascorbata
Hafnai alvei K. cryocrensens
Leclercia adecarboxylata Koserella trabulsii
Pantoea agglomerans
P. dispersa
Rahnella aquatilis
Trabulsiella guamensis Benabdallah.S
Thermotophes ou Psychotrophes ou Mésophiles ou
thermotolérants psychotolérants thermotrophes ou
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psychrotrophes
les streptocoques fécaux
 on distingue 2 genres
streptococcus
enterococcus
témoins plus résistants E.Coli
ceux sont des germes témoins de contamination fécale
ils se multiplient rarement dans l ’eau
indicateurs supplémentaires de l ’efficacité du traitement

groupe indicateurs supplémentaires pour des résultats douteux pour les CF

les SF étant trés résistants à la dessiccation ils peuvent être utile pour les
contrôles à la suite de la pose de nouvelles canalisations ou lorsque des
réparations ont été effectuées dans le réseau Benabdallah.S
DCE/M
 les clostridiums sulfito-réducteurs
 appelés aussi : Cl anaérobies sulfito-réductrice ou Cl perfringens est
habituellement pris en compte dans les réglementations destinées à
garantir la potabilité des eaux
ne sont pas d ’origine exclusivement fécale
les spores de Cl survivent dans l ’eau (+ que les CF)
ils résistent à la désinfection (+ que les CF ou SF)

groupe indicateurs supplémentaires pour des résultats douteux pour les CF et SF

capables d ’indiquer une pollution intermittente ou à distance
OMS ne recommande pas de faire leur recherche en routine

les Cl étant résistants à la désinfection, leur présence dans les eaux désinfectées
peut indiquer un traitement déficient et que des pathogènes ont pu également Benabdallah.S
survivre DCE/M
les bactéries hétérotrophes revivifiables
 appelés aussi : germes totaux
2 types fondamentaux
les germes saprophytes qui se développent à 22°C (germes spécifiques à
l ’eau)
les germes dits « pathogènes » qui se multiplient à 37°C
(germes d ’origine fécale, se X° à 37°C)

le dénombrement des bactéries est souvent considéré comme accessoire

comparativement aux autres tests
donnent une indication sur la salubrité général du milieu

une seule numération des BHR est non significative

c ’est la comparaison des chiffres obtenus sur des échantillons de la même eau prélevée à des
moments différents de l ’année dans des conditions différentes peut apporter des éléments Benabdallah.S
d ’appréciation sur la protection de la nappe ou du réseau de distribution DCE/M
Devenir des bactéries
du milieu hydrique lors
des étapes de traitement

Benabdallah.S
DCE/M
Les caractéristiques propres aux microorganismes
tendance à se fixer, à décanter à s’agréer ….
va jouer un rôle très important dans leur devenir
La paroi des bactéries (même les virus) chargée négativement permet
la neutralisation des bactéries au cours de la coagulation /floculation
par les colloïdes amenés par le traitement

une grosse partie des bactéries est donc éliminée dés les premiers
traitement : décantation – coagulation et floculation

Remarque : en ce qui concerne les parasites l’effet mécanique de la

filtration est nettement plus important que pour les bactéries et les
virus étant donnée la taille des protozoaires Benabdallah.S
DCE/M
 mode d ’action des oxydants

 le mode d ’action est très mal connu car il y a un grand nombre de

variables interférentes
nature de la cible
de la concentration de l ’oxydant et du temps de contact
des conditions expérimentales

mécanisme d ’inactivation des bactéries

Le mécanisme peut s ’opérer sur les différentes structures :
la membrane cytoplasmique (cible préférentielle), -
augmentation de la perméabilité cellulaire,
 pénétration de l ’oxydant vers le cytoplasme

le enzymes intervenant dans le cycle respiratoire

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les acides nucleiques (ADN et ARN) DCE/M
 résistance des micro-organismes aux oxydants
La désinfection a pour ambition d ’inactiver les micro-organismes pathogènes

la résistance de certains micro-organismes aux désinfectants dépend de

nombreux facteurs :
la température
la nature de l ’organisme
son état physique ou physiologique (fixé, libre …)

 les bactéries sont plus sensibles aux désinfectants que les virus

les virus sont plus sensibles aux désinfectants que les kystes de protozoaires
pathogènes comme giardia ou cryptosporidium

les µorg fixés sur un support sont + résistants aux désinfectants que les µorg
libres

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DCE/M
Méthodes d’étude des
bactéries

Benabdallah.S
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méthodes d ’étude des bactéries au laboratoire

Dans le but de connaître la forme, le métabolisme, la structure des bactéries …

plusieurs techniques de plus en plus perfectionnées sont employées

Microscopie photonique Culture des bactéries au laboratoire

Microscopie électronique

Au laboratoire techniques d ’isolement , d ’identification et de conservation des

souches

technique de la membrane filtrante

technique du nombre le plus probable
technique d ’incorporation en gélose Benabdallah.S
technique d ’identification des entérobacteriacea par le système API 20 E DCE/M
 étude des bactéries grâce au microscope

Microscope photonique
 observation à l ’état frais :
une seule observation est possible avec l ’objectif X100 . Les bactéries sont montées
entre lame et lamelles avec un liquide physiologique par exemple. Elle concerne la
mobilité et la non mobilité des bactéries. Il n ’est pas possible de distinguer la forme
 observation d ’un frottis :
les bactéries sont séchées et fixées sur une lame puis colorées
2 types de coloration
coloration simple : ex bleu de méthylène
coloration complexe : coloration spécifique ou coloration de GRAM . On peut
distinguer les colonies roses : Gram - et les colonies violet : Gram +

Microscope électronique
Technique qui nécessite une préparation préalable
fixation
coupe ultra fine
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DCE/M
visualisation de la structure interne et externe
Examen des bactéries au microscope
Le microscope est un instrument fondamental dans l'étude des
bactéries.

Cette technique fut déterminante dans l'étude et l'identification

des bactéries. La préparation est d'abord déposée sur une lame de
verre, puis colorée après séchage pour être plus facile à observer.

Les colorations utilisées peuvent avoir une relative spécificité.

Le microscope électronique, grâce à ses grossissements beaucoup

plus importants que ceux des microscopes ordinaires, a aussi
constitué un progrès considérable.
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Coloration de gram

La méthode de coloration mise au point par Hans Christian Gram (1853-

1938) permet de distinguer deux types fondamentaux de bactéries : celles
dont la paroi est épaisse (comme Lactobacillus acidophilus qui apparaît
ici en bleu foncé), ou bactéries Gram positives, et celles dont la paroi est Benabdallah.S
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très mince, les Gram négatives.
 étude des bactéries grâce à la culture au laboratoire

l ’étude des bactéries a connu son plein essor à partir du moment ou furent mises au
point les techniques d ’isolement au laboratoire

découverte des milieux de culture liquide et solide

les milieux de culture liquides ou solides contiennent des substances nutritives

indispensables à la croissance des bactéries

les milieux liquides sont réparti dans des tubes

les milieux solides sont réparti dans des boites de pétri

la croissance des bactéries se manifeste par un trouble du milieu liquide et par la

présence de colonies caractéristiques dans le cas des milieux solides
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 les milieux de culture
Leur composition varie en fonction du but que l ’on veut atteindre (mettre en évidence tel ou tel germe)
et des besoins que requiert la bactérie

milieu d ’isolement : mise au point de milliers de milieux de culture empiriques.ces

milieux de culture sont commercialisées sous forme de poudre

ex : le bouillon nutritif
milieu simple très riche en composants nutritif, très utilisé en analyse bactériologique
extrait de viande de bœuf
peptone trypsique
chlorure de sodium

milieu sélectif ou d ’enrichissement

il s ’agit de milieux qui favorisent la multiplication de telle ou telle bactérie en mettant dans le milieu
des nutriments « spécifiques » de la bactérie ou en mettant un inhibiteur chimique.
ex : le tergitol 7 TTC
milieu simple qui permet la recherche des bactéries coliformes
 tergitol 7 , a un effet bactéricide sur les germes GRAM -
le TTC permet la reconnaissance rapide des colonies jaune avec halo jaune
milieu d ’identification :
milieux qui servent à mettre en évidence 1 ou plusieurs propriétés chez les bactéries ex : Kligler pour
la recherche de la fermentation d ’un sucre. Benabdallah.S
Actuellement les galeries de type API 20E, système perfectionné est de plus en plus utilisé DCE/M
culture des bactéries

Les bactéries peuvent être cultivées en milieu liquide, dans un flacon —

dans ce cas, elles se dispersent dans le milieu , ou
sur milieu solide,
généralement une boîte de Petri, comme sur cette Benabdallah.S

photographie. DCE/M
Présence des bactéries dans l’eau

Vie et présence Se manifeste par : augmentation de la taille

Des bactéries mais aussi du nombre de cellules

Benabdallah.S
DCE/M
Colonies Trouble du milieu
Le prélèvement en
bactériologie

Benabdallah.S
DCE/M
 le prélèvement en bactériologie
on dit très souvent : l’analyse commence au prélèvement . L’importance
de l ’échantillonnage est capitale :
a quoi serviraient les efforts prodigués pour avoir des moyens analytiques
fiables , précis et reconnus si l ’échantillon est contestable ou si le résultat
ne peut être relié de façon sûre à la matière d ’origine dont on recherche les
caractéristiques ???
le prélèvement bactériologique est très important car il faut veiller à ce que les
échantillons soient le plus représentatifs
trois types de questions se posent :

quelles précautions prendre pour que le prélèvement destiné à l’analyse

soit correctement représenté ??

Comment éviter que l ’échantillon soit modifié avant son arrivée au

laboratoire ??

Benabdallah.S
Quelles informations doivent être consignées par écrit pour s ’assurer de DCE/M
la réponse aux deux questions précédentes ??
Précautions à prendre
I - Flacons de prélèvements

- les flacons en verre ou en matière plastique conviennent

- le lavage et rinçage des flacons ne doit pas laisser de résidu toxique
ou inhibiteur pour les bactéries
- le volume le plus fréquent est 500 mL
- le bouchon doit être parfaitement étanche et ne doit pas fuir sous la
pression

stérilisation par la chaleur :

- l ’autoclavage (121°C, 20 minutes en vapeur humide)
- le chauffage en chaleur sèche pendant 1 heure et demi à 2 heures à
175°C est le plus commode pour la verrerie vide

CQA :
- un CQA permettant d ’assurer le lavage adéquat et la bonne Benabdallah.S
DCE/M
stérilisation doit être effectué
Prélèvement au robinet

 - les conditions d ’asepsie maximum doivent être assurées : propreté des

mains, protection contre les courants d ’air, protection contre les
éclaboussures…

- aucune souillure ne doit aller de la surface externe du robinet vers

l ’échantillon d ’eau : enlever les saletés, les brises jets

- un flambage du robinet assure une désinfection externe

- laisser couler l’eau en débit maximum pendant 5 à 10 secondes puis laisser

couler à débit moyen pendant 2 à 3 minutes puis faire le prélèvement.

- ne pas remplir au maximum le flacon, le 1/4 doit rester vide pour pouvoir
effectuer une agitation avant analyse

- le rebouchage doit être immédiat et ne pas se servir du flacon pour faire les
autres paramètres sur place (T°, pH…) Benabdallah.S
DCE/M
 prélèvement
dans les puits et forages

connaître la nappe :
il faut d ’abord remplacer l ’eau du puits par l ’eau de nappe, aussi, il faut faire un
pompage prolongé. La législation préconise 30 heures au début d ’utilisation du puits. Il
faut obtenir 2 ou 3 renouvellement du volume dans le puits au minimum avant de
prélever par immersion d ’un flacon lesté

qualité de l ’eau chez l ’usager :

cette qualité ne dépend pas de la qualité de la nappe car des modifications
microbiologiques prennent place dans le puits lui même. Par ailleurs des
contaminations externes ( oiseaux ruissellement, rongeurs, seaux …) peuvent survenir
si des précautions ne sont pas prises

les flacons lestés qui sont utilisés sont stérilisés

( flacons +lest + corde) sont stérilisés

Remarque : si les puits ou forage sont équipés d ’une pompe de refoulement, le Benabdallah.S
prélèvement est réalisé comme décrit pour un robinet DCE/M
 prélèvement
dans les lacs, rivières, mer…usées

L’une des principales sources de variation tient à

l ’absorption préférentielle des particules sur les particules
fines.

Les praticiens recommandent de plonger le flacon de prélèvement col vers le

bas jusqu ’a 20 à 30 cm sous la surface puis de le redresser pour présenter le
col vers l ’amont

le flacon est maintenu en général à contre courant

remarque :
pour le prélèvement des eaux usées, il est en général recommandé d ’utiliser
des gants stériles et ce pour éviter la contamination du préleveur

Benabdallah.S
DCE/M
 fiche de prélèvement

le prélèvement est toujours accompagné d ’une fiche de

renseignement qui indique

la localité ou lieu de prélèvement

le point spécifique de prélèvement
nature de l ’eau
l ’origine
date et heure du prélèvement
nom du préleveur

et tous les résultats des PSP (température, pH…)

observations ou anomalie notées sur le lieu du prélèvement

Benabdallah.S
DCE/M
Transport et
conservation des
échantillons

Benabdallah.S
DCE/M
 transport des échantillons

l ’analyse bactériologique doit être commencée le plus rapidement possible après

le moment ou l ’eau est prélevée
dés la mise en flacon des phénomènes se produisent qui vont modifier sa teneur
originelle en germes
la température
Le prélèvement a une charge originelle en germes, avec l ’augmentation de la
température, les bactéries exigeant une T° élevée pour se X° et se développer au
dépend des autres germes (ex: E.Coli). Le nombre d ’E.Coli va augmenter
rapidement, alors que les bactéries saprophytes vont voir leur nombre baisser

pour éviter tous ces phénomènes majeurs, il faut bloquer en maintenant l ’eau
prélevée à une température telle qu ’aucune X° de germes ne sera possible

la température conseillée est de +4°C

les échantillons peuvent être mis dans des glaciaires jusqu ’à arrivée au laboratoire

l ’analyse au labo doit être fait le + rapidement Benabdallah.S

DCE/M
au maximum 24 heures après le prélèvement
Conservation des échantillons

la température de conservation conseillée est de +4°C

les échantillons peuvent être mis dans des glaciaires
jusqu ’à arrivée au laboratoire
Veillez a ne pas contaminer l’échantillon

l ’analyse au labo doit être fait le + rapidement

au maximum 24 heures après le prélèvement

Benabdallah.S
DCE/M
Conservation des échantillons

il faut que l ’échantillon soit le plus représentatif du milieu, les changements à

l ’intérieur de l ’échantillon doivent être réduits au maximum

pour tous les types d ’eau traitée, naturelle, usée … l ’échantillon destinée à
l ’analyse bactériologique ne doit pas être congelé

les échantillons doivent être maintenus à une température basse de 4°C environ
( réfrigérateur pour la voiture)

les analyses doivent commencer le plus tôt possible, immédiatement à

l ’arrivée de l ’échantillon au laboratoire

chaque retard doit être pris en compte dans l ’interprétation des résultats et
signalé dans le rapport
Benabdallah.S
DCE/M
Les techniques
d’isolement et
d’identification des
bactéries

Benabdallah.S
DCE/M
 les techniques d ’isolement
utilisation de méthodes normalisées
normes marocaines
normes françaises
normes ISO…

méthodes utilisées sont différentes selon le type d ’eau à analyser

méthode de la membrane filtrante pour les eaux claires, potables, traitées

 méthode du nombre le plus probable pour les échantillons chargés en

MO, eau trouble, eau brute, eau usées

ces méthodes ont chacune ses avantages et ses inconvénients

ceux sont des méthodes simples employées universellement

méthodes avec 2 tests : présomptifs et confirmatifs

Benabdallah.S
DCE/M
méthodes employant des milieux de culture liquides et solides
 méthode de la membrane filtrante
Méthode qui consiste à filtrer un volume déterminé de l ’échantillon à travers une
membrane de 0, 45 µm de porosité
toutes les bactéries présentent sont retenues à la surface de la membrane
cette membrane est ensuite mise sur des milieux de culture gélosé approprié
incubation des boites aux températures différentes selon les germes recherchés

Entonnoir réservoir

Membrane filtrante
Plaque poreuse
Support métallique

Robinet

Bouchon en caoutchouc

Fiole à vide

Vide

Benabdallah.S
DCE/M
 méthode du nombre le plus probable
Méthode statistique

Méthode qui consiste à ensemencer un volume déterminé d ’échantillon ou ses dilutions dans des
tubes contenant des milieux appropriés

on place ensuite ces tubes à l ’étuve à des températures différentes selon les germes recherchés

toutes les bactéries éventuellement présentes sont révélés par des propriétés caractéristiques qui
leur sont propres

exemple pour les coliformes , leur présence est révélée par la présence du trouble du milieu et la
présence de gaz dans la cloche

on compte le nombre de séries de tubes positifs et le nombre de séries de tubes négatifs et on

obtient les résultats en extrapolant sur une table statistique appelée : table de MAC CRADY Benabdallah.S
DCE/M
 méthode d ’incorporation en gélose
Méthode qui est utilisée pour tous les types d ’eau

méthode qui permet de faire un dénombrement des bactéries vivantes sans faire de
distinction entre les différentes espèces

cette méthode permet de dénombrer les bactéries vivantes mais celles qui arrivent à
se X° sur gélose seulement

elle s ’effectue en déposant sur une aliquote d ’un échantillon dans une boite de pétri
à laquelle est ajouté de la gélose nutritive maintenue liquéfiée à environ 45 °C.

La boite de pétri est ensuite agitée doucement afin de répartir uniformément les
bactéries dans tout le volume de milieu disponible

la boite de gélose est laissée à refroidir sur une surface et ensuite incubées à une
température de 22°C et à 37°C pendant 24 et 72H

Benabdallah.S
le nombre de colonies est compté et les résultats sont exprimés en UFC/mL DCE/M