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Guide général de cryoconservation de

cultures de cellules animales


Bulletin technique

Life
Sciences

John Ryan, Ph.D. Introduction


Corning Incorporated
Maintenir en bonne santé des cultures de cellules en
Life Sciences croissance est une tache exigeante rendue encore
Lowell, MA 01851, USA plus difficile par le risque omniprésent de leur perte
par accident ou contamination. De plus, les cultures
Sommaire de cellules en croissance active ne sont pas statiques
mais, comme toutes les populations de microorgan-
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 ismes, soumises à des modifications liées à l'âge ou
induites par l'environnement qui peuvent conduire à
leur évolution et à leur perte potentielle.
Avantages de la congélation de cultures cellulaires . 2
La conservation cryogénique permet de minimiser
Principes de la congélation de cellules . . . . . . . . . . 2 ces problèmes en stoppant l'horloge biologique des
cultures cellulaires, les plongeant efficacement dans
Aspects pratiques de la congélation de cellules . . . . 3 une activité réellement suspendue. Ce concept,
longtemps un des stratagèmes favoris des écrivains et
Références . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 producteurs de cinéma de science-fiction, est devenu
réalité depuis l'importante découverte de Polge,
Smith et Parkes (11) en 1949 selon laquelle le gly-
cérol protège les cellules des lésions causées par la
congélation. De nombreux protocoles dignes de
recettes de cuisine sont maintenant disponibles pour
congeler des cellules, et ces procédures fonctionnent
généralement bien (3, 6, 13-16). Il est essentiel,
cependant, lorsque des problèmes surgissent ou que
les protocoles nécessitent une adaptation et des
améliorations, de bien comprendre les concepts sous-
jacents sur lesquels ils sont basés. Ce guide examine
les concepts théoriques de base et les aspects pra-
tiques nécessaires pour réussir la congélation de cel-
lules animales et pour gérer une banque de cellules.
Avantages de la congélation de ronnement extracellulaire, ce qui augmente
la concentration en solutés du milieu de
cultures cellulaires
culture. De ce fait, l'eau commence à sortir
La maintenance des cultures de cellules des cellules pour aller dans le milieu extra-
nécessite peu de temps et d'effort lorsqu'elles cellulaire partiellement congelé, ce qui ini-
sont correctement congelées et conservées. tialise le processus de déshydratation et de
Le seul réel coût sont les dépenses de main- rétrécissement cellulaires.
tenance d'un congélateur mécanique ultra-
Lorsque le processus de refroidissement est
froid (-130°C ou moins) ou d'une alimenta-
rapide, des cristaux de glace intracellulaires
tion en azote liquide. Ces dépenses limitées
se forment avant la fin du processus de
valent très largement le temps, l'effort et le
déshydratation cellulaire. Ces cristaux de
coût substantiel des milieux et fournitures
glace déchirent les membranes et les
nécessaires au maintien en activité de cul-
organelles cellulaires et entraînent la mort
Avantages de la tures en croissance active, ou le coût d'une
de la cellule pendant le processus de décon-
congélation de nouvelle culture obtenue à partir d'une
gélation (Figure 2).
cultures cellulaires banque. Les cultures congelées sont une
source importante de réserve de secours pour Lorsque le processus de réfrigération est
◗ Moins de travail-économise
remplacer les pertes occasionnelles dues aux lent, l'eau libre intracellulaire est expulsée
du temps et de l'argent. contaminations ou aux accidents, et assurent de la cellule par la force osmotique, entraî-
◗ Sert de réserve de secours une alimentation homogène de cultures. Des nant une déshydratation et un rétrécisse-
en cas d'urgence changements ou altérations cellulaires survi- ment complets de la cellule. Ceci peut
ennent dans toutes les populations en crois- également entraîner une mort cellulaire
◗ Fournit une population plus sance active. Ces changements entraînent mais il n'existe pas de consensus sur les
homogène en min- souvent la perte de caractéristiques impor- mécanismes impliqués. Les contraintes
imisant le vieillissement et tantes pendant l'évolution des cultures, physiques du rétrécissement cellulaire peu-
l'évolution de la culture. introduisant ainsi des variables indésirables vent provoquer quelques dégâts, entraînant
dans les expériences de longue durée. Les une perte de membrane irréparable et une
cultures conservées par cryogénisation ne perturbation du cytosquelette et des
subissent apparemment aucune modification organelles. Les concentrations élevées en
décelable une fois conservées en dessous de solutés dans le milieu extracellulaire non
–130°C (1, 8). Par conséquent, les effets congelé (essentiellement de l'eau salée) peu-
biologiques du vieillissement et de l'évolu- vent également provoquer des dégâts. Ces
tion cellulaires in vitro peuvent être min- solutés attaquent les cellules par l'intérieur
imisés en revenant fréquemment aux cultures et l'extérieur, endommageant la membrane
stock congelées, permettant ainsi de terminer et provoquant un déplacement du pH et
avec succès les expériences de culture de une dénaturation générale des protéines.
longue durée en cours sans subir de variables
Cependant, lorsque la vitesse de refroidisse-
indésirables. Les cultures congelées assurent
ment est suffisamment lente pour empêcher
également une ligne de base précieuse pour
la formation de glace intracellulaire, mais
mesurer ou comparer les modifications
suffisamment rapide pour éviter les effets de
futures induites par l'expérience.
déshydratation graves, les cellules peuvent
survivre aux processus de congélation et de
Principes de la congélation de décongélation. La zone ou fenêtre de survie
cellules est facilement observable chez de nom-
breuses bactéries ou autres procaryotes,
Pour comprendre pourquoi les protocoles
mais pour la plupart des cellules eucaryotes,
de congélation fonctionnent, il est néces-
elle est inexistante ou très difficile à trouver
saire d'examiner les évènements intracellu-
sans utiliser d'agents cryoprotecteurs. Ces
laires et extracellulaires qui surviennent
agents ont peu d'effet sur les dommages
dans les cultures de cellules animales pen-
causés par une congélation rapide (forma-
dant le processus de congélation (2, 4, 8).
tion de cristaux de glace intracellulaires),
La réfrigération initiale de la température
mais préviennent ou diminuent générale-
ambiante à 0°C ralentit le métabolisme cel-
ment les dommages dus à la congélation
lulaire, interrompant rapidement le trans-
lente (déshydratation et rétrécissement) (8).
port actif et la pompe ionique. Cette inter-
ruption n'endommage généralement pas la La température finale de conservation est
cellule si le milieu de culture est osmotique- également critique pour réussir une cry-
ment équilibré. Lorsque le refroidissement oconservation. Pour stopper entièrement
se poursuit (0° à –20°C), des cristaux de l'horloge biologique, les températures de
glace commencent à se former dans l'envi- conservation doivent être maintenues en

2
Refroidissement Refroidissement Refroidissement Refroidissement
lent rapide lent rapide

Mort cellulaire par Mort cellulaire par Les cellules se Mort cellulaire par
effet de dommages dus aux Déshydratent mais dommages dus aux
déshydratation cristaux de glace survivent cristaux de glace
internes internes
SansCryoprotection
Sans cryoprotection AvecCryoprotection
Avec cryoprotection

Figure 1. Effets des vitesses de congélation sur les cellules.

dessous de –130°C, point de transition vit- dure est facilitée par la culture des cellules
reuse en dessous duquel l'eau liquide n'ex- dans un milieu sans antibiotique pendant
iste pas et la diffusion est insignifiante. Bien plusieurs passages avant de les tester. Ceci
que de nombreuses cultures cellulaires laisse du temps à toute contamination résis-
soient conservées avec succès entre -70°C et tante ou cachée (présente en très petit nom-
l'horloge biologique n'est pas stoppée, mais bre) d'atteindre un niveau plus élevé et donc
uniquement ralentie, et des altérations ou plus facilement détectable. Examiner
modifications cellulaires vont s'accumuler. ensuite des échantillons de ces cultures au
microscope et les tester par culture directe
La conservation dans l'azote liquide à
pour rechercher la présence de bactéries,
–196°C prévient efficacement toutes les
levures, champignons et mycoplasmes.
réactions chimiques thermodépendantes.
Seuls les effets physico-chimiques causés Les mycoplasmes représentent un problème
par le rayonnement ionisant de fond est particulier, car ils peuvent être trouvés à des
toujours actif à cette température. On concentrations très élevées (jusqu'à 108
estime qu'il faudrait des milliers d'années organismes par millilitre de milieu) dans les
avant que ces rayonnements de fond ne pro- cultures sans effets ni turbidité visibles.
duisent d'effets notables sur les cellules cry- Ainsi, jusqu'à 20% de toutes les cultures de
oconservées (2, 8). –90°C pendant des mois cellules animales sont contaminées par ces
ou même des années. organismes ubiquitaires mais invisibles.
Malgré les efforts particuliers nécessaires
Aspects pratiques de la pour détecter les mycoplasmes, les con-
séquences sérieuses de leur présence ren-
congélation de cellules dent absolument essentiel le test de tous les
Mêmes dans les meilleures circonstances, le stocks de cultures congelées (9, 12).
processus de congélation reste stressant
Vérifier l'identité des cultures et la présence
pour toutes les cultures cellulaires. Il est
de toutes les caractéristiques particulières
important de faire tout ce qui est possible
attendues. Contrôler l'identité des cellules
pour minimiser ce stress sur les cultures afin
par leur caryotype et leur analyse isoenzy-
de maximiser leur récupération et survie
matique pour s'assurer qu'elles sont au
ultérieures. Les suggestions et recomman-
moins de la bonne espèce (10).
dations suivantes sont conçues pour com-
pléter les protocoles cités précédemment. II. Récolte des cellules
I. Sélection des cellules Démarrer par la procédure de récolte stan-
S'assurer d'abord que les cellules sont dans dard généralement conseillée pour la cul-
le meilleur état possible. Sélectionner les ture en étant aussi délicat que possible.
cultures proches de la fin de la phase de Retirer tous les agents de dissociation en
croissance logarithmique (à environ 90% de lavant ou en les inactivant (particulièrement
confluence) et changer leur milieu 24 important en cas d'utilisation de milieu sans
heures avant de les récolter. Rechercher sérum). La centrifugation, lorsqu'elle est
soigneusement toute trace de contamination absolument nécessaire, doit être juste suff-
microbienne dans la culture. Cette procé- isamment forte pour obtenir un culot sou-

3
ple : 100 x g pendant 5 à 6 minutes sont faire particulièrement attention à éviter tout
généralement suffisants. Pour assurer l'uni- contact avec une solution contenant du
formité du stock final congelé, rassembler DMSO. C'est un solvant polaire très puis-
les contenus de tous les récipients de cul- sant capable de pénétrer rapidement dans la
ture récoltés. Ceci facilite également l'exé- peau intacte en emportant avec lui des con-
taminants dangereux tels que des car-
cution des tests de contrôle qualité essen-
cinogènes ou des toxines. Certaines lignées
tiels pour la recherche des contaminations
cellulaires sont affectées par un contact pro-
microbienne et l'identification de la culture. longé avec le DMSO. Cet effet peut être
Compter puis diluer ou concentrer la sus- réduit ou éliminé en ajoutant le DMSO à la
pension de cellules récoltées pour obtenir suspension cellulaire à 4°C et en le retirant
deux fois la concentration finale désirée, qui immédiatement lors de la décongélation. Si
cela n'aide en rien, abaisser la concentration
est habituellement de 4 à 10 millions de cel-
Prévention des altéra- ou essayer du glycérol ou un autre cryopro-
lules viables par millilitre. Un volume égal
tecteur.
tions par congélation de milieu contenant l'agent cryoprotecteur
◗ Exécuter une congélation à deux fois sa concentration finale sera Le glycérol est généralement utilisé à une
lente pour extraire toute ajouté plus tard pour obtenir l'inoculum concentration finale de 5 et 20% (v/v).
Stériliser par autoclavage pendant 15 min-
l'eau intracellulaire. désiré. Conserver les cellules au frais pour
utes dans de petits volumes (5 mL) et
ralentir leur métabolisme et les empêcher
◗ Utiliser des agents cry- réfrigérer à l'obscurité. Bien qu'étant moins
oprotecteurs pour min-
de s'agréger. Éviter toute dérive alcaline du toxique pour les cellules que le DMSO, le
imiser les effets de la
pH en aérant avec du CO2 si nécessaire glycérol cause fréquemment des problèmes
déshydratation. osmotiques, surtout après décongélation.
III. Cryoprotection Toujours l'ajouter à température ambiante ou
◗ Conserver en dessous de Comme mentionné précédemment, les supérieure et le retirer lentement par dilu-
-130°C pour arrêter agents de cryoprotection sont nécessaires tion.
complètement l'horloge pour minimiser ou empêcher les détériora-
tions associées à la congélation lente. Les Les concentrations élevées en sérum peuvent
biologique.
mécanismes permettant cette protection, également aider les cellules à survivre à la
bien qu'incomplètement compris, semblent congélation. Le remplacement des mélanges
fonctionner essentiellement en modifiant l'é- milieu-cryoprotecteur standards par 95% de
tat physique de la glace et des solutions sérum et 5% de DMSO peut être meilleur
entourant immédiatement (extérieures aux) pour certaines lignées cellulaires trop sensi-
les cellules. La perméation des cellules par bles, surtout les hybridomes.
des agents cryoprotecteurs n'apparaît pas Ajouter les agents cryoprotecteurs au milieu
nécessaire pour leur action correcte (4). de culture (sans cellules) immédiatement
Rappelons que ces agents ne protègent pas avant de l'utiliser pour obtenir deux fois la
contre les dégâts dus à une congélation rapi- concentration finale désirée (2X). Mélanger
de (formation de glace interne), mais protè- cette solution 2X avec un volume égal de
gent plutôt par un contrôle attentif de la suspension cellulaire récoltée (également 2X)
vitesse de congélation. Une grande variété pour obtenir l'inoculum à congeler. Cette
de produits chimiques assure une cryopro- méthode est moins agressive pour les cel-
tection adéquate, y compris l'acétamide de lules, surtout en cas d'utilisation de DMSO
méthyle, le méthanol, l'éthylène glycol et la comme cryoprotecteur.
polyvinylpyrrolidone (7). Cependant, le
diméthylsulfoxyde (DMSO) et le glycérol IV. Récipients de conservation
sont les plus pratiques et les plus largement Après avoir mélangé la solution cryoprotec-
utilisés. Plusieurs de ces agents, bien qu'as- trice avec la suspension cellulaire, l'inocu-
surant une excellente cryoprotection, ont des lum résultant est ajouté par petits aliquote
effets secondaires toxiques sur les cultures, (généralement 1 à 2 millilitres) à chaque
rendant leur utilisation difficile. récipient de stockage. Du fait des tempéra-
Le DMSO est le plus souvent utilisé à une tures extrêmement basses rencontrées en
concentration finale de 5 à 15% (v/v). cryoconservation, toutes les matières ou
Toujours utiliser une qualité réactif ou une conceptions de récipients ne sont pas
autre pureté suffisamment élevée dont la appropriées ni sures. De nombreux matéri-
compatibilité a été testée. Stériliser par filtra- aux deviennent cassants à ces températures ;
tion à travers une membrane de Nylon de les récipients qui en sont composés peuvent
0,2 microns dans un logement en polypropy- se briser ou se craqueler pendant le stock-
lène ou en acier inoxydable et conserver en age ou la décongélation. Vérifier soigneuse-
petites quantités (5 mL). ATTENTION : ment les recommandations du fabricant du
récipient avant de le choisir et de l'utiliser.
4
Figure 2. Tubes cryogènes Corning à bouchon coiffant (gauche) et à bouchon entrant (droite)

Il est également important de choisir le sys- ampoules scellées pendant 30 minutes dans
tème de scellage ou le type de bouchon util- une solution réfrigérée d'éthanol à 70%
isé pour maintenir l'intégrité du récipient, contenant 1% de bleu de méthylène. Cette
surtout pour le stockage dans l'azote liq- solution pénètre rapidement et colore toute
uide. Si ces récipients fuient pendant le ampoule présentant une fuite ; après rinçage
stockage (comme beaucoup le font), ils se à l'eau, les ampoules défectueuses sont alors
rempliront lentement d'azote liquide. facilement détectées et écartées.
Lorsqu'ils reviennent finalement à la tem-
Du fait de leur meilleure sécurité et de leur
pérature ambiante, l'azote liquide se vapor-
côté pratique, les tubes en plastique ont
ise rapidement en entraînant une accumula-
largement remplacé les ampoules de verre
tion rapide de pression. Les récipients peu-
en cryoconservation. La grande variété de
vent alors expulser violemment leur bou-
formes et de caractéristiques particulières
chon ou exploser pour relâcher la pression
comme les surfaces de marquage imprimées
et libèrent alors leur contenu dans l'atmo-
et les bouchons colorés facilitant l'identifi-
sphère. Ceci crée une situation très dan-
cation a également contribué à leur popu-
gereuse, surtout si les récipients contien-
larité.
nent des organismes pathogènes ou des sub-
stances potentiellement toxiques ou dan- Différents types de capuchons sont
gereuses. Une conservation au-dessus de disponibles, certains à bouchons entrants et
l'azote liquide est vivement conseillée pour d'autres à bouchons coiffants qui aident à
diminuer les risques potentiels dans ces sit- minimiser la contamination (voir Figure 3).
uations.
V. Étiquetage et archivage
Deux types de récipients sont couramment
Assurer une localisation et une identifica-
utilisés en cryoconservation : les ampoules
tion de longue durée des cultures cellulaires
de verre thermoscellables et les tubes en
est le domaine le plus fréquemment négligé
plastique (généralement du polypropylène)
de la cryoconservation. Une banque de cel-
à bouchon vissant. Les deux sont
lules cryogénique est sensée survivre aux
disponibles dans différentes tailles (capacité
travailleurs du laboratoire ayant contribué à
de 1 à 5 mL), bien que les tailles les plus
son établissement, mais des archivages d'in-
faibles soient préférées pour la cryoconser-
ventaires mal entretenus ou inexistants, et
vation (voir Figure 2).
des tubes et ampoules mal étiquetés ou de
À cause des problèmes d'étanchéité et d'éti- façon illisible peut empêcher cela, surtout
quetage, les ampoules de verre ne sont plus après le départ des responsables.
aussi largement utilisées dans les labora-
Les étiquettes doivent contenir suffisam-
toires de culture cellulaire. Des "trous
ment d'informations pour localiser les
d'épingle" invisibles peuvent se former dans
archives appropriées ; généralement, l'iden-
les tubes pendant le processus de scellage ;
tité de la culture, la date de congélation, et
s'ils sont ensuite stockés immergés dans l'a-
les initiales de la personne responsable sont
zote liquide, ils peuvent exploser lorsqu'on
suffisants. La plupart des tubes en plastique
les retire pour les décongeler. Les trous
possèdent des points ou zones de marquage
d'épingle peuvent généralement être détec-
facilitant leur étiquetage. Sur les tubes et
tés avant congélation en immergeant les
ampoules sans point de marquage, utiliser

5
s'effacer pendant les stockages de longue
durée ; nous conseillons de faire un essai
d'au moins plusieurs semaines.
Consigner avec précision dans un registre
les conditions de stockage des cultures,
comprenant toutes les informations suiv-
antes : identité de la culture, nombre de
passages, date de congélation, milieu et
méthode de congélation utilisés, nombre
de cellules par tube, nombre total de
tubes initialement congelés, le nombre
restant, leurs emplacements, leur viabilité
Tube cryogène Tube cryogène Tube cryogène attendue et les résultats de tous les tests
à bouchon coiffant à bouchon entrant à bouchon coiffant
de contrôle qualité effectués (stérilité,
mycoplasmes, espèce, caryotype, etc.).
Figure 3. Formes de bouchons de tubes cryogènes Corning Des informations complémentaires sur les
cultures, surtout leur origine, historique,
paramètres de croissance, caractéristiques
des étiquettes en toile avec des adhésifs spé-
ciaux composés spécialement pour les con- spéciales et applications sont également
ditions cryogéniques. utiles et doivent être ajoutées chaque fois
que possible.
Des encres spéciales à base de céramique
sont disponibles pour étiqueter les Faire des efforts particuliers pour garder
ampoules de verre. Appliquer ces encres toutes les archives à jour et pour s'assurer
avant le remplissage puis les cuire sur le que tout le monde dans les locaux les
verre, généralement pendant la stérilisation utilise correctement. Utiliser des formu-
à chaleur d'archivage informatisé ; toujours laires pré-imprimés pour faciliter la
conserver une copie de sauvegarde actual- procédure d'archivage des informations et
isée en plus des informations conservées favoriser son exécution. Conserver des
dans l'ordinateur.
copies actualisées de toutes les archives
VI. Vitesse de réfrigération cruciales dans un endroit sûr à l'écart du
laboratoire pour les protéger contre toute
La vitesse de refroidissement utilisée pour
perte ou destruction accidentelle. Ceci est
congeler les cultures doit être juste assez
particulièrement important pour un sys-
lente pour permettre aux cellules de se
tème
déshydrater, mais suffisamment rapide
pour empêcher des altérations dues à une La meilleure façon de contrôler les
déshydratation excessive. Une vitesse de vitesses de réfrigération est l'utilisation
refroidissement de –1°C à –3°C par d'appareils de congélation électroniques
minute convient à la plupart des cultures programmables. Bien qu'ils soient chers,
de cellules animales. Les cellules plus ils permettent un contrôle précis du
grandes, ou les cellules possédant des processus de congélation, donnent des
membranes moins perméables, peuvent résultats uniformes et reproductibles, et
nécessiter une vitesse de congélation plus peuvent congeler un grand nombre de
lente car leur déshydratation prendra plus tubes ou d'ampoules. La plupart des
de temps. Des points de marquage per- appareils sont disponibles avec un enreg-
manents peuvent être appliqués sur les istreur pour un rapport permanent du
ampoules de verre avec du vernis à ongle processus de réfrigération.
blanc. Lorsqu'il a séché, utiliser un stylo Il existe de nombreux appareils de con-
de marquage de laboratoire pour écrire gélation mécaniques différents, relative-
sur le point. ment peu chers permettant de contrôler
Quelle que soit la méthode de marquage correctement la vitesse de réfrigération.
choisie, faire très attention à bien vérifier Certains appareils utilisent des portoirs
sa permanence en conditions cryo- conçus pour accueillir des tubes à des
géniques. Certaines zones de marquage, profondeurs prédéterminées dans le col
encres et étiquettes peuvent s'effriter ou d'un cryoconservateur à azote liquide. La

6
vitesse de congélation dépend du nombre VII. Conservation cryogénique
total de tubes et de la profondeur à laquelle Seuls les congélateurs capables de maintenir
le portoir est placé. Une autre technique en continu une température inférieure à
utilise un "canister" en métal ou plastique –130°C doivent être considérés comme des
rempli d'alcool contenant un portoir d'une cryoconservateurs de longue durée. Bien
capacité de 24 tubes maximum. La boîte que la plupart des congélateurs refroidis à
remplie est placée dans un congélateur l'azote liquide et certains congélateurs
mécanique ultra-froid où l'alcool agit mécaniques spécialement conçus répondent
à ces exigences, la plupart des laboratoires
comme un bain pour obtenir un transfert
de culture cellulaire préfèrent les cryocon-
thermique et une réfrigération plus uni-
servateurs à azote liquide (Voir Figure 4).
formes. Après une congélation de 4 à 5 Le choix final est souvent basé sur la
heures, les tubes sont retirés de la boîte et disponibilité d'une alimentation fiable en
transférés dans leur emplacement de stock- azote liquide, la capacité de stockage néces-
age final. saire, et l'importance du budget. Les cry-
oconservateurs à azote liquide permettent
Les boîtes en carton ou en mousse de poly-
un stockage soit dans les vapeurs d'azote au-
styrène isolées sont couramment utilisées
dessus du liquide entre –140°C et –180°C,
comme chambre de congélation dans les soit en immersion dans le liquide à une
congélateur ultra-froids. Ces systèmes température inférieure à –196°C. La con-
maisons marchent bien avec de nombreuses servation dans la phase gazeuse diminue
lignées cellulaires mais ne donnent pas tou- considérablement le risque d'explosion de
jours une réfrigération contrôlée, repro- tubes ou d'ampoules présentant une fuite au
ductible ou uniforme. Ainsi, il peut exister moment de leur retrait. Cependant, comme
des différences importantes de viabilité la quantité d'azote liquide dans le cryocon-
entre les tubes lors de la décongélation. servateur est réduite pour faire de la place
Cette approche maison n'est pas conseillée pour une conservation dans la phase vapeur,
l'autonomie du cryoconservateur (durée de
pour les cultures précieuses ou irrem-
maintien de sa température de stockage sans
plaçables.
ajouter d'azote liquide supplémentaire) est
Quelle que soit la méthode de réfrigération également réduite. Ceci abaisse la marge de
utilisée, le transfert de la chambre ou de sécurité du cryoconservateur et nécessite
l'appareil de réfrigération vers l'emplace- une surveillance et un contrôle plus
ment de stockage final doit se faire rapide- fréquents. Prêter une attention toute partic-
ulière à ces problèmes de sécurité lors du
ment pour éviter le réchauffement des
choix de la méthode de stockage.
tubes. Utiliser un récipient de transfert isolé
rempli de carboglace ou d'azote liquide Vérifier régulièrement les niveaux d'azote
pour s'assurer que les cellules demeurent en dans les cryoconservateurs ; établir un cal-
dessous de –70°C. endrier et s'y conformer strictement.
L'évaporation de l'azote dépend du degré
d'utilisation et de l'autonomie statique du
cryoconservateur. Des augmentations
soudaines et inexpliquées de la vitesse d'éva-
poration peuvent signaler une détérioration
de l'isolation ou l'apparition d'autres prob-
lèmes avec le cryoconservateur qui doivent
être activement recherchés. Éviter la forma-
tion de givre ou de glace autour des ouver-
tures du cryoconservateur ; ceci augmente
la vitesse d'évaporation de l'azote et peut
entraîner des augmentations de température
dans la partie supérieure des cryoconserva-
teurs à phase vapeur. Des systèmes d'alarme
sonore pour détecter des niveaux faibles
d'azote liquide procurent une sécurité sup-
plémentaire ; cependant, ils donnent un
faux sentiment de sécurité s'ils ne sont pas
surveillés 24 heures sur 24.
Figure 4. Cryoconservateurs classiques

7
VIII. Décongélation laire décongelée peut provoquer un choc
ATTENTION : toujours utiliser un osmotique, endommageant ou détruisant les
équipement de sécurité approprié pour retir- cellules. Utiliser plusieurs dilutions en série
er des tubes ou ampoules de cryoconserva- avec un volume égal de milieu tiède toutes
teurs à azote liquide ou en phase vapeur. Le les 10 minutes avant tout traitement supplé-
port d'un écran facial complet, de cryogants mentaire pour donner du temps aux cellules
épais et d'un tablier de laboratoire est vive- pour réajuster leur équilibre osmotique.
ment conseillé pour se protéger des explo-
sions de tubes et ampoules. X. Suggestions de résolution de
problèmes
Retirer le tube ou l'ampoule de son
Les problèmes de viabilité associés à la cry-
emplacement de stockage et vérifier
oconservation sont généralement rencontrés
soigneusement l'étiquette et le registre de
tout de suite après la décongélation et
stockage pour s'assurer que c'est la bonne
l'ensemencement des cellules. Les prob-
culture. Placer le récipient dans l'eau tiède,
lèmes surviennent dans quatre secteurs
en l'agitant doucement jusqu'à décongéla-
principaux:
tion complète. Une décongélation rapide
(60 à 90 secondes à 37°C) permet d'obtenir 1. Pendant la récolte et le traitement des
une meilleure récupération pour la plupart cellules. Les problèmes peuvent être dus
des cultures cellulaires ; elle réduit ou à une exposition excessive des cellules aux
empêche la formation de cristaux de glace agents de dissociation, à l'utilisation d'un
pouvant endommager la cellule pendant la agent cryoprotecteur toxique ou à des
réhydratation. suspensions cellulaires à forte densité
laissées trop longtemps à température
IX. Rétablissement ambiante ou à un pH trop alcalin.
Certains agents cryoprotecteurs peuvant 2. Pendant le processus de réfrigération
endommager les cellules après une exposi- (congélation). Des cellules excessivement
tion prolongée, il faut retirer ces agents endommagées et une viabilité des cul-
aussi rapidement et délicatement que possi- tures réduite résultent souvent de l'appli-
ble. Plusieurs approches sont utilisées suiv- cation d'une vitesse de réfrigération trop
ant l'agent cryoprotecteur et les caractéris- rapide ou trop lente, ou d'une interrup-
tiques des cellules. tion temporaire du processus de
La plupart des cellules récupèrent normale- réfrigération. Le fait de ne pas utiliser l'a-
ment si l'agent de cryoprotection est retiré gent cryoprotecteur approprié à la bonne
par changement de milieu dans les 6 à 8 concentration entraîne également des
heures après décongélation. Transférer le problèmes de viabilité.
contenu de l'ampoule ou du tube dans un 3. Pendant la cryoconservation. La viabil-
flacon T-75 ou un autre récipient approprié ité des culture est souvent réduite
contenant 15 à 20 millilitres de milieu de lorsqu'on laisse les tubes se réchauffer
culture et incuber normalement. Dès pendant le transfert vers le congélateur,
qu'une majorité des cellules a adhéré, retir- ou si la température de la banque n'est
er le milieu contenant l'agent cryopro- pas maintenue constante à des tempéra-
tecteur maintenant dilué et le remplacer par tures cryogéniques appropriées.
du milieu frais.
4. Pendant la décongélation et la récupéra-
Pour les cellules sensibles aux agents cry- tion. Les problèmes surviennent souvent
oprotecteurs, il est possible de retirer facile- lorsque le processus de décongélation est
ment l'ancien milieu par une centrifugation trop lent ou que les cryoprotecteurs ne
douce. Transférer le contenu du tube ou de sont pas correctement retirés (voir ci-
l'ampoule dans un tube à centrifuger de 15 dessus).
mL contenant 10 mL de milieu frais et cen-
trifuger pendant 5 minutes à 100 x g. Jeter Ces problèmes de viabilité peuvent souvent
le surnageant contenant l'agent cryopro- être corrigés en utilisant les techniques suiv-
tecteur et resuspendre le culot cellulaire antes pour identifier l'étape du processus de
dans du milieu frais. Transférer ensuite la congélation qui est à l'origine du problème.
suspension cellulaire dans un récipient de
culture approprié et incuber normalement. Récolter suffisamment de cellules pour pré-
parer au moins quatre tubes. Prélever un
En cas d'utilisation de glycérol comme cry-
échantillon de suspension cellulaire, équiva-
oprotecteur, l'addition brusque d'un grand
lent au nombre de cellules qui sera placé
volume de milieu frais à la suspension cellu-
dans les tubes, et le déposer immédiatement

8
dans un récipient de culture avec la quantité à quelle étape du processus de congélation
adéquate de milieu et incuber. Cette culture survient le problème. Une fois cela identifié,
sera utilisée comme contrôle pour la com- les informations présentées dans ce guide et
parer avec les cultures traitées dans les étapes ces références devraient être suffisantes pour
restantes. résoudre le problème.

Liste de contrôle de congélation XI. Gestion d'une banque de cellules


◗ Récolter délicatement les cellules. Les efforts et les dépenses investis dans la
◗ Vérifier l'absence de contamination dans les gestion d'une banque doivent être mis en
cultures, surtout par les mycoplasmes. relation avec la valeur des cultures qui y sont
◗ Vérifier l'identité de la culture par caryotype ou stockées. Cette valeur est déterminée en
analyse aux isoenzymes. répondant à deux questions : combien de
temps, d'argent et d'effort ont-ils déjà été
◗ Utiliser des agents cryoprotecteurs testés.
investis dans ces cultures cellulaires stockées ?
◗ Utiliser uniquement des tubes testés pour les Et, quelles seraient les conséquences de leur
conditions cryogéniques. perte ? Les cultures facilement remplaçables
◗ S'assurer que l'étiquette est permanente et auprès d'autres laboratoires ou de sources
complète. commerciales ne nécessitent pas d'efforts
◗ Contrôler la vitesse de réfrigération. particuliers, mais les cultures uniques, telles
◗ Conserver les cultures en dessous de –130°C.
que des hybridomes et autres cellules
génétiquement modifiées, sont irrempla-
◗ Surveiller fréquemment les niveaux d'azote liq- çables et exigent des efforts spéciaux à mettre
uide.
en ?uvre pour assurer leur sécurité. Les
◗ Archiver correctement. réponses à ces questions vous aideront à
déterminer jusqu'où doivent porter vos
efforts.
Ajouter ensuite l'agent cryoprotecteur aux
cellules restantes et diviser en trois tubes. Identifier ensuite les domaines pouvant poser
Placer un tube à 4°C pendant une heure. des problèmes conduisant à la perte de ces
Retirer ensuite les cellules du tube, procéder cultures. Certains de ces domaines, comme le
comme si elles venaient juste d'être décon- choix du récipient, l'archivage, l'étiquetage, la
gelées du cryoconservateur, et ensemencer surveillance du cryoconservateur, les con-
dans un milieu comme ci-dessus. Cette cul- ditions de stockage et les problèmes de
qualité (contamination et identité des
ture sera comparée à la culture contrôle pour
espèces), ont déjà été abordés dans ce guide.
voir s'il y a des problèmes associés à l'agent
Décider quels étapes sont nécessaires pour
de cryoprotection. éliminer ou minimiser ces problèmes.
Pendant ce temps, traiter les tubes restants Répartir les cultures irremplaçables ou très
en leur appliquant la procédure habituelle de précieuses dans plusieurs cryoconservateurs,
réfrigération lente. Un tube est alors immé- avec au moins un cryoconservateur dans un
autre endroit pour se protéger contre les
diatement décongelé et traité comme
incendies ou autres catastrophes naturelles.
précédemment. Cette culture sera comparée
Les collègues des autres laboratoires ou
à la culture contrôle pour déterminer s'il y a autres bâtiments devraient pouvoir vous
des problèmes liés à la procédure de assurer une réserve de secours, surtout en cas
réfrigération lente. d'arrangement réciproque.
Transférer le tube restant dans le cryoconser-
Une étape finale demeure ; planifier à
vateur et le conserver pendant la nuit avant
l'avance les urgences ! Une des urgences les
de le décongeler et de le traiter comme ci- plus sérieuses et inattendues est la panne de
dessus. Cette culture sera comparée à la cul- cryoconservateur. Une surveillance attentive
ture contrôle pour déterminer s'il y a des du niveau d'azote liquide ou un diagramme
problèmes liés aux conditions de cryoconser- de température peut donner une alerte
vation. Si des tubes sont encore disponibles, précoce d'une défaillance en cours, mais une
utiliser différentes techniques de récupéra- panne au milieu de la nuit peut également se
tion pour déterminer si cette technique est la produire. Préparer des plans à l'avance pour
source du problème. gérer une panne de cryoconservateur ou les
autres problèmes. Si ces plans impliquent
En comparant toutes les cultures à la culture l'équipement d'un collègue, obtenir sa
d'origine, il doit être possible de déterminer permission et faire tous les arrangements

9
nécessaires à l'avance – les coups de 7. Klebe, R. J. and M. G. Mancuso, 1983.
téléphone tard dans la nuit sont Identification of New Cryoprotective Agents
for Cultured Mammalian Cells.
généralement peu appréciés.
In Vitro 19:167-170.
Ces informations ont été réunies pour 8. Mazur, P., 1984. Freezing of Living
Cells: Mechanisms and Implications,
rédiger ce guide permettant de mieux
p. C125-C142. Am. J. Physiol. 247
comprendre le processus de (Cell Physiol. 16).
cryoconservation. Pour obtenir une
9. McGarrity, G. J., J. Sarama, and V. Vanaman,
assistance dans ce domaine, merci de 1985. Cell Culture Techniques. ASM News
contacter le Service Technique de Corning 51:170-183.
Life Sciences au 800.492.1110, 10. Peterson, W. D., W. F. Simpson and
1.978.635.2200 ou écrire à l'adresse B. Hukku, 1973. Cell Culture Characterization:
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