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NIM B
Interactions du faisceau avec les
matériaux et les atomes

Instruments et méthodes nucléaires en recherche physique B 265 (2007) 370–374

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Immobilisation de Rhodococcus erythropolis B4 sur l'hydrogel de poly

(vinylpyrrolidone) réticulé par rayonnement: Application à
la dégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques

A. Djefal-Kerrar une,*, S. Gais une, K. Ouallouche une, A. Nacer Khodja une,

M. Mahlous une, H. Hace`ne b
une Division des applications nucléaires, Centre de recherche nucléaire d'Alger, 2 Bd Frantz Fanon BP-399 Alger-gare, Alger, Algérie
b Institut des sciences biologiques, Université des sciences et technologies Houari Boumediene, Alger, Algérie

Disponible en ligne le 8 septembre 2007

Abstrait

Un hydrogel de poly (vinylpyrrolidone) (PVP) réticulé par rayonnement gamma a été utilisé pour immobiliser, par adsorption, Rhodococcus erythropolis B4 souche. Les cellules
immobilisées ont été testées pour leur capacité à dégrader le naphtalène et l'anthracène, dans des conditions aérobies.
Les résultats ont montré que la souche fixée est capable de croître en présence de naphtalène ou d'anthracène en tant que source unique de carbone. Il a également été démontré que la
souche fi xe peut être conservée par lyophilisation pour une utilisation ultérieure. La capacité de biodégradation a été améliorée lors de la deuxième utilisation.

2007 Elsevier BV Tous droits réservés.

PACS: 61.82.Pv; 87,68 + z; 89.20.Bb; 92.20.jb

Mots clés: Immobilisation cellulaire; Poly (vinylpyrrolidone); Réticulation par rayonnement; Anthracène; Naphtaline; Biodégradation

1. Introduction
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants
environnementaux répandus. Ils sont générés à partir du pétrole et de nombreux
procédés de pyrolyse. Ils inquiètent en raison de leurs effets potentiellement
délétères sur la santé humaine et beaucoup peuvent être récalcitrants dans
l'environnement [1] . Parmi eux, le naphtalène, un HAP de bicyclette, est rejeté dans
l'environnement sous forme de goudron de houille et de produits de goudron de
houille [2] . Tandis que l'anthracène, un tricycle HAP, se trouve en grande quantité
dans les sédiments contaminés par les HAP, les sols de surface et les décharges.
Ce contaminant hydrophobe est toxique pour la vie aquatique [3] .
Diverses technologies de nettoyage existantes pour le traitement des
hydrocarbures peuvent être classées en trois schémas généraux: chimique,
physique et biologique. La dégradation par
*
Auteur correspondant. Tél .: +213 21 43 44 44; fax: +213 21 43 42 80.
Adresse électronique: kerasdjef@yahoo.fr (A. Djefal-Kerrar).
les micro-organismes font l'objet de nombreux travaux [4–7] . Une large gamme de
bactéries di ff érentes est capable d'assimiler complètement une gamme définie de
composés, ou de présenter un métabolisme juste partiel [8] . Par conséquent,
l'utilisation de cultures pures de micro-organismes, spécialement adaptées pour
métaboliser le contaminant, est envisagée comme une alternative intéressante.
Rhodococcus erythropolis est un micro-organisme bien connu contenant un
grand nombre d'enzymes qui permet d'effectuer un nombre énorme de
bioconversion et de dégradation [9,10] .
La faisabilité et les performances des bactéries immobilisées récemment
développées sur un support inerte pour la biodégradation des composés
récalcitrants ont suscité un intérêt considérable et croissant, car cette stratégie
permet d'obtenir beaucoup plus de bénéfices de ce processus. Les principaux
avantages de l'utilisation de cellules immobilisées par rapport aux cellules en
suspension comprennent la rétention dans le réacteur d'une concentration plus
élevée de micro-organismes, une élimination facile des bactéries après utilisation
du mélange réactionnel, fournissant

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doi: 10.1016 / j.nimb.2007.09.005
 A. Djefal-Kerrar et al. / Nucl. Instr. et Meth. dans Phys. Res. B 265 (2007) 370–374
la capacité de contrôler le temps de réaction, la réutilisation des cellules pour de
nombreux cycles de réaction, la réduction du coût de production total des réactions à
médiation cellulaire, fournissent des produits purs
[11-13] .
Les cellules microbiennes peuvent être immobilisées sur diverses matrices de
piégeage polymériques. Les matériaux et les techniques de préparation les plus
prometteurs à cet effet sont respectivement les hydrogels et la réticulation par
rayonnement [11,14] . Parmi les polymères hydrophiles,
poly (vinylpyrrolidone) PVP,
le poly (alcool vinylique) PVA, le poly (hydroxyéthylmétacrylate) PHEMA, le poly
(oxyde d'éthylène) PEO et autres, sont les plus souvent utilisés pour la
synthèse d'hydrogel [15] . Dans ce travail, le PVP a été utilisé pour la
préparation de la matrice d'immobilisation.
Les objectifs de l'étude sont, d'une part, d'étudier l'immobilisation de R.
erythropolis B4 souche pure sur la matrice PVP réticulée par rayonnement
gamma, et d'autre part, pour évaluer la capacité des cellules immobilisées à
dégrader les HAP, comme le naphtalène et l'anthracène.
2. Matériels et méthodes
2.1. Produits chimiques
L'anthracène et le naphtalène ont été obtenus auprès de SigmaAldrich. La
poly (vinylpyrrolidone) K90 avec un poids moléculaire moyen de 360 ​000 Da a
été achetée auprès de Fluka-Chemica. Les solvants étaient de qualité
analytique.
2.2. Microorganismes
R. erythropolis B4 souche a été obtenue à partir de la collection du laboratoire
de microbiologie, Université des sciences et technologies d'Alger. Il a été maintenu
sur des géloses nutritives (Difco) inclinées à 4 C.
2.3. Conditions de culture
Tout d'abord, les cellules bactériennes ont été réactivées dans du bouillon
Tryptic Soy à 30 Pour leur adaptation à l'HTAP, les cellules ont été pré-cultivées
dans un milieu de sels minéraux (MSM) enrichi en vitamines contenant par litre
d'eau distillée: Na 2 HPO 4,
4,5 g; NH 4 NON 3, 1 g; KH 2 PO 4, 0,68 g; MgSO 4 7H 2 O, 0,1 g; Fe 2 DONC 4 7H 2 O,
0,001 g, oligo-éléments et solution de vitamines
[16] et deux di ff érentes sources de carbone: le glucose et le naphtalène (1/3: 2/3)
ou le glucose et l'anthracène (1/3: 2/3).
Après une incubation d'environ 72 h à 30 C dans un incubateur à secoueur
orbital à 120 tr / min, les cellules ont été récoltées par centrifugation (3000 tr / min,
20 min) puis remises en suspension dans de l'eau distillée.
2.4. Préparation et caractérisation d'hydrogel
L'hydrogel polymère a été synthétisé par réticulation et stérilisation induites
par rayonnement gamma, selon la méthode décrite précédemment [17] .
371
La poly (vinylpyrrolidone) (PVP) à une concentration de 7% p / v a été dissoute
dans de l'eau distillée à 70 ° C pendant une nuit et versée dans des seringues en
plastique, scellées avec du film puis irradiées par c rayons à une dose de 25 kGy.
La fraction de gel a été déterminée selon la formule: Gf ¼ W dg = W ip 100%;
ré 1 Þ
où W dg est le poids du gel sec et W ip est le poids initial du polymère. Le rapport
de gonflement à l'équilibre de l'hydrogel PVP dans l'eau a été mesuré par
gravimétrie comme le rapport du poids de gel gonflé à l'équilibre à celui du gel
sec.
Les gels réticulés ont été coupés en disques d'environ 0,5 cm d'épaisseur et 1,2
cm de diamètre et maintenus dans des conditions stériles jusqu'à leur utilisation pour
l'immobilisation cellulaire.
2.5. Immobilisation des cellules
Des disques d'hydrogel ont été déposés dans 50 ml de MSM stérile supplémenté
en vitamines, puis dans 2 ml de la cellule de suspension contenant 10 8 Des CFU
(Colony Forming Unit) / ml ont été ajoutés. Afin de permettre un contact complet des
disques d'hydrogel avec les cellules en suspension sans coller les uns aux autres, un
maximum de 30 disques a été utilisé.
Le mélange a été incubé à 30 ° C sous agitation. Après 24 h, les disques
ont été retirés du milieu de culture, puis lavés avec de l'eau distillée pour
éliminer les cellules non adhérentes.
Les cellules immobilisées sont prêtes à être testées pour leur capacité de
dégradation des HAP.
2.6. La microscopie électronique à balayage
R. erythropolis B4 des cellules immobilisées sur une matrice d'hydrogel de
poly (vinylpyrrolidone) réticulée et stérilisée par rayonnement ont été fixées
avec du glutaraldéhyde à 2,5% (v / v) dans une solution saline pendant 1 h,
rincées à l'eau puis déshydratées par immersion séquentielle en augmentant la
concentration d'éthanol (10%, 50 %, 80%, 100%) pendant 10 min chacun.
Ensuite, les échantillons ont été lyophilisés puis recouverts d'or pour être
finalement observés avec un microscope électronique à balayage JEOL JSM
6360 LV à une tension d'accélération de 10 kV.
2.7. Test de biodégradation
La capacité des cellules bactériennes à dégrader les HAP a été testée en
inoculant 200 ml de MSM contenant de l'anthracène ou du naphtalène comme
unique source de carbone dans N, N-
le diméthylformamide et l'éthanol, respectivement, avec soit 2 ml de la
suspension cellulaire libre, soit 30 disques d'hydrogel contenant des cellules fi
xes. Les concentrations de HAP étaient de 0,7 et 1 g / l pour l'anthracène et de 1
et 1,5 g / l pour le naphtalène
[18-22] . L'incubation a été effectuée à 30 ° C sous agitation continue.
Périodiquement, des échantillons ont été prélevés de manière aseptique sur le flacon de
culture pour analyse HPLC.
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2.8. Réutilisation des cellules immobilisées
Après le premier test, les disques contenant des bactéries immobilisées ont été
lyophilisés et stockés à température ambiante. Après 15 jours de stockage, les disques
ont été réutilisés pour tester la capacité de dégradation des HAP des cellules
immobilisées, dans les mêmes conditions que dans le premier test.
2.9. Analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
L'identification et la quantification du naphtalène et de l'anthracène restants
dans les milieux de culture ont été effectuées par HPLC (Waters 2487) avec
détection UV à une longueur d'onde de 254 nm. Les HAP restants ont été
extraits de la sonde de culture après centrifugation (3000 tr / min, 20 min), avec
un volume pondéré égal de cyclohexane pendant 2 h à 160 tr / min. Une
aliquote (20 l l) a été analysé à l'aide d'une colonne thermo hypersil BDS-C18
(375 · 125 mm) et débit d'élution 1,5 ml / min (eau / acétonitrile: 25/75 v / v).
3. Résultats et discussion
3.1. Caractérisation de la matrice PVP
Le PVP est soluble dans l'eau, une fois réticulé par irradiation, il acquiert un
réseau
372
tridimensionnel permanent de chaînes polymères, ce qui le rend
insoluble en gel. Les valeurs mesurées de la fraction de gel et du taux de
gonflement à l'équilibre de l'hydrogel étaient respectivement de 86% et 2293%.
Ces résultats
Fig. 1. Microphotographies SEM d'une matrice de poly (vinylpyrrolidone) réticulée par rayonnement avant l'inoculation (A), après 5 jours de R. erythropolis croissance en naphtalène (B, C) et en anthracène (D).
signifient que la dose d'irradiation délivrée pour stériliser l'hydrogel, a en même
temps produit un degré élevé de réticulation, ce qui en rend 86% insoluble
dans l'eau. La propriété de gonflement de l'hydrogel assurera un contact
maximal des bactéries fi xes avec les HAP contenus dans l'eau.
3.2. Immobilisation cellulaire sur matrice PVP
Comme le montrent les microphotographies SEM, la surface de la matrice
d'hydrogel non exposée à une suspension bactérienne ( Fig. 1 (A)) était recouverte
de cellules rhodococciques après son immersion dans la suspension bactérienne ( Fig.
1 (B)). Image SEM à fort grossissement ( Fig. 1 (C)) a révélé la croissance de
bactéries de forme ovale, en présence de naphtalène, envahissant uniformément
toute la surface de l'hydrogel. L'adhésion et la croissance bactériennes ont
également été mises en évidence, en présence d'anthracène, sur la surface de
l'hydrogel en formant des tas de cellules ( Fig. 1 (RÉ)). La matrice d'hydrogel PVP a
une capacité d'adsorption élevée [23] . Le taux d'immobilisation calculé comme le
rapport du nombre total de cellules immobilisées à la surface totale des disques
d'hydrogel était de 1,6 · dix 5 cellule / mm 2.
3.3. Application à la biodégradation des HAP
3.3.1. Dégradation des HAP par les cellules libres
La souche R. erythropolis B4 pousse avec du naphtalène ou de l'anthracène
comme seule source de carbone et d'énergie. La capacité de dégrader le
naphtalène et l'anthracène par les bactéries libres en suspension a été observée
comme le montre Figues. 2 et 3 . La dégradation maximale du naphtalène (99,46%)
a été atteinte
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après un temps d'incubation de 5 jours avec une concentration en naphtalène de 1

g / l, alors qu'il était de 82,02% avec une concentration en naphtalène de 1,5 g / l.

La dégradation maximale de l'anthracène (87%) a été atteinte après une

80100
incubation de 11 jours avec une concentration en anthracène de 0,7 g / l alors
qu'elle était de 69% avec une concentration en anthracène de 1 g / l. La capacité
Dégradation du naphtalène (%)

60 1g/l de dégradation des souches semble être plus e ffi cace sur le naphtalène que sur
1,5 g / l l'anthracène. Pour les deux hydrocarbures, l'efficacité de dégradation dépend de
la concentration. Plus la concentration de HAP est faible, plus le taux de
40
dégradation est élevé.

20

3.3.2. Dégradation des HAP par R. erythropolis B4 immobilisée

Grâce à nos résultats, nous avons mis en évidence que R.
0
érythropole B4 a été fixé sur la matrice PVP. Cela a été vérifié par sa
croissance positive suite à de nombreux rinçages de la matrice. La
0 2 4 6 8 dix 12
bioadhésion à la matrice a été réalisée et les bactéries fixées sur le support
Temps (jours)
sont restées bien actives. La matrice n'affecte pas l'activité microbienne,
Fig. 2. Dégradation du naphtalène par libre Rhodococcus erythropolis B4. aucune perte d'activité n'a été observée et les bactéries ainsi fixées ont pu se
réactiver même après une période de stockage [24] . De plus, l'hydrogel PVP
semble être biocompatible avec les systèmes biologiques [23] .

Nous avons observé une grande capacité de la souche immobilisée réutilisée à

dégrader les HAP. Les taux de dégradation en fonction de la concentration en HAP
80100 et du temps de culture sont donnés en Tableaux 1 et 2 .

Nous pouvons remarquer des résultats de la Tableaux 1 et 2 ,

Dégradation de l'anthracène (%)

60
que les cellules immobilisées réutilisées ont une meilleure capacité à dégrader
les HAP. Le taux de dégradation obtenu avec des cellules réutilisées après 2
40 jours est supérieur à celui obtenu même après 10 jours lors de la première
utilisation. Cela a été rapporté par plusieurs études [25-27] . Cela était
0,7 g / l 1
probablement dû à la disponibilité accrue des substrats pour les cellules et à
g/l
20
une meilleure interaction entre les substrats et les cellules immobilisées [26,28] .
L'acclimatation et la prolifération prolongées au détriment des produits
chimiques préoccupants, améliorent également l'activité dégradante des
0
micro-organismes envers les contaminants [27] .

0 2 4 6 8 dix 12

Temps (jours)
La dégradation maximale est observée à la concentration la plus faible
Fig. 3. Dégradation de l'anthracène par libre Rhodococcus erythropolis B4. pour les deux HAP.

Tableau 1

Taux de dégradation du naphtalène (%) par immobilisation R. erythropolis B4

Naphtalène 0,1% Naphtalène 0,15%

Cellules fixes (5 jours) Cellules fixes (10 jours) Cellules fixes réutilisées (2 jours) Cellules fixes (5 jours) Cellules fixes (10 jours) Cellules fixes réutilisées (2 jours)

58,67 70,97 82,23 42,97 53,4 67,23

Tableau 2

Taux de dégradation de l'anthracène (%) par immobilisé R. erythropolis B4

Anthracène 0,07% Anthracène 0,1%

Cellules fixes (5 jours) Cellules fixes (10 jours) Cellules fixes réutilisées (2 jours) Cellules fixes (5 jours) Cellules fixes (10 jours) Cellules fixes réutilisées (2 jours)

54,67 76,65 84,77 38,43 69,7 77,72

374 A. Djefal-Kerrar et al. / Nucl. Instr. et Meth. dans Phys. Res. B 265 (2007) 370–374
Une enquête plus approfondie est nécessaire pour évaluer la performance de
dégradation des cellules immobilisées pour une utilisation répétée plusieurs fois dans un
système de bioréacteur.
4. Conclusion
Dans ce travail, l'utilisation d'une souche pure de R. erythropolis B4
immobilisé sur une matrice PVP réticulée par un rayonnement gamma a été
étudié pour une application à la dégradation des hydrocarbures aromatiques
polycycliques tels que le naphtalène et l'anthracène. Les cellules ont été
immobilisées avec succès sur les disques d'hydrogel, ce qui semble ne pas
affecter l'activité microbienne. La souche immobilisée provoque des taux de
dégradation élevés du naphtalène et de l'anthracène. Les taux de dégradation
plus élevés obtenus avec des bactéries fi xes réutilisées reflètent la capacité de
la matrice PVP à retenir les cellules immobilisées et à former un système stable
qui peut être utilisé pour plusieurs processus de dégradation.
Remerciements
Les auteurs remercient Mme Belaroussi du Centre de développement des
technologies avancées, Algérie, pour son aimable assistance dans la prise de
microphotographies SEM.
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