Ministre de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Badji Mokhtar – Annaba

Université Badji – Mokhtar
University
Annaba

Faculté des Sciences

Département de Biochimie

Biochimie Appliquée

BIOTECHNOLOGIE ENZYMATIQUE
Présenté par le professeur: Ali LADJAMA

Année Universitaire : 2020/21

Professeur A. Ladjama
Email : ladjama_a@yahoo.fr
Matière : Biotechnologie enzymatique (Master 1 Biochimie :coefficient 3)
Sommaire
Chapitre 1: Enzymologie
Introduction
Rappel enzymologie
1.Les enzymes : Structure, origine , site actif
2.Relation structure- fonction
1.2. Propriétés des enzymes
1.2.1. Efficacité
1. 2.3.Spécificité
1.2.4. Réversibilité
1.3. Conditions de fonctionnement des enzymes
1.4. Unité d’activité des enzymes
1.5. Classification des enzymes
2. Marché mondial des enzymes
Chapitre 2 : Immobilisation des enzymes
3. Immobilisation des enzymes
3.1. Objectifs
3.2. Méthodes d’immobilisation des enzymes
3.3. Propriétés des enzymes immobilisés
Chapitre 3. : Biotechnologie enzymatique
1. Définition 
3. Biotechnologie blanche et biotechnologie moderne
3.1.Biotechnologie blanche
3.2.Biotechnologie moderne
3.3.Place de la bioinformatique dans la biotechnologie
Chapitre IV : Les grandes applications de la biotechnologie enzymatique
1. Bioréacteurs
2. Biocapteurs
3. Domaines d’applications
1. Agro-alimentaire
2. Environnement
3. Santé
Chapitre 1: Généralités Enzymologie
Introduction
Les enzymes savent compenser leur manque de généricité par leur extraordinaire
sélectivité, voir énantiosélectivité et régiosélectivité, qui en font des outils de choix pour
réaliser des réactions de synthèse dans des conditions particulièrement compatibles avec la
préservation de l'environnement (milieux aqueux, pH non extrêmes, températures peu
élevées). L'utilisation de plus en plus de matières premières renouvelables, donc d'origine
biologique, pour favoriser des conditions de développement durable ne pourra qu'accroître
les exemples de mise en œuvre de biocatalyseurs. De plus, les outils de la biologie
moléculaire (PCR, Séquençage, mutation, clonage) combinés à ceux de la biologie
structurale et de la modélisation « in silico » ainsi que la bioinformatique, permettent
aujourd'hui non seulement de diversifier les sources de nouvelles enzymes et d'en améliorer
extraordinairement l'efficacité et la stabilité, mais également de concevoir des
biocatalyseurs totalement originaux, capables de réaliser de nouvelles réactions en
continue.
1. Rappel enzymologie
1.1. Les enzymes : Structure, site actif ,origine et fonction
-Structures fonctionnelles des enzymes (protéines de catalyse biologique)
La structure primaire : est l’assemblage d’acides aminés ( au niveau du ribosomes) effectué par le
processus transcription (ADN) et traduction selon le code génétique qui aboutit à une séquence bien
définie. Par la suite il y a des Modifications post-traductionnelles. Les modifications post-
traductionnelles conduisant aux associations de sous-unités et la mise en place de structures tertiair
ou quaternaires, formation de complexes avec des glucides et des acides nucléiques, glycosylation
phosphorylation, dégradation sélective.
Code génétique :
Si on prend un exemple, la séquence "ACC GCA AGC ATG AAT TTT TAC CTT" d'ADN (brin
transcrit complémentaire) donne la séquence "UGG CGU GUC UAC UUA AAA AUG GAA"
d'ARN, qui donne elle-même la séquence " Trp Arg Ser Tyr Leu Lys Met Glu"
La structure secondaire cette structure se fait essentiellement par les liaisons hydrogènes .Il y a ,
structure en hélices et structure betta.
La structure tertiaire : (ou tridimensionnelle ou conformation) correspondant au repliement de la
protéine enzymatique est une structure primordiale nécessaire dans la catalyse. Fait intervenir diver
liaisons chimique (fig. 1). Elle permet la formation du site actif par rapprochement des acides amin
constituant dans l’espace. Cette conformation joue, également un rôle dans la protection du site act
La diffraction aux rayons X a montré que l'organisation tridimensionnelle du site actif des enzymes
n'est pas tout à fait la même suivant l'absence ou la présence du substrat. Ainsi, était née la théorie d
de 'Conformation induite' (induced fit) où le site actif est perçu comme un 'ensemble souple' en
s'adaptant exactement à la conformation du substrat. L'une des preuves expérimentales appuyant ce
théorie réside dans les changements de spectres d'absorption et de fluorescence de certaines enzyme
présence ou en absence des substrats.
Fig(1) :liaisons chimiques
Fig:2: This diagram shows another enzyme with its 5 disuphide bridges in yellow and
regions of α –helix in blue and betta (green). The active site is near the region of the
arrows
La structure quaternaire : correspond à l'association de l'enzyme en sous unités . Elle
donne les derniers ajustements conformationnels. Cette structure conduit à la notion d'
iso-enzymes (isozymes) qui sont des formes de la même enzyme catalysant la même
réaction, mais dont certaines propriétés physico-chimiques (charge électrique, taille,…)
sont différentes et c’est le cas de la lacticodéshydrogénase . (LDH) du muscle
-Site actif des enzymes (protéines de catalyse biologique)
la catalyse enzymatique passe par la formation du site catalytique. Le site actif des enzym
est une région privilégiée de l'enzyme qui interagit avec les substrats. Le site actif des
enzymes est constitué d'acides aminés (AA) de 4 types: 1/ AA 'de contact', 2/ AA
'auxiliaires', 3/ AA 'collaborateurs' et 4/ AA 'non collaborateurs'.

Fig (3) : Site actif

Ce sont les groupements fonctionnelles des radicaux (R) des AA du site actif des enzym
qui interviennent dans la catalyse. Ces groupements sont peu nombreux. Il s'agit le plus
souvent des résidus SERYL, ASPARTYL ou GLUTAMYL, CYSTEYL, HISTIDYL
LYSYL et accessoirement ARGINYL et TYROSYL
La capacité des AA du site actif des enzymes à participer à la catalyse est liée à leur
aptitude à transférer des électrons (caractère d'agents nucléophiles) et des protons
(caractère acide-base selon Broensted). Le caractère de nucléophilie est plus prononcé
pour la sérine, la cystéine et l'acide aspartique. Le caractère acide-base est plus
prononcé pour l'histidine et la tyrosine. L'histdine intervient comme relais de proton
où le noyau imidazole joue le rôle de 'renforceur' du caractère de nucléophilie des
donneurs d'électrons (substrats) en captant le proton de leur OH.
Ce sont finalement que quelques acides aminés de l'enzyme (AA de contact) qui sont
nécessaires pour la catalyse. L'élimination de certains acides aminés n'entraîne pas la
disparition de l'activité enzymatique

Fig (4) :Modèle
Quelques exemples
•Site de fixation : Cas de la Ribonucléase ( fig4)
•Site catalytique : Cas de la chymotrypsine ( protéase à serine) ou triade
catalytique (fig 5 et fig6).
Etude structurale de la chymotrypsine en relation avec sa fonction

Fig (5) :La chymotrypsine active comprend 3 chaînes reliées par des ponts
disulfures (non représentés ici). Deux des acides aminés de la triade catalytique
Asp 102 et His 57 appartiennent à la chaîne B ( bleu) alors que Ser 195 fait
partie de la chaîne C (vert) ainsi d'ailleurs que tous les résidus dont les chaînes
latérales bordent la poche dans laquelle vient se placer ici le substrat.
Quelques données concernant la chymotrypsine.
-Un résidu sérine impliqué dans le mécanisme catalytique
-Une triade catalytique
L'étude en 3D de la structure de la molécule de chymotrypsine complexée à
différents analogues du substrat (en réalité des inhibiteurs ) à permis de mieux
comprendre la réactivité inhabituelle du OH du résidu Ser 195. Les modèles
montrent ( fig 5 et fig 6) bien la présence dans le site catalytique, près de
l'analogue du substrat, de Ser 195 mais aussi de His 57 et de Asp 102, 3 résidus
qui peuvent interagir. Ils établissent entre eux des liaisons hydrogène (comme
le montre l'image figure 5), ce qui entraîne notamment une polarisation plus
marquée de la liaison entre les atomes O et H du groupement hydroxyle de Ser
195. Ainsi le proton, moins retenu par la Ser 195 (plus acide), est plus mobile et
sera facilement cédé à His 57. L'intervention de Ser 195 est conditionnée par la
présence des 2 autres résidus ( Asp et His).
-Une poche essentiellement hydrophobe dans le site actif
Les études tridimensionnelles montrent également la présence dans le site actif de
la chymotrypsine d'une poche en grande partie hydrophobe, près de la triade. Dans
cette cavité, peut venir se loger un résidu acide aminé ayant lui-même une chaîne
latérale hydrophobe "volumineuse", aromatique comme Phe , Trp et Tyr ou non
comme Met.
En place dans la poche, le résidu est orienté de manière à placer la liaison
peptidique qui sera clivée, au voisinage de la Ser 195 très réactive. Ce
positionnement conditionne l'intervention de la triade catalytique.
Voir modèle 3D avec triade et poche (figure 5 et figure 6)
Réactions mises en jeux :

Étape 1

Attaque nucléophile
Etape 2
Étape3
Notion de domaine : C’est une zone globulaire compacte d’une protéine. Beaucoup de
protéines se replient en plusieurs domaines ayant des masses de 10 KD à 20KD .Les
domaines sont reliées par les polypeptides qui donnent une certaine flexibilité de la
protéine dans l’espace. Ainsi , on peut avoir un domaine catalytique et un domaine de
régulation .Le domaine N-terminal porte deux des trois acides aminés
catalytiques : l'histidine 57 (H57) et l'aspartate 102 (D102) ; le domaine C-
terminal porte la sérine 195 (S195).

Exemple : Cas de la chymotrypsine

La chymotrypsine (protéase à sérine) est constituée de trois segments d'une même
chaîne polypeptidique originelle reliés par des ponts disulfure.

Lorsqu'elle se replie, la chymotrypsine adopte une conformation qui correspond à

deux domaines structuraux.(Fig 6 et Fig 7)

Le domaine N-terminal porte deux des trois acides aminés catalytiques :

 l'histidine 57 (H57) et l'aspartate 102 (D102) ;
le domaine C-terminal porte la sérine 195 (S195).
Fig 7 : Domaines de la chymotrypsine ( protéase à serine)
1 .2.Relation structure - Fonction
-L'enchaînement linéaire des acides aminés est déterminé par le génome (transcription
traduction et post-traduction).
-La structure secondo-tertiaire est conditionnée par la structure primaire.
-La structure spatiale d'une molécule enzymatique conditionne son activité (repliement
donne l’état natif de l’enzyme)
-Toute modification de la composition en acides aminés entraîne un changement de la
conformation spatiale et donc une perte de l'activité enzymatique (cas des mutations)
-Toute modification des liaisons chimiques (ponts disulfures, liaisons hydrogènes).
qui interviennent dans la structure spatiale entraîne une perte de l'activité enzymatique
Exemple  la ribonucléase A, (fig 11) avec une structure tertiaire stabilisée, notamment,
par 4 ponts disulfures entre les cystéines 65-72, 26-84, 40-95 et 58-110. La rupture de
ces ponts disulfures par le β-mercaptoéthanol et la rupture des liaisons hydrogènes
intramoléculaires par l'urée entraînent la perte de l'activité enzymatique
Illustration: on a deux modèles moléculaires
-Enzymes ayant la même activité mais prélevées dans des organismes appartenant à des
espèces différentes (lysozyme humain et de poulet) Fig 8
Constatation: la similitude (ancêtre le même) de la configuration spatiale des enzymes
appartenant à des espèces différentes mais ayant la même activité( Fig 8)
-les différences de configuration entre deux enzymes ayant des activités différentes la
complémentarité spatiale entre le substrat et une partie de la molécule enzymatique
Fig (8) : Lysozyme
Mutation : Exemple : Cas du lysozyme humain
Séquence des acides aminés, structure et activité enzymatique : Comparaison des
deux molécules de lysozyme humain, l'une à activité normale, l'autre ayant une faible
activité catalytique même dans des conditions de température et de pH favorables.
La visionneuse Molusc permet de comparer les séquences en acides aminés des deux
molécules et de mettre en évidence une différence au niveau du 115ème acide aminé.
Une mutation dans le gène codant la synthèse du lysozyme est donc à l'origine de la
faible activité constatée.
La position de cet acide aminé dans la structure moléculaire est ensuite
recherchée.Fig(9) 
On constate alors qu'il se situe en bordure du site actif. L'hypothèse peut être
émise que cette mutation, en modifiant la séquence des acides aminés, a
provoqué un changement dans la forme du site actif.
Le site actif fendu de la molécule du type muté est plus étroit que la fissure du
type sauvage. Ce changement structurel est considéré responsable de la basse
activité catalytique de l’enzyme. Le remplacement d'Arg115 par Glu change la
distribution de charge dans la molécule, et le changement des charges
électrostatiques peut affecter des interactions polaires parmi les résidus

Fig (10): une hypothèse pour expliquer la perte d’activité du lysozyme muté.

Autres exemples :
La ribonucléase (RNase H) catalyse l’hydrolyse du brin d’ARN dans les hybrides
ARN-ADN. On se propose ici d’étudier la stabilité comparée de la protéine mésophile
présente chez la bactérie Escherichia coli et de son homologue thermophile trouvé chez
la bactérie Thermus thermophilus dont la température optimale de croissance est de
68,5°C. La RNase H est une petite protéine ( 160 résidus) formant un seul domaine
structural. Les deux formes étudiées ici montrent 52% d’acides aminés identiques aux
mêmes positions dans la séquence et leurs structures 3-D sont très ressemblantes
(Figure 11), les proportions respectives d’acides aminés polaires et apolaires étant
pratiquement identiques.

Figure (11) - Stabilités comparées des deux protéines

Afin de comparer leurs stabilités, les deux protéines sont étudiées par dichroïsme
circulaire, en présence de différentes concentrations d’un agent dénaturant (Gdn.HCl 0
à 5M) et à différentes températures (5 à 60°C). Pour chaque concentration de Gdn.HCl
et chaque température, l’ellipticité à 222 nm est mesurée.
1.2. Propriétés des enzymes.
1.2.1. Les propriétés liées à la nature protéique des enzymes.
Les enzymes sont constituées d’une ou plusieurs chaînes d’acides aminés dont les
acides aminés hydrophiles sont en surface les acides aminés hydrophobes à l’intérieur
de la molécule.
Les enzymes sont des protéines globulaires et comme n’importe quelle protéine, les
enzymes sont dénaturables par chauffage ( non réversible) et par l’action d’un acide ou
d’une base ou d’un sel ( réversible).On peut également doser ces protéines par
méthode colorimétrique (ex : méthode de Folin-Lowry qui colore les liaisons
peptidiques ou méthode de Buiret spécifique aux liaisons peptidiques ou méthode de
BRADFORD avec échange électronique ). D’autres méthodes de dosage ( absorption
en UV 280 ) spectrophotométriques sont utilisées car certains acide aminés (Phe, Tyr)
ont un structure chimique ( noyau cyclique) qui absorbe dans l’ultrat-violet à 280 nm
( propriété physique).
-Purification des enzymes: L’étude des propriétés de l’enzyme se font sur une
enzyme pure. La purification utilise divers techniques ( précipitations par les sels,
ultracentrifugation, chromatographies et électrophorèses ) ( fig 12, fig 13)
 
 
 
 
Efficacité

Selon la réaction , 1 molécule de catalase transforme 5,6.106 molécules d’H2O2 en 1

min à pH 6,5 et à 30°C.
Efficacité d’une enzyme est évaluée grâce à son activité catalytique molaire : c’est le
nombre de mol de substrat transformé par unité de temps et par mol d’enzyme.
La vitesse d’une réaction peut être accélérée par une enzyme de 10 8 à 1010 fois. Voir
TD
Spécificité :
•Spécificité de la réaction catalysée : il existe des enzymes capables de catalyser un
groupe de réactions. Exemple : les décarboxylases catalysent la « scission » d’un
groupement acide carboxylique d’une molécule.
•Spécificité de substrat : elle peut être étroite (ex : l’uréase) comme absolue (ex : les
phosphatases).
.Spécificité de groupe et spécificité de liaison: reconnaît des groupements ou
liaison.
. Stéréospécificité. la fumarase n’agit que sur la forme trans du fumarate et ne forme
que du L-malate.
Cette stéréospécificité fait naître l’hypothèse d’un complexe enzyme-substrat
intermédiaire avec une complémentarité de structure entre le substrat et le site actif de
l’enzyme.
 
Réversibilité
 Si la réaction est réversible , l’enzyme peut catalyser la réaction dans les 2 sens mais
ne modifie pas les conditions de la réaction. Par conséquent, elle ne catalyse
spontanément que les réactions exergoniques.
Elle ne peut catalyser une réaction endergonique que si celle-ci est couplée à un
réaction largement exergonique.
 Ex : Glucose 6P → glucose + phosphate inorganique ΔG0 = -12.5 kJ/mol
Cette réaction est fortement exergonique (Sens 1)donc la réaction inverse est
spontanément impossible.
On peut donc faire un couplage avec l’hydrolyse d’une molécule d’ATP (ΔG0 = -
29kJ/mol)
1.3. Conditions de fonctionnement des enzymes
•pH :

Il existe une valeur critique du pH appelé « pH d’arrêt » au-delà de laquelle l’enzyme
subit une dénaturation irréversible.

•Température
Tc est la température critique : si T > Tc il y a plus de dénaturation que d’activation
Stabilité: On peut aussi étudier la (Demie vie) de l’enzyme , c'est-à-dire le temps en
heure que mettra une enzyme pour perdre son activité de 50 % à une température
élevée. C’est un critère de choix pour son utilisation dans le domaine industriel où on
exige des températures élevées. Egalement, il y aussi la stabilité par rapport au pH
ou par rapport à l’addition d’une autre molécule .
Effecteurs enzymatiques
En la présence d’un effecteur, on peut rencontrer 2 cas :
•la vitesse de la réaction diminue : l’effecteur est un « inhibiteur »
•la vitesse de la réaction augmente : l’effecteur est un « activateur ».
Unités d'activités enzymatiques (voir TD)
Unité officielle: katal (kat), quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole
de substrat par seconde. Le katal n'est jamais utilisé, car beaucoup trop grand. On doit
utiliser des sous-unités comme les µkat (10-6 katal), nkat (10-9 katal) ou pkat (10-12
katal).
La plupart des biochimistes préfèrent l' "unité internationale" (IU, International Unit),
qui est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par
minute.
En pratique le calcul de l’activité enzymatique se fait en vitesse initiale et par le dosage
du produit de la réaction enzymatique
Vitesse initiale de la réaction: Vi = d[P]/dt = k2·[ ES ]
Activité moléculaire : On peut aussi calculer l'activité molaire, le nombre de moles de
substrat transformé par mole d'enzyme par minute (kcat x 60).
Activité spécifique : On peut aussi calculer l’activité spécifique est égale : UI / mg de
protéines. Cette unité est utilisée dans la purification des protéines par chromatographie
ou électrophorèse
Si on calcule l'activité spécifique sur un extrait non-purifié ( mélange de protéines), elle
indique la pureté d'une enzyme.
Remarque : Pour étudier les propriétés physico-chimiques ( masse molaire ,
Km,Vmax , inhibiteurs, structure à 3D, pHi et autres paramètres) de l’enzyme, on doit
purifier l’enzyme ciblée ( ex : Glucose isomérase) . La purification des enzymes utilise
l’activité spécifique (AS) comme indice et cela pour suivre le taux de pureté de
l’enzyme recherchée.
1.5. Classification des enzymes.

→ Le nom commun : on ajoute au substrat ou à la réaction le suffixe –ase (ex : uréase,

carboxylase)
→ Nomenclature officielle : Elle date de 1942 par l’unité internationale de biochimie
( UIB)
On désigne l’enzyme de la manière suivante : EC (pour enzyme commission) + 4
chiffres.
Le 1er chiffre désigne la classe de l’enzyme (réaction catalysée).
Le 2° chiffre désigne la sous classe , 3ième chiffre accepteur , 4ième ordre de découverte
Exemple:
la glucokinase est désignée par (EC 2.7.1.2. ) il ya 4 chiffres
2 = transférase
7 = transfert d’un groupement phosphate
1 = le groupement accepteur est un groupement alcool
2= désigne l’ordre de découverte de l’enzyme.
On peut également appeler cette enzyme « ATP D-glucopyranose-6-phosphotransférase
Selon l’ UIB il y a , il ya 6 classes : 1 .Oxydo-réductase,
2.tranaférases,3.Hydrolases,4.lyases, 5.Isomérases, 6.Ligases (Voir tableau)
1. OXYDO-RÉDUCTASES 3. HYDROLASES
1.1. Agissant sur les groupes CH—OH 3.1. Agissant sur les liaisons esters
1.2. Agissant sur les groupes aldéhydes et 3.2. Agissant sur les composés glycosylés
cétones 3.3. Agissant sur les liaisons éther-oxydes
1.3. Agissant sur les groupes CH—CH 3.4. Agissant sur les liaisons peptidiques
1.4. Agissant sur les groupes CH—NH2 3.5. Agissant sur les liaisons C—N non peptidiques
1.5. Agissant sur les groupes CH—NH 3.6. Agissant sur les anhydrides d'acides
1.6. Agissant sur le NADH ou NADPH 3.7. Agissant sur les liaisons C—C
1.7. Agissant sur les autres groupes azotés 3.8. Agissant sur les liaisons halogéniques
1.8. Agissant sur les groupes soufrés 3.9. Agissant sur les liaisons N—P
1.9. Agissant sur les groupes hématiniques 3.10. Agissant sur les liaisons S—N
1.10. Agissant sur les diphénols et les substances apparentées 3.11. Agissant sur les liaisons C—P
1.11. Agissant avec H2O2 4. LYASES
1.12. Agissant sur l'hydrogène comme donneur 4.1. C—C Iyases
1.13. Comportant l'incorporation d'oxygène 4.2. C—O Iyases
moléculaire et un donneur unique 4.3. C—S Iyases
1.14. Comportant l'incorporation d'oxygène 4.5. C—halogène Iyases
moléculaire et des donneurs multiples 4.6. P—O Iyases
1.15. Agissant sur les radicaux superoxydes 4.99 Autres Iyases
1.16. Oxydant les ions métalliques 5. ISOMÉRASES
1.17. Agissant sur les groupes CH2 5.1. Racémases et épimérases
1.97. Autres oxydo-réductases 5.2. Cis-trans (Z-E)isomérases
2. TRANSFÉRASES 5.3. Oxydo-réductases intramoléculaires
2.1. Transférant un groupe monocarboné 5.4. Transférases intramoléculaires
2.2. Transférant un résidu aldéhydique ou 5.5. Lyases intramoléculaires
cétonique 5.99. Autres isomérases
2.3. Acyl-transférases 6. LIGASES
2.4. Glycosyl-transférases 6.1. Formant des liaisons C—O
2.5. Transférant des groupes alkyl ou aryl, 6.2. Formant des liaisons C—S
autres que le méthyle 6.3. Formant des liaisons C—N
2.6. Transférant des groupes azotés 6.4. Formant des liaisons C—C
2.7. Transférant des groupes phosphorés 6.5. Formant des liaisons ester—phosphate
2.8. Transférant des groupes soufrés
2. Marché mondial des enzymes (fig 12)
Le marché des enzymes à des fins industriels est difficile dans le sens ou ces enzymes
sont instables et l’activité catalytique est souvent perdue en quelques heures. Ces
enzymes sont en grande majorité produites par les microorganismes qui sont faciles à
isoler et stables d’où leur intérêt d’utilisation en biotechnologie. La plupart des
enzymes industrielles hydrolysent les protéines, les lipides et les sucres. On a les
pourcentages suivants :
Détergents  : 30 % protéases et lipases
Amidonneries: 15 %: avec Amyloglucosidase : 12 % + 4 % alpha amylase + 19 % glucose
isomérase
Industries alimentaires : 5 % de cuisson , 10 % de boisson, 15 % laiterie
Pharmacie: 8 %
Industries du textile  : 10 %

Le secteur des enzymes destinées à la production de bioéthanol, est le secteur qui a eu la

plus forte croissance en 2005 chez Novozymes..
La part de marché estimée de Novozymes est de 50%. Pour atteindre ce niveau, Novozymes
a développé des enzymes innovantes qui permettent de réduire la consommation d'énergie au
cours du procédé de production de bioéthanol tout en augmentant les rendements obtenus.
De plus, les produits développés par les Etats-Unis, étaient destinés à la production
de bioéthanol à partir de maïs transgénique (11 à 13% de la récolte de maïs aux
Etats-Unis est consacrée à la production de bioéthanol). En Europe, le maïs est
une culture en retrait par rapport au blé, à l'orge ou au seigle. Novozymes a donc
développé une gamme d'enzymes adaptée à la production de bioéthanol spécifique
à l'Europe.
Marché des enzymes doublé
Les enzymes industrielles, utilisées depuis 60 ans dans l’alimentaire, les détergents,
textile et etc, représentent un marché mondial d’environ 2,2 milliards d’euros. Un
marché dominé à 70% par Novozymes et son rival danois Danisco.

Si les biocarburants à base de résidus végétaux s’imposent, le marché mondial des

enzymes pourrait doubler d’ici 2020, selon le PDG de Danisco, Tom Knutzen.
en 2030, la production d’éthanol pourrait être 12 fois supérieure à son niveau de
2006 et le marché du bioéthanol atteindre 75 à 140 milliards de dollars dès 2020.
Bioéthanol moins cher que le gazole
En 2010, les enzymes sont commercialement viables et le biocarburant, qui pour
l’instant reste 30% plus cher à produire que le gazole, devrait être 25% moins cher en
2015.
Formulation des enzymes: cela consiste à ajouter un composé ( sucres, glycérol,
protéine ) pour stabiliser l’enzyme pour obtenir: une poudre ou un liquide
concentré.
Chapitre 2: Immobilisation des enzymes et applications
Introduction
 
* Au niveau industriel les enzymes sont couramment utilisées particulièrement en
raison de la spécificité de leur action et des températures relativement économiques
auxquelles elles fonctionnent. Ces raisons en font des catalyseurs très compétitifs face
aux procédés chimiques industriels classiques (polluants) leur utilisation constitue le
génie enzymatique qui est une des branches des biotechnologies. Certaines enzymes
sont utilisées sous forme soluble (catalyse homogène ) et jetées en fin de réaction,
d’autres sont immobilisées sur des supports insolubles (catalyse hétérogène) et
inertes permettant une réutilisation répétée et la mise en œuvre de réacteur en continu
On parle alors d’enzyme immobilisée, confinée ou insolubilisée. La diminution des
coûts des opérations de bio-production qui en résulte est un atout important de la
bioengénierie dans l’industrie agro-alimentaire avec moins d’ apparition de moins co-
produits nocifs

*Stabilité: Les enzymes sont des protéines que la nature a sélectionné au cours de plus
de milliards d’année. Ces enzymes augmentent spécifiquement et de manière
considérable les vitesses des 10000 réactions métaboliques. Par ailleurs, les enzymes
sont peu stables et solubles dans le milieu aqueux. Ainsi, pour être utilisée dans le
domaine de la biotechnologie , ces enzymes doivent être immobilisées artificiellement
ce qui augment leur stabilité et les rapproche au système biologique ( les enzymes sont
fixées sur les organites, mitochondries, membranes et etc..).
En conséquence , ces biocatalyseurs peuvent être utilisées et réutilisées sous forme de
colonne d’enzymes ( bioréacteurs , tel que :bioréacteur à lactase) ou de films fixés à des
capteurs biologiques( électrodes à enzymes : Electrode à oxydases).
L’immobilisation des enzymes est donc d’un intérêt majeur dans plusieurs domaines :
Agro-alimentaire, santé, et environnement.
1. Méthodes d'immobilisation des enzymes
Pourquoi immobiliser des enzymes ? justification
Théorie : En solution les enzymes sont à l’état libre mais dans la cellule , ces enzymes
sont fixées sur des organites ( exemple : enzymes de la chaîne respiratoire sont fixées
sur le crêtes mitochondriales )
Avantages :
-les enzymes sont des molécules chirales comprenant des groupes fonctionnels variés,
donc le site actif peut être chimio, régio et stéréosélectif
-les taux réactionnels atteints sont souvent 10 puissance 10 que les réactions non
catalysées
L’immobilisation des enzymes permet la réalisation de bioréacteurs ( analyse
préparative) et de biocapteurs ( analyse quantitative) très utilisées en agro-alimentaire,
santé et en environnement
Pratique :
- Récupération et réutilisation
-Stabilisation à cause du microenvironnement et liaison avec le support
-parfois on purifie peu l’enzyme
L'objectif d'une immobilisation est donc l'obtention d'un procédé économique,
contrôlable et uniforme. Une telle immobilisation permet une mise en œuvre continue
ou une utilisation répétée. En jouant sur le temps de rétention, sur les conditions
environnementales et sur le type de bioréacteurs, cette technique permet un meilleur
contrôle. Elle permet également de mesurer l'influence du microenvironnement sur
l'activité enzymatique. L'immobilisation peut avoir des effets sur l'activité enzymatique,
( baisse de l’activité) à cause de changements de configuration, de répartition et de
diffusion. Puisque l'immobilisation est coûteuse, seules les enzymes de haute valeur
sont immobilisées
1.2. Différentes méthodes d’immobilisations (fig 13)
Il existe plusieurs techniques d’immobilisation des enzymes et en 1971 la
conférence d’ingénierie Enzymatique de Henniker ( USA) a définit la
classification des enzymes immobilisées basée sur le mode de fixation de
l’enzyme sur le support ( figure13) Immobilised enzyme systems.
Illustration des 4 méthodes d’immobilisation des enzymes
a. Adsorption
b. Liaison covalente et réticulation
c. Piégeages
d. Membrane cellulaire
1.2.1. Fixation par liaison chimique

Adsorption :
Dans cette méthode : L’enzyme est liée à la surface d’un solide par des liaisons de
type des liaisons hydrogènes, des interaction de Van der Waals, liaisons
hydrophobes , et liaisons ioniques ce qui renforce la fixation ( la silice est utilisée
comme support de fixation) De très nombreux supports peuvent être utilisés pour
adsorber des protéines
- Supports minéraux comme les argiles (bentonite, montmorillonite), la silice et le
verre poreux, le charbon actif, l'aluminium ou l'oxyde d'aluminium.
-Supports organiques pouvant être des supports échangeurs d'anions (DEAE-
cellulose, DEAE-Sephadex, amberlite, IRA 93 ...) ou de cations (CM-cellulose,
Dowex 50, amberlite CG-50 ...), ou du collagène. Le choix s'effectue en fonction du
pH optimal de l'enzyme et de son point isoélectrique. Cette liaison est également
dénommée liaison ionique
 Adsorption sur un support (Fig14)

Remarque :
La technique est simple et réversible, mais la fixation n’est pas spécifique et les risques
de désorption sont importants
Liaison covalente :

Dans cette technique la liaison est irréversible et il s’établit une réaction chimique entre
un groupent chimique du support et une fonction chimique de la protéine ( tel que SH,
COOH, NH2 et etc..)
Pour résoudre le problème le plus important de l'immobilisation (c'est-à-dire la
désorption), des recherches ont été effectuées pour développer des méthodes de fixation
des protéines par liaison covalente. Les groupes fonctionnels des acides aminés (aminé
primaire, acide carboxylique, parfois thiol, phénol, hydroxyle) sont chimiquement peu
réactifs et il faut donc souvent introduire sur le support des fonctions activées. Les
méthodes d'activation font appel à des réactifs tels que :le glutaraldéhyde, l'azoture, la
carbodiimide, le bromure de cyanogène, les triazines ou les sels de diazonium. Ces
agents relient les enzymes et le support. La plus utilisée est le bromure de cyanogène
(Fig 15)
Figure(15 et 16) :Méthode d'attachement d'une enzyme à la cellulose par
bromurcyanogène (CNBr)
Les supports utilisés sont les suivants :
 - Supports organiques comme le dextrane, l'agarose, la cellulose et ses dérivés, le
collagène, les polymères acycliques, le polystyrène, les polyamides, le nylon.
- Supports minéraux avec couplage direct comme la silice et le verre poreux, les oxydes
métalliques.
 
Réticulation :
Cette technique utilise un réactif bifonctionnel qui réagit avec les groupements actifs
des enzymes par système de pontage à l’intérieur de la molécule . On obtient des
structures moléculaires de haute masse moléculaire qui deviennent insolubles sans
recours à un support. Parmi les agents bifonctionnels le glutaradéhyde .

1.2.2. Inclusion dans un gel : confinement (fig5)

les enzymes sont retenues dans un réseau tridimensionnel d’un polymère non soluble
dans l’eau ou emprisonnée dans une micro-capsule ( membrane) ou incluse dans un
gel tel le gel de ployacrylamide, (fig 5)
La technique revient à emprisonner l’enzyme dans les mailles du réseau
tridimensionnel
d’une matrice polymérique : gel de polyacrylamide, d’amidon, de gélatine,
d’alginate, …
Le procédé est très simple et universel, mais les risques de fuite ne sont pas
négligeables si les mailles du réseau sont larges.
La cinétique de l’enzyme est compliquée par le
phénomènes de diffusion de substrat et de produit si la réticulation est très serrée. On
peut aussi utiliser des fibres de polymère, des fibres creuses, des membranes de
collagène
1.2.3. Microcapsulation
On forme un polymère autour d’une microgoutte d’émulsion, pour obtenir des
microcapsules semi-perméables .les microcapsules sont en nitrate de cellulose ou en
nylon .
Ces techniques ne sont guère appliquées industriellement, mais pourrait avoir des
applications thérapeutiques (contrôle du taux d'urée, déficience enzymatique), mais ces
types d'applications posent de nombreux problèmes (toxicité, allerginicité, stabilité),
qui sont encore au stade d'études.
Il est également possible d'utiliser des volumes clos plus élevés, en employant des
membranes semi-perméables, présentant des seuils de coupure correspondant à des
masses molaires de 500 à 300 000. Un tel système est particulièrement valable pour
l'hydrolyse des macromolécules. Seuls, les produits hydrolyses peuvent en effet
franchir la membrane et être récupérés dans l'effluent.

1.3. Choix du procédé d'immobilisation

Cinq facteurs au moins sont à prendre en considération dans l’ordre
- Stabilité de l'enzyme immobilisée
- Activité de l'enzyme immobilisée et quantité de substances produites
- Capacité de régénérer l'enzyme
-Coût pour un bioréacteur adéquat.
1.4.Quelques exemples d'enzymes immobilisées
Ce tableau suivant démontre la prédominance des techniques de rétention par
adsorption et liaisons covalentes. En ce qui concerne les applications industrielles, il est
à remarquer que seules des enzymes ne régénérant pas de cofacteurs organiques
(NADP + , ATP) sont utilisées. Le prix de ces cofacteurs est en effet élevé et l'emploi
de cofacteurs utilisés est rendu difficile à cause de leur faible durée de vie .
1.Propriétés des enzymes immobilisées: L’une des voies importante et prometteuse de
la bio-engénierie dans l’industrie agroalimentaire est l’emploi d’enzymes
immobilisées Les caractéristiques cinétiques (Km, Vmax et sensibilité à la température
ou au pH) de l’enzyme son fréquemment modifiées par rapport à celles de l’enzyme
native.
2.1. Stabilité accrue: Les propriétés les plus importantes des enzymes
immobilisées comparés aux enzymes solubles , sont essentiellement
l’augmentation de la stabilité ( stabilité vis-à-vis de la température , vis-à-vis
du pH vis à vis sels, vis-à-vis des solvants organiques). Cette stabilité se traduit
par une conservation qui peut aller jusqu’ à 6 mois 4°C , à une semaine à
quelques mois à 30 °C mais cela varie en fonction de l’enzyme , les conditions
d’immobilisations et les conditions d’utilisation. Cette propriété confère à ces
enzymes leur utilisation en technologie enzymatique ( bioréacteur à lactose).On
peut également fonctionner les réacteurs enzymatiques avec des enzymes
immobilisées 50 °C issues de bactéries thermophiles ( genre Bacillus) . Des
enzymes thermo-résistantes à 70 °C sont aussi utilisées avec succès en
bioréacteur. En effet, la stabilité des enzymes solubles est souvent inférieure à
24h à la température de 30 °C et ne résistent pas à plus de 10 % de méthanol.
Les enzymes immobilisés peuvent aller jusqu’à 40 % de solvant organique ce
qui permet de les utiliser dans le dosage des substrats non solubles dans la
phase aqueuse tel que les stéroïdes en phase organique . Egalement les
enzymes immobilisés résistent aux bactéries, aux autres enzymes
2.2.Constantes cinétiques
2.2.1.Vitesse maximale (Vmax)
Pour la plus part du temps la Vmax diminue soit par la perte ou l’inactivité des
molécules d’enzymes au cours de l’immobilisation soit par la diminution de la vitesse
de diffusion du substrat dans le film ( membrane ).Cela se traduit par :
-Perte d’activité
-Diminution de l’accessibilité du site actif
-Changement de conformation de la protéine
-Changement du microenvironnement , des charges et l’hydrophobicité
-Diminution de l’accessibilité des substrats par les phénomènes de diffusion
2.2.2.Constante de Michaelis (Km)
En fonction des charges du support et du substrat , le Km peut diminuer ou augmenter
l’affinité de l’enzyme.
 2.3.Changement du pH optimum
En fonction des charges du support ( - ou +) les ions H+ sont attirés par le micro-
environnement au tour de l’enzyme. Le pH mesuré est plus élevé en solution ( macro-
environnement) qu’en micro-environnement et la différence peut aller jus qu’à 2 unités
2.4.Augmentation de la résistance vis-à-vis des inactivateurs
Exemple (1) : Les pesticides les plus connus sont les organophosphorés qui sont
anactifs sur l’acetylcholinestérase immobilisée
Exemple (2): Les métaux lourds (Hg, Ag , Pb, Cd Cu, Zn , Fe,) sont inactifs sur les
enzymes immobilisées
Chapitre 3: Biotechnologie enzymatique
1. Définitions

Quelles sont les bases scientifiques de la biotechnologie ? Deux types de

biotechnologies sont à considérer :
La biotechnologie blanche « white biotechnology » et biotechnologie moderne
( moléculaires)

2.La biotechnologie blanche et biotechnologie moderne

a) Les biotechnologies blanches 

s’agit d’utiliser les enzymes dans des domaines variables ( santé, environnement ,
industrie chimique et agro-alimentaire) . C’est donc une valorisation de la matière
première ( les biomasses c'est-à-dire : les débris végétaux , animaux , microorganismes
(fermentations) algues et carapaces des insectes) pour les transformer en produits
(valeur ajoutée) utilisées par l’homme ;
Exemple : la paille peut être transformée en cellulose par la suite en glucose et grâce la
glucose isomérase (GI) on peut avoir le Fructose dont le pouvoir sucrant est de 1,5 par
au glucose de 0,5
Cette technique permet donc de valoriser cette biomasse . Actuellement ces enzymes
sont immobilisées dans des réacteurs et assure en continue la réaction enzymatique.
Les enzymes interviennent dans les bioconversions qui font partie des biotechnologies blanches
(white biotechnology) visant les productions industrielles. Parmi les applications commerciales
des enzymes, on peut citer les productions de lessives (lipases et protéases) et de sirop de
fructose à partir d'amidon provenant du maïs (amylase et glucose isomérase). Egalement
l’extraction des huiles d’olive , clarification des jus de fruits ( pectinases) .Parmi les avantages
des enzymes, les taux réactionnels élevés, une fois comparés à ceux des réactions non catalysées
(les enzymes sont 10 puissance 10 fois plus rapides). Parmi les inconvénients des enzymes, on
note le coût élevé, solubilité limitée dans les solvants, dépendance aux cofacteurs et coenzymes,
spécificité trop élevée et instabilité, l'utilisation des enzymes immobilisées tend à éliminer
certains désavantages d'application.
b)Les biotechnologies modernes ou génie enzymatique : Le génie enzymatique consiste à
substituer aux méthodes classiques de la chimie industrielle des techniques fondées sur
l'utilisation d'enzymes .Les techniques moléculaires (mutation, clonage, PCR , Séquençage et
autres) exploitent les techniques de biologie moléculaires et de génie génétiques pour améliorer
les performances de l’enzyme car à l'état naturel, les enzymes présentes chez les êtres vivants ne
sont pas toujours adaptées aux contraintes d'un processus industriel (lavage à 10° C ou à 70° C,
eau très basique ou très acide, etc). Les gènes d'un organisme contiennent l'information
nécessaire à la synthèse des enzymes par ses cellules. La mutation d'un gène peut aboutir à une
modification de l'activité de l'enzyme correspondante. Exemple: la chymosine de veau (protéase)
EC (3.4.23.4) utilisée dans la coagulation du lait pour fromage. La deuxième possibilité de
produire la chymosine est de recourir aux techniques de la biologie moléculaire et
produire une chymosine recombinante. L'avantage d'un tel système c'est que la
chymosine produite est absolument dépourvue de pepsine et les propriétés
enzymatiques sont exactement les mêmes. On obtient un produit de haute qualité avec
un prix stable ce qui est appréciable en industries alimentaires.
 Exemple : La production de lipase gastrique à partir de maïs transgénique
 

 La lipase gastrique est une protéine utilisée dans le traitement de l’insuffisance pancréatique exocrine. C’est-

à-dire l’impossibilité pour le pancréas de faire passer dans le système digestif les enzymes nécessaires à
l’assimilation des aliments.
 L’absence de lipase gastrique empêche le système digestif de métaboliser les lipides contenus dans la

nourriture. Ce problème affecte principalement les patients atteints de mucoviscidose ou de pathologies du

pancréas.
 La mucoviscidose, avec une fréquence à la naissance de 1/2500, est une maladie héréditaire très fréquente en

Europe. Aujourd’hui, on ne sait pas la guérir. Seuls des traitements précoces et adaptés permettent de ralentir
son évolution.
 La lipase gastrique est indispensable à ces malades. Or, le traitement actuel repose sur l’administration d’un

extrait pancréatique de porc avec des doses pouvant atteindre 20 comprimés par jour. De plus, ce traitement
n’a aucune efficacité pour 15 % des patients.
 Recherches ?????

 Une entreprise française développe actuellement une lipase gastrique produite à partir de maïs transgéniques.

 Le gène humain codant pour cette lipase a d’abord été transféré à des plants de tabac (plante de test), puis de

colza et enfin de maïs. Ces plantes étant adaptées à la production de molécules à rôle pharmaceutique, les
chercheurs sont parvenus à obtenir de la lipase fonctionnelle.
 La lipase gastrique issue du tabac représente de 0,5 % à 1 % de la matière sèche des feuilles, soit une récolte

de 1 kg par hectare, ce qui permettrait de soigner plusieurs dizaines de malades par an.
 En 2005, 20 ha de maïs transgénique produisant de la lipase gastrique ont été cultivés en France.

 Actuellement, cette molécule est en phase d'optimisation de formulation : plusieurs sont testées in vitro, en

utilisant un modèle de tube digestif artificiel.

  
L'évolution dirigée permet de modifier une enzyme par mutation jusqu'à ce
u'apparaisse une variante possédant les qualités souhaitées.
Ensuite, il faut adapter la méthode mise au point au laboratoire pour permettre son
tilisation dans le cadre d'une application à l'échelle industrielle. Cette étape est délicate
ar il est difficile d'obtenir qu'un phénomène biologique observé au laboratoire dans un
etit appareil où tout est bien contrôlé, se reproduise à l'identique dans des conditions
e production de type industriel. Le génie enzymatique est largement utilisé dans
industrie agroalimentaire et celle des détergents (90 % des lessives contiennent des
nzymes, les " enzymes gloutons ").Une industrie plus respectueuse de l'environnement
durabilité industrielle) est en train d'émerger grâce au génie génétique.
-Une mutation sur le gène peut améliorer la structure primaire ( changement d’un acide
aminé par un autre ce qui fait changer la conformation 3D de l’enzyme et l’activité sera
meilleur.
-Clonage aussi du gène cible chez un autre microorganisme plus connu ( E .Coli)
permet à l’échelle industrielle d’avoir une meilleur quantité d’enzyme.
Recherche d’un caractère lié à l’industrie :exemple :La thermostabilité de l’enzyme,
dans ces conditions on doit cibler l’acide aminé pour le changer par un autre pour avoir
une meilleure flexibilité l’enzyme et éviter la dénaturation.
-La biotechnologie moderne est donc un outil capable d’apporter des changement au
niveau du gène pour obtenir des enzymes mutants qui répondent aux exigences des
bioindustries , santé et environnement.
Quelle est l’importance des enzymes pour biotechnologie ?

-Les enzymes sont des protéines. Elles sont au cœur du fonctionnement des êtres
vivants car elles accélèrent toutes les réactions chimiques qui se produisent dans les
cellules sans pollution de l’environnement . Par exemple, ce sont des enzymes qui
permettent de faire des alcools avec de l'orge et de la levure. Cette transformation met
en jeu toute une batterie d'enzymes, chacune d'elles réalisant une étape bien spécifique.
Il y a notamment celles de la graine, qui transforment l'amidon en sucre (le maltage),
puis celles de la levure de bière, qui transforment le sucre en alcool et en gaz
carbonique (la fermentation).
-Les enzymes permettent une chimie douce car elles travaillent dans des conditions
compatibles avec la vie alors que les catalyseurs chimiques nécessitent souvent des
environnements très agressifs (température, pression, acidité) pour être actifs. Par
exemple, la synthèse chimique de l'alcool nécessite une température supérieure à 250°C
et une pression de 50 atmosphères alors que les micro-organismes la réalisent à
température ambiante.
Quelle est l’importance de l’informatique ?
 
L'informatique ou précisément la bioinformatique est indispensable au développement
des biotechnologies. La biologie moderne produit des centaines de milliards de données
( banque de données ) et leur volume double tous les ans. Pour obtenir à partir de ces
informations des connaissances sur le fonctionnement des êtres vivants et l'organisation
des gènes, il est nécessaire de les comparer entre elles ( databases ou banque de
données dans NCBI ) . Ceci conduit à effectuer des milliards de milliards de
comparaisons. C'est pour cela qu'aujourd'hui, la puissance informatique des leaders
mondiaux de la génomique ( gene bank) dépasse celle de tous les autres secteurs
d'activité, hormis les applications militaires du nucléaire.
Actuellement, les entreprises et les laboratoires de biotechnologies, quelle que soit leur
taille, ne peuvent se développer sans une informatique puissante pour :
* Accéder dans de bonnes conditions (Internet à haut débit) à l'ensemble des
informations disponibles au niveau mondial (résultats des recherches, logiciels
d'exploitation les plus récents, etc.).
* Assurer le suivi et la valorisation de leurs travaux de recherche ainsi que pour
contrôler leurs procédures de fabrication (traçabilité).
L'augmentation des performances de l'informatique dédiée à la biologie passe par
l'élaboration de nouveaux concepts et modèles mathématiques. Ces recherches n'ont
pas de finalité industrielle immédiate.
Chapitre IV : Les grandes applications de la biotechnologie enzymatique
1.Bioréacteurs :

a)Bioréacteurs à lactose :Hydrolyse du lactose en continue

Il s’agit d’immobiliser la lactase ( betta galactosidase issue de Bactéries : Escherichia
coli induite par l’opéron lactose). Cette fixation se fait par co-polymérisation avec la
sérum-albumine bovine grâce au glutaraldéhyde . l’immobilisation est stable pendant
des semaines. Ces fragments sont entassés dans une colonne industrielle. Une
solution de lactose est coulée dans la colonne et le lactose est hydrolysé en glucose et
galactose par la lactase. Ainsi , on peut passer plusieurs milliers de litre de lait ( 50
g/l) et le lait sera débarrassé du lactose sans perdre sa valeur nutritive. Cette méthode
permet de fabriquer du lait pour les enfants allergiques au lactose et qui naissent
déficient génétiquement en betta galactosidase lié au gène de cette même enzyme
 
b)Bioréacteurs à acide aminés : Préparation des L acide aminés
Il s’agit d’immobiliser l’enzyme la L aminoacylase fongique (Aspergillus) dans une
colonne. Le mélange racémique ( L acide aminé +D acide aminé) est coulé dans cette
colonne. L’enzyme L aminoacylase isomérise le D acide aminé en L acide aminé.
Ce type de bioréacteur de 1000 litres permet de produire des tonnes de L Val, L Met ,
L Ser……etc utilisés en agro-alimentaire , santé et chimie analytique.

 
2. Biocapteurs à enzymes:
Les biocapteurs à enzymes ont pour but le dosage d’un certain nombre de métabolites
glucose, acide aminés, pesticides , antibiotiques, lipides, nitrates , phosphates, et autres)
ssentiellement en milieux aqueux. Le dosage se fait rapidement avec une bonne
pécificité et grande sensibilité.

3.2.1. Principe de base

SCHEMA DE PRINCIPE
Un biocapteur est l’association d’un matériel biologique ( enzyme) et d’un transducteur
du signal qui permet de quantifier une substance donnée. C’est donc une sonde
produisant un signal électrique lorsqu’une enzyme immobilisée catalyse une réaction.
Le produit libéré par cette réaction est capté par une électrode spécifique ce qui se
traduit par une variation de courant ( signal électrique) entre une électrode de référence
et l’électrode de mesure sur laquelle l’enzyme est immobilisée. Ce signal électrique est
proportionnel à la concentration du produit libéré. Le biocapteur le plus connu est la
glucose oxydase (GO) immobilisée dans un gel de polyacrylamide avec une électrode
à oxygène.
 
Exemple ( glucomètre) :soit la réaction d’oxydation du glucose par la glucose oxydase
(GO)
 
Glucose +O2 + Glucose oxydase Acide gluconique +H2O2
Pour doser le glucose ,on peut envisager 4 cas possibles
Electrode : qui capte l’oxygène
Electrode qui capte le H2O2
Electrode qui capte les ions H+ libéré par l’acide gluconique.
Un capteur à glucose
Dans tous les cas de figure , on peut donc doser le glucose par un biocapteur utilisant
un glucose oxydase immobilisée.
3.2.2. Différents types de biocapteurs

a)Biocapteurs à oxydases:
L’immobilisation de ces oxydases sur des électrodes a mis sur le marché une 20 de
biocapteurs dont les plus connus sont : biocapteurs à : acides aminés, alcool, vitamine
C , cholestérol, glucose, lactate , phénol, amines, xanthines, sulfites.
Le génie enzymatique permettra d’augmenter le nombre de biocapteurs dans le futur
proche.

b) Biocapteurs à déshydrogénases :
Le couplage d’une déshydrogénase à NAD+ à l’ensemble des L-lactate oxydases + L-
lactate déshydrogénase permet de transformer les réactions de déshydrogénases en
oxydation mesurables avec le capteur à oxygène. Une vingtaine d’oxydases et
déshydrogénases sont commercialisés et disponibles sur le marché ( Tableau 1)
Tableau(1)
Oxydases et déshydrogénases commercialisées.
Oxydases Déshydrogénases à Déshydrogénases à
substrats communs avec les substrats différents
oxydases
Alcool Alcool Alanine
L amino acides Galactose Aldehyde
Acides Betta glucose Formaldéhyde
Ascorbate Glycérol 3P Formate
Cholestérol L-lactate G6P
Choline pyruvate Glutamate
Galactose Glutathion
Betta glucose Glycérol
Glycérol 3P Isocitrate
L-lactate D- Lactate
L-Lys Malate
Monoamine Sorbitol
Pyruvate Stéroide
Sulfite
Xanthine
Phénol
oxalate
c)Autres : décarboxylases, désaminases, hydrolases, kinases
 
3.2.3..Quelles sont les avantage des biocapteurs enzymatiques ?
*Spécificité :
1 enzyme-1 réaction – 1 biocapteur
Multiplicité des enzymes ( déshydrogénases , oxydases, isomérases ..et etc
Dosage de substrats, activité enzymatique, inhibiteurs, pesticides, métaux lourds,
* Stabilité de l’enzyme immobilisée
*Rapidité : dosage rapide et sans traitement des échantillons
*Réutilisation : on peut faire plusieurs dosages et aller jusqu’à 100 dosages
*Appareil de terrain : portable et automatisation.

4. Domaines d’applications :
Les biocapteurs ont plusieurs applications dans divers domaines : agro-alimentaire ,
santé et environnement
 
4.1. Agro-alimentaire :
De multiples applications sont réalisées et appliquées à une échelle de terrain
( biocapteurs oxydases et déshydrogénases) , d’autres bioréacteurs ( décarboxylases ,
désaminases) sont en cours de réalisation. Nous citons quelques exemples.
4.1.1.Test des amines : Au cours de la mauvaise conservation de la viande et du poisson
( rupture de la chaîne de froid) il y a des odeurs de mauvaise qualité. Grâce à une
électrode à monoamine oxydase immobilisée, on peut facilement apprécier la qualité
de la conservation de ces produits
4.1.2. Dosage de l’Ascorbate ( Vit C) antioxydant dans les boissons. On peut
immobiliser une ascorbate oxydase sur une électrode ce qui permet de suivre la Vit C
au cours de la conservation des aliments
4.1.3. Dosage de l’éthanol dans certaines boissons. On utilise une enzyme alcool
oxydase immobilisée
4.1.4. Dosage du glucose grâce à une glucose oxydase. L’hydrolyse de l’amidon libère
des sucres simples ( glucose) qui peut être transformé en Fructose ( pouvoir sucrant
élevé : 1,5) par la glucose isomérase. Ces enzymes immobilisées permettent de mieux
suivre l’extraction de ces sucres
4.1.5. Dosage des L-Lactates : la fermentation lactique est souvent utilisée dans la
fabrication des fromages, yoghourt . En continue on peut facilement utiliser ce type de
technologie grâce à l’utilisation de biocapteurs avec lactate déshydrogénase
4.1.6. Dosage du lactose : Le lactose est sucre intolérant pour certain enfants. On
utilise une enzyme la lactase ( betta galactosidase) capable de scinder le lactose en
glucose et galactose assimilables par l’organisme.
4.1.7. Sources d’enzymes agrées par l’agroalimentaire (tableau 70 et 71)
4.2. Médicales : Les applications sont multiples ( antibiotiques, cholestérol, digoxine, éthanol,
glucose, lactate , lipides, monoamines, néoplasmes sanguins)
4.2.1. Dosage des antibiotiques : Les excès de l’usage de l’utilisation de ces molécules
sont nombreux . Cela se traduit par une résistance portée par le plasmide ( gène de
résistance). Ces résistances sont capables de détruire l’antibiotique ou d’empêcher sa
pénétration dans la cellule cible. Cela donne des maladies nocosomiales difficiles à
traiter.
4.2.2. Le cholestérol : la cholestérol oxydase peut être utilisée pour suivre chaque jour
l’évolution de ce métabolite pour éviter la maladie d’artériosclérose qui donne des
problèmes cardiovasculaires.
4.2.3. Digitoxine: Grâce à une électrode immuno-enzyme on peut facilement doser ce
médicament dans une goutte de sang dans le cas d’une insuffisance cardiaque. Un excès
de digitoxine peut entraîner la mort .
4.2.4. Ethanol :Un biocapteur à alcool oxydase immobilisée sur une électrode à oxygène
permet se suivre le taux d’alcoolémie dans le sang des conducteurs d’automobiles.
4.2.5 .Glucose: dans le sang : une électrode avec une glucose oxydase permet mesurer
rapidement la concentration de ce sucre chez les diabétiques. Cela est surtout utilisé chez
les insulino-dépendants ou on peut directement tester ( sous – cutané) la glycémie.
4.2.6. Les lactates : On utilise une électrode à oxygène avec avec une L-lactate oxydase
immobilisée . Cela permet de mesurer rapidement le taux de lactate chez le patient.
Egalement chez lesDosage
4.2.7. Les lipides : sportifs,des
suracides
terraingras
, oninsaturés
peut suivre
parfacilement
l’utilisationses
deperformances.
la lipoxygénase .
La consommation de ces acides gras permet d’éviter d’avoir des plaques d’athéromes et
4.2.8. Les monoamines : Certains sont des neuromédiateurs . On utilise la monoamine
oxydase (MAO) permet d’inactiver ces molécules et permet de transmettre l’influx
nerveux. Ainsi, une hyper activité des monoamines donne le Parkinson ou l’Alzheimer.

4.3. Environnement :

Les applications sont diversifiées ( contaminations microbiologiques, métaux lourds ,

nitrates, pesticides, phosphates , sulfites)
4.3.1.Les métaux lourds : Hg, Ag, Cd , Cu, Zn
La L- lactate déshydrogénase de muscle de lapin est l’enzyme qui a été sélectionnée
comme marqueur de pollution des métaux lourds (haute sensibilité). Ainsi,
l’immobilisation de la L- lactate- oxydase couplée à la L- lactate déshydrogénase
donne un biocapteur qui permet de doser rapidement ces éléments qui inactivent cette
enzyme.
4.3.2. Les nitrates : polluent les eaux potables et d’irrigation pour l’agriculture. Une
nitrate réductase immobilisée permet de doser ces nitrates avec une bonne sensibilité.
4.3.3. Les pesticides : Les organophosphorés et les carbamates sont des pesticides
utilisées par les agriculteurs pour lutter contre des insectes. Ces molécules inactivent
l’enzyme : acéthylcholinestérase ( enzyme neuro biologique) d’où son utilisation
comme bioindicateur.
Le biocapteur utilise cette enzyme pour doser rapidement ces pesticides.
 
Conclusion et perspective
Conclusion et Perspectives :
Les technologies enzymatiques permettent l’utilisation de bioréacteurs
( méthodes d’analyses qualitatives) et des biocapteurs ( méthodes d’analyses
quantitatives c'est-à-dire dosage)
Actuellement les dosages se sont essentiellement en milieux aqueux . Dans le
futur l’immobilisation des enzymes sera utilisée dans d’autres conditions et dans
divers milieux tel que :
-Milieux organique ( solvant organique) utilisation de lipases
-Dans l’atmosphère
-milieux à haute très riche en sels ( salinité élevée)
-Milieux à haute température : dans l’industrie de l’amidon , on hydrolyse à la
température de 80°C, pour obtenir du glucose. Actuellement, Les biocapteurs à
enzymes supportent une température inférieure à 50°C.Il est donc souhaitable de
mettre au point des biocapteurs qui dépassent cette température pour pouvoir les
utiliser en agro- industries. Cela se fait par la recherche de Microorganismes
thermostables pour isoler des enzymes thermorésistantes
Egalement des progrès en génétique permet d’isoler des gènes et les intégrer
dans des souches agrées en agro-alimentaire ( souches hétérologues)
-Milieux pauvres en eaux
Enjeux économiques : Les biocapteurs peuvent apporter des solutions originales
et efficaces aux problèmes posées par l’agro-alimentaire , la santé et
l’environnement.
Résumé
L'exposé passe en revue les usages actuels et futurs des enzymes dans les industries
agro-alimentaires. En raison de leurs propriétés catalytiques et de leur spécificité, elles
participent à la synthèse de molécules biochimiques, à des opérations de technologie
alimentaire ainsi qu'à l'élaboration de nouvelles techniques analytiques, à la fois rapides
et spécifiques.

Parmi les opérations de synthèse, on peut citer la production de métabolites tels que des
agents de flaveur, exhausteurs de goût, des acides aminés de forme L. Surtout,
l'utilisation des enzymes à bouleversé la production des matières sucrantes.

En technologie alimentaire, elles sont employées dans tous les secteurs industriels:
laiterie, fromagerie, industries des boissons, des céréales, de la viande, etc.

Dans le domaine analytique, les électrodes et les capteurs enzymatiques permettent la

détection et le dosage immédiat d'une substance déterminée, donc le contrôle en temps
réel des étapes clés de la fabrication d'un produit.

L'avenir des enzymes sera d'autant plus prometteur que la molécule enzymatique sera
plus efficace, plus stable et d'une durée de vis plus longue. Il est donc tributaire des
apports de la science et de sa capacité à terme à "construire" ces futures "super
enzymes".
 MERCI

POUR VOTRE ATTENTION