Milieux de culture

ESSAIA- ALGER
Un milieu de culture, constitué à partir de substances
biologiques ou chimiques, reproduit un environnement
favorable (nutriments, pH, pression osmotique ...) à la
culture d'un certain type de micro-organismes.

Ces milieux sont utilisés par les microbiologistes pour :

isoler, cultiver et identifier les micro-organismes.
 Composition des milieux de culture
a-Fondamental

Un milieu de culture doit contenir des nutriments couvrant les besoins

élémentaires en
macroéléments (source de carbone, azote),
micro-éléments et oligoéléments (minéraux),
besoins énergétiques
besoins spécifiques (facteurs de croissance).

La composition d'un milieu dépend donc du type trophique du micro-

organisme à cultiver et ses exigences.
b- D'autres substances

- Substances tampons : maintien le pH plus ou moins constant. (Ces

substances sont souvent source de macroéléments en même
temps).

- NaCl et autres minéraux : maintien de l'isotonicité par rapport au

milieu intracellulaire (source de micro-éléments en même temps).

- Agents inhibiteurs : inhibition d'un groupe microbien, sélection

des microorganismes désirés.

- Indicateurs : non toxiques pour les micro-organismes, ils révèlent la

présence d’un produit issu du métabolisme ou une variation
physicochimique. Exemple : indicateur coloré du pH
 Inhibiteurs Microorganismes non inhibés Microorganismes
inhibés
ANC (Acide nalidixique- Bactéries Gram+, bacilles Gram Bacilles Gram -
colimycine) – résistants ANC sensibles
Azide Streptococcus, Enterococcus, (*) ...
Lactococcus et Listeria

Cétrimide Pseudomonas aeruginosa et (*) ...

apparentés
Chloramphénicol Champignons Bactéries (sensibles)

Chlorure de sodium haute Staphylococcus, Micrococcus, Gram -,

concentration Corynébactéries, Enterococcus Streptococcus

Cristal violet Gram - Gram +

Désoxycholate (sels biliaires) Gram -, Enterococcus Gram +

Gentamicine Champignons Bactéries (sensibles)

Polymixine B Brucella, Bacillus cereus (*) ...

 Les deux grands types de milieux de culture

Suivant l'origine des constituants du milieu de

culture, on peut distinguer : les milieux synthétiques
(ou définis) et les milieux empiriques (ou naturels
ou complexes).
Les milieux synthétiques ou définis

Milieux constitués de substances chimiques pures, leur composition

qualitative et quantitative est rigoureusement connue.
Ce sont des milieux relativement pauvres.
L’utilisation de ces milieux est fréquente dans la recherche et peut
être :
-Pour la mise en évidence de certains caractères biochimiques (exp :
Citrate perméase, uréase).

-Pour étudier les besoins nutritifs d'un micro-organisme. (exp : besoins

en facteurs de croissance).

-Pour les tests d’optimisation de la production de métabolites (exp :

antibiotiques, vitamines etc).
Les milieux empiriques

• Milieux de composition approximative car ils contiennent des

composants indéfinis comme des peptones, des extraits de viande,
des extraits de levures, des liquides biologiques.
• Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant
une croissance aisée de nombreux micro-organismes.
• Ces différents composants mal définis vont couvrir les besoins en
macroéléments en micro-éléments et en oligoéléments ainsi que les
besoins en énergie et besoins spécifiques pour les micro-organismes
chimio-organotrophes, hétérotrophes et auxotrophe.
• Exemples de milieux complexes (naturels): sang, lait, milieu de
dattes…
Fondamental
Les peptones :
• obtenues suite à l'hydrolyse chimique et/ou enzymatique (protéases)
de matières biologiques riches en protéines.
• La composition d'une peptone dépend donc de la matière protéique
de départ et du traitement hydrolytique.
• Les peptones présentent entre elles des grandes différences de
composition en acides aminés, oligopeptides, bases azotées,
vitamines, minéraux et glucides.
• Il existe trois principaux types de peptones selon l’origine des
matières premières protéiniques utilisées pour sa fabrication :
-Origine animale (organes, muscles…)
-Origine laitière (caséine, lactoserum…)
-Origine végétale (soja, coton, maïs, fève, blé…)
• On peut également classer les peptones selon le type d'hydrolyse :
-hydrolyse chimique (typiquement par de l'acide chlorhydrique,
ensuite neutralisé par de la soude).
-hydrolyse enzymatique à l'aide d'enzymes protéolytiques
(pepsine, trypsine, pancréatine, papaïne...).

• Les peptones peuvent être

-simples, résultant de l'hydrolyse d'un seul substrat protéique
(peptones pepsiques de viande, peptones trypsiques de
caséine...)
- composées, résultant de l'hydrolyse de plusieurs substrats
protéiques ou de mélanges de peptones simples
(polypeptones, tryptones...).

• Des peptones sont produites naturellement au cours de la digestion,

mais on ne les rencontre alors que dans l'estomac et l'intestin grêle.
Les extraits de viande
• Correspond à un bouillon de cuisson de viande de bœuf filtré puis
concentré et parfois lyophilisé (poudre). Ces extraits contiennent
des acides aminés, peptides, nucléotides, acides organiques,
vitamines, minéraux et glucides.
• Ils sont employés dans des milieux nutritifs pour la culture
de micro-organismes hétérotrophes. C'est une source riche
de facteurs de croissance.
Les extraits de levures
Un extrait de levure est une excellente source de vitamines
(notamment les vitamines B) aussi bien que de composés azotés et
carbonés.
Les liquides biologiques
Certains milieux complexes sont de plus enrichis en liquides
biologiques : sang, sang cuit, sérum, lait qui sont eux mêmes des
milieux complexes.
 Les milieux de culture selon leurs usages

1. Les milieux dits "de base" ou usuels

• D'un emploi aussi universel que possible, milieu ou on
cultive un maximum de micro-organismes
hétérotrophes ne présentant pas d'exigences nutritives
particulières.
• Un micro-organisme cultivant sur ce type de milieu est
dit de culture facile ou non exigeant.
• Exemple : Gélose nutritive (bouillon nutritif), Gélose
PCA (Plate Count Agar)
2. Les milieux d'isolement
Ils sont caractéristiques du micro-organisme recherché et sont solides
(présence d'agar à 15g/L = polygalactoside sulfaté, extrait d'algues
rouges, non dégradable par la plupart des micro-organismes, liquide à
>45°C et solide à <45°C).

a-Milieux de Base non sélectifs : précédemment cités.

Sur lesquels de nombreuses colonies microbiennes peuvent se
développer. Ces colonies permettent de préparer des cultures pures
qui sont le point de départ d’une étude systématique aboutissant à
l’identification.
Pour les bactéries, gélose nutritive ou gélose PCA.
Pour les champignons, milieu Sabouraud
b-Milieux sélectifs : favorisant la croissance d'une (ou de
quelques) espèces microbiennes (exemple : gélose à pH 9, gélose à
fort % en NaCl).
Un Milieu sélectif est un milieu utilisé pour l’isolement d’un germe
recherché avec dominance absolue aux dépens d’un mélange de
microorganismes. Ces milieux contiennent un ou plusieurs agents
sélectifs qui sont des inhibiteurs pour les micro-organismes que l'on
désire éliminer.

c- Les milieux d'enrichissement

Est un milieu liquide sélectif en général,
enrichi le plus souvent avec du sang ou du sérum, favorisant la
croissance du micro-organisme recherché.
Après incubation on obtient une culture enrichie en micro-organismes
recherchés.
3. Les milieux d'orientation et d'identification
Ces milieux permettent la mise en évidence d’un caractère
biochimique ou physiologique.
4. Les milieux de conservation
Ces milieux permettent la survie des micro-organismes utilisant un
métabolisme ralenti. Il s'agit en général de milieux très pauvres.
b- A Préparer en mélangeant les différents composants et constituants.

Les étapes de préparation au laboratoire sont les suivantes :

1. Mettre dans un bécher le volume d’eau désiré (exp : 1 L d’eau distillée).

2. Peser les ingrédients un à un et les introduire dans l’eau contenue dans le bécher.
3. Mettre un Barreau d'agitation magnétique à l’intérieur du mélange et mettre le
bécher sur une plaque d’agitation magnétique.
4. Lancer l’agitation et laisser agiter jusqu’à ce que le mélange devienne limpide.
chauffer pour dissoudre si nécessaire en agitant.
5. Utiliser le PH-mètre pour le mesurer et l’ajuster à l’aide de quelques gouttes de
solution acide (HCl) ou basique (NaOH) selon le besoin.
6. Répartir le milieu dans des flacons de 200 mL.
7. Peser et ajouter à ce moment-la, la quantité d’agar requise dans chaque flacon.
Fermer les flacons à fond avant de les dévisser d’un demi-tour (pour laisser
échapper la pression) et les mettre à l’autoclave.
Si certains composants sont thermolabiles, ils peuvent être stérilisés
par filtration ou à l’aide d’un produit chimique (exemple de l’éther
pour certains sucres) à part avant de les incorporer aseptiquement au
milieu de base préalablement stérilisé.

Conditionnement
Tubes de faible diamètre et courts ou longs ;
Tubes normaux (18 mL maximum) ;
Tubes de grands diamètres ;
Flacons (intéressant pour les milieux à couler en boîte) ;
Boites de Pétri (conservation limité au réfrigérateur ou en chambre
froide).
Les milieux d’isolement et
d’identification
Sélectifs ou non
 ENTEROBACTERIES
Milieu BCP
BCP de l'anglais « BromoCresol Purple » = le pourpre de bromocrésol

Liquide
Solide
Bouillon BCP
Gélose BCP
(ou BCPL)
 BCP
C’est un milieu non sélectif et non enrichi, lactosé, utilisé dans
la recherche des coliformes totaux et les coliformes thermo-
tolérants. Très utilisés pour les Analy. Microbio. de l’eau.
Pourquoi ? Quel est le caractère distinctif chez les coliformes ?
 Composition du BCP

Peptone …………………………………. 05,0 g

Extrait de viande ……………..……….03,0 g
Lactose …………………………………… 05,0 g
Pourpre de bromocrésol …………. 0.025 g
Agar ………………………………………….15 à 18 g
Eau……………………………………………..1000 mL
 Composition du BCP
Composition
complexe (acides A savoir à propos des constituants
aminés, protéines,
vitamines….)
Peptone
Extrait de viande
Sucre qui est Lactose
Indicateur coloré de
fermenté à 37 C° Pourpre de bromocrésol pH qui vire au jaune
avec production de
en milieu acide.
Gaz par les Agar
coliformes
(caractère distinctif) Eau
Interprétation
Le lactose est en général fermenté par les
coliformes, qui produisent des acides et
des gaz. Les acides font virer au jaune
l'indicateur de pH et les gaz se
dégagent dans la cloche de Durham
(dans le cas d’un bouillon BCP).

GAZ
 Conclusion - BCP
Le milieu BCP est un milieu non sélectif, non
enrichi permettant de détecter les caractères
(fermentation du lactose) avec production de
Gaz (dans le cas d’un bouillon)

- Détection des coliformes totaux

- Pour els coliformes thermo-tolérants, il faut incuber à 44C° faire
le test de l’indole (voir plus loin dans les tests biochimiques).
 ENTEROBACTERIES
Milieu BLBVB
Le bouillon lactosé bilié au vert brillan

C’est un milieu sélectif, non enrichi, utilisé pour la

recherche et le dénombrement des coliformes totaux
et coliformes thermo-tolérants (Escherichia coli ) par le
Test de Mackenzie (température 44C° et production
d’indole dans un bouillon peptoné exempt d’indole).

Très utilisé dans les analyses des aliments (Lait et produits laitiers) et
des eaux.
 Composition BLBVB

Peptone ……………………………………..10,0 g
Lactose ……………………………………….10,0 g
Bile ……………………………………………..20,0 ml
Vert brillant ………………………………..13,0 mg
Eau …………………………………………….1000mL
pH ………………………………………………… 7,4
 Composition BLBVB
Composition
complexe (acides
aminés, protéines, Peptone
vitamines….)
Lactose
Bile Inhibiteurs des
Gram + et certains
Sucre qui est Vert brillant Gram – (sauf les
fermenté à 37 C° coliformes)
avec production de Eau
Gaz par les
coliformes
(caractère distinctif)
 Observation et Interprétation
Résultat
Trouble du milieu et Gaz sous la cloche (fermentation du lactose
+++), donc coliformes. Ces tubes sont donc présomptifs de
coliformes (à 30 C°) et coliformes thermo-tolérants (à 44 C°).
Un test confirmatif est réalisé

Interprétation
La bile de bœuf et le vert brillant sont des inhibiteurs de
bactéries à Gram + et à Gram -, sauf des coliformes.
Le lactose est fermenté par les coliformes avec production
d'acides et de gaz, recueillis dans la cloche de Durham.
 ENTEROBACTERIES
Milieu Hektoen
La gélose Hektoen est un milieu sélectif, permettant l’isolement et la
détection des Salmonnella, dans le domaine alimentaire, mais
aussi d’autres entérobactéries pathogènes .

Ce milieu évite l’envahissement par les

Proteus.

De nombreuses bactéries à Gram

négatif peuvent s’y développer ainsi que
quelques Pseudomonas.
 HEKTOEN
Composition du milieu :
• Pour 1 litre de milieu :
• - Peptone pepsique de viande.......................................................... 12,0 g
• - Extrait autolytique de levure............................................................ 3,0 g
• - Lactose........................................................................................... 12,0 g
• - Saccharose .................................................................................... 12,0 g
• - Salicine............................................................................................ 2,0 g
• - Sels biliaires .................................................................................... 9,0 g
• - Fuchsine acide ................................................................................. 40 mg
• - Thiosulfate de sodium ..................................................................... 5,0 g
• - Citrate ferrique ammoniacal ............................................................ 1,5 g
• - Bleu de bromothymol .................................................................... 65 mg
• - Chlorure de sodium......................................................................... 5,0 g
• - Agar agar bactériologique ............................................................... 13,5 g
 HEKTOEN
A savoir à propos des constituants

• - Peptone pepsique de viande Critère de

• - Extrait autolytique de levure différenciation
• - Lactose
• - Saccharose Inhibiteurs des Gram +
• - Salicine et quelques Gram -
• - Sels biliaires Inhibiteurs des Gram +
• - Fuchsine acide
Indicateurs • - Thiosulfate de sodium Précurseur d'H2S
coloré du pH • - Citrate ferrique ammoniacal
• - Bleu de bromothymol
Révélateur d'H2S en
• - Chlorure de sodium changeant de couleur
• - Agar agar bactériologique

INDICATIONS
Coloration jaune : fermentation d’au moins un sucre
Coloration verte ou bleu-verte : test du sucre négatif
Point noir sur la colonie : production dH2S (sulfure d’hydrogène)
Colonies – Résultats – Interprétation
A. Escherichia coli / B. Klebsiella pneumoniae / C: Salmonella sp. / D: Proteus mirabilis
Both Salmonella sp. & Proteus mirabilis product hydrogen sulfide.
E: Pseudomona aeruginosa Les colonies de Pseudomonas sont presque incolores
 1- E. coli
Sucre +, H2S -
2. Proteus vulgaris
Sucre +, H2S +
3- Salmonella
sucre -, H2S +
3- Salmonella
sucre -, H2S +
Salmonella H2S+
4- Salmonella (H2S-) ou autres (Morganella,
Shigella, Pseudomonas…)
Sucre -, H2S -
Résumé
 ENTEROBACTERIES
Gélose Mac Conkey
La gélose Mac Conkey est un milieu sélectif, non enrichi,
utilisé pour l'isolement des Entérobactéries. Le caractère distinctif
est l'utilisation ou non du lactose détectée par l’indicateur de pH
(rouge neutre).

Utilisé en Microbiologie alimentaire

et médicale (les eaux, le lait, les
urines et la recherche de
Salmonella et Shigella et E. coli
pathogènes dans les selles).
 Composition Mac Conkey

Peptone de caséine..............................17 g
Peptone de viande................................3 g
Sels biliaires.........................................1,5 g
Cristal violet.........................................0,001 g
Lactose.................................................10 g
Rouge neutre........................................0,03 g
NaCl.......................................................5 g
Agar……................................................13,5 g
Eau ……………………………………………………1000 mL
pH final ………………………………………………7,1
 Composition Mac Conkey
A savoir à propos des constituants

Composition
complexe (acides
aminés, protéines,
Peptone de caséine
vitamines….) Peptone de viande
Inhibiteurs des Gram +
Sels biliaires
Cristal violet
Sucre (substrat)
Lactose Indicateur coloré de pH qui
(caractère distinctif) Rouge neutre vire du rose au rose foncé ou
rouge.
NaCl
Agar Colonies rouges: lactose +
Colonies incolores: lactose -
Eau
 ENTEROBACTERIES
Milieu EMB
Gélose éosine bleu de méthylène
C’est un milieu sélectif pour les Gram négatifs, utilisé pour la
recherche des coliformes et des entérobactéries. Utilisé pour
l’analyse des eaux.

Rouge : couleur de
l’éosine
 Composition - EMB
Peptone : ……………………………………………………………….10,0 g
Lactose : …………………………………………………………………10,0 g
Eosine : …………………………………………………………………..0,4 g
Bleu de méthylène : ………………………...........................0,0625 g
Hydrogénophosphate de potassium ……………………….02 g
Aagar : ……………………………………………………………………15,0 g
Eau …………………………………………………………………………1000 mL
pH : 6,8
 Composition – EMB
A savoir à propos des constituants

Composition
complexe (acides
aminés, protéines,
vitamines….) Peptone
Sucre (substrat)
Lactose Colorants Inhibiteurs des
(Critère d’identification) Eosine Gram +

Bleu de méthylène
Hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4)

L’utilisation du lactose s’exprime par une acidification

donnant une couleur aux colonies.
 Interprétation
L'éosine et le bleu de méthylène sont deux colorants de
microbiologie inhibiteurs des bactéries à Gram +.

Le bleu de méthylène sert également d'indicateur

d'oxydoréduction, bleu à l'état oxydé et incolore lorsqu'il
est réduit.

L'interprétation est complexe, mais l'utilisation du lactose

par des entérobactéries libère des acides et s'exprime en
présence des deux colorants par des colonies de couleur
violette...
 Orientations
(A confirmer par Galerie Api)
EMB

Escherichia coli
 ENTEROBACTERIES
Gélose SS
La gélose SS (Salmonella-Shigella)

C’est une gélose sélective pour isolement et différenciation des

Salmonella et Shigella après pré-enrichissement lors d’analyses
des denrées alimentaire.

D’autres entérobactéries pathogènes

pourraient également y pousser.
 Composition – Gélose SS

Précurseur d'H2S

Révélateur d'H2S en
changeant de couleur
(précipité noir)

Les sels biliaires, le citrate de sodium et le vert brillant (colorant) inhibent les
bactéries à Gram +. Le citrate de fer et le thiosulfate de sodium diminuent
l’envahissement par Proteus et ralentit les coliformes.
Le lactose peut être utilisé par des coliformes, mais il ne l'est pas en général par les
Salmonella et Shigella. La fermentation de ce sucre libère des acides qui font virer le
rouge neutre (indicateur de pH) au rose à rouge en milieu acide.
 Résultats – interprétation
• Bactéries à Gram négatif, lactose + (colonie rose, rouge), H2S-
(pas de centre noir) : Escherichia, Klebsiella, Enterobacter...
Shigella sonnei.
• Bactéries à Gram négatif, lactose – (incolores), H2S- (pas de
centre noir) : Shigella, Salmonella (H2S-), Entérobactéries non
coliformes.
• Bactéries à Gram négatif, lactose – (incolores), H2S + (centre
noir) : Salmonella enteritidis, S. typhimurium……….Proteus.
mirabilis,...
• Bactéries à Gram négatif, lactose + (colonie rose, rouge), H2S +
: certaines espèces de Citrobacter
 ENTEROBACTERIES
Milieu XLD
Xylose-Lysine-Désoxycholate

C’est un milieu sélectif utilisé pour l’isolement et la différenciation

des Salmonella et Shigella dans les prélèvements alimentaires,
médicaux et pharmaceutiques.

XLD
Composition - XLD
 A propos des constituants / Rôle
Le désoxycholate de sodium est surtout un inhibiteur de
bactéries Gram +.

Les trois sucres, le xylose, le lactose et le saccharose peuvent

être fermentés avec production d'acides, qui font virer le rouge
de phénol (indicateur de pH), du rouge en milieu basique au
jaune en milieu acide.

Le thiosulfate de sodium et le citrate de fer ammoniacal

permettent le test H2S. La L-Lysine (acide aminé) est
décomposée, en présence d'une lysine décarboxylase (LDC)
en cadavérine (amine) et en ammoniac, qui fait virer
l'indicateur de pH au rouge en milieu basique : le test LDC
est positif.
 Résultats
Les colonies de Salmonella sont roses à rouges (LDC +) avec ou
sans centre noir (H2S + ou - ).

Les colonies de Shigella sont roses à rouges (LDC +) sans centre

noir (H2S ).

Les colonies jaunes ou oranges (sucre +) correspondent à

d'autres entérobactéries.

Remarques / Limites
certaines Salmonella enterica subsp. arizonae et Shigella sonnei
peuvent donner des colonies non caractéristiques (espèces pouvant
fermenter le lactose) ;
Certaines entérobactéries peuvent présenter des colonies
caractéristiques de Salmonella ou Shigella; il est donc nécessaire de
réaliser une identification complète par des tests complémentaires.
 Vibrio
Milieu TCBS
Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose

C’est un milieu sélectif destiné à

l’isolement des Vibrio pathogènes
tel que Vibrio cholerae et les autres
vibrions entéropathogènes
(ex.Vibrio parahaemolyticus dans les
poissons et les produits de la mer)
 Composition - TCBS
- Peptone............................................................................. 10 g
- Extrait de levure............................…………………………………. 5 g
- Citrate de sodium.............................................................. 10 g
- Thiosulfate de sodium....................................................... 10 g
- Chlorure de sodium........................................................... 10 g
- Bile de bœuf....................................................................... 8 g
- Citrate ferrique.................................................................. 1 g
- Saccharose......................................................................... 10 g
- Bleu de bromothymol....................................................... 0,04 g
- Bleu de thymol.................................................................. 0,04 g
- Agar..................................................................................... 14 g
- pH final = 8,6
 Composition – TCBS
A propos des constituants
Composition
complexe (acides - Peptone
aminés, protéines, - Extrait de levure
vitamines….)
- Citrate de sodium La bile et les chlorures
- Thiosulfate de sodium de sodium
Les concentrations élevées - Chlorure de sodium ralentissent la culture
en thiosulfate et en citrate de des entérocoques et
sodium ainsi que la forte
- Bile de bœuf inhibent le
alcalinité du milieu inhibent - Citrate ferrique développement des
fortement la croissance des - Saccharose germes à Gram positif.
entérobactéries. - Bleu de bromothymol
- Bleu de thymol Indicateurs colorés
- Agar de pH
- pH final = 8,6
Indicateurs de pH - TCBS
 Résultats - Interprétation
-Par acidification du milieu, résultant de la fermentation du
saccharose, les Vibrio provoquent le virage au jaune de l’indicateur
au thymol et au bleu de bromothymol.
- A partir du thiosulfate, qui constitue une source de soufre, la
production de sulfure d’hydrogène est révélée en présence de citrate
ferrique. Tous les Vibrio sont H2S négatifs.
 Orientations sur TCBS
A confirmer impérativement (Galerie Api…)
Il ne s’agit que d’un seul caractère phénotypique
 Campylobacter
Milieu Skirrow

Milieu sélectif pour les Campylobacter après 48 h d’incubation à 42 C° dans un

environnement enrichi en CO2 (micro-aérophile).

D’autres milieux de base (Columbia, Muller-Hinton…) additionnés du mélange sélectif

de Sikrrow peuvent être utilisés dans ce but.

Le mélange sélectif est un ensemble d’antibiotiques

Composition
 Rôle des constituants
L'infusion de cœur, la peptone de caséine et l'extrait de
levure fournissent au milieu les nutriments nécessaires.

La vancomycine inhibe les microorganismes Gram positifs.

Le triméthoprime et la polymyxine B inhibent de
nombreux microorganismes Gram négatifs.

Le sang de cheval lysé apporte les nutriments et l'hème

nécessaires pour la catalase bactérienne.
 Pseudomonas
Gélose au Cétrimide

C’est un milieu sélectif permettant

l'isolement des Pseudomonas;
notamment Pseudomonas aeruginosa en
favorisant la production de ses pigments
caractéristiques.

Utilisé surtout dans le domaine médical

mais aussi pharmaceutique et industriel
Gélose au cétrimide
 A propos des constituants
Gélose au cétrimide

Le cétrimide (bromure d'hexadécyl triméthyl ammonium)

est un antiseptique inhibiteur de beaucoup de germes
autres que les Ps. aeruginosa.

Le sulfate de potassium et le chlorure de magnésium

favorisent la production des deux pigments (pyocyanine
et pyoverdine).
 Résultats
Les colonies présentant une pigmentation vert pâle et/ou une
fluorescence verte sous lumière ultraviolette sont caractéristiques
de Pseudomonas aeruginosa, mais elles doivent être confirmées
par des tests biochimiques.

Il est à remarquer, d'après les « limites du test » relatives à ce

milieu que :
— certaines souches de P. aeruginosa ayant des exigences
spécifiques ne se développent pas ;
— certaines espèces autres que P. aeruginosa peuvent se
développer sur le milieu.

Tests de Confirmation
Bacilles à Gram —, oxydase +, mobiles, capables de produire les
deux pigments
 Pseudomonas
Milieux King A et King B
Ces deux milieux sont des milieux d’identification permettant de différencier les
espèces de Pseuomonas en fonction du pigment synthétisé.

la production de pyocanine, due spécifiquement à Pseudomonas

aeruginosa, est favorisée par la présence d'ions inorganiques. La
recherche de la production de pyocyanine est effectuée sur milieu
King A.

la production de pyoverdine, est favorisée par une teneur élevée

en phosphate. La recherche de la production de pyoverdine est
effectuée donc sur milieu King B.
Résultats
 Legionella
Milieu BCYE

C’est un milieu d’isolement des Legionella

Incubation de 4 jours à 37 C°
Colonies lisses incolores ç gris-bleu
 Bacillus
Milieu Mossel
Milieu Mossel
 Milieu Mossel
A propos des constitunts
Le D-mannitol fermenté produit des acides qui font virer l'indicateur de
pH au jaune en milieu acide (mannitol +).
Dans le cas contraire, il vire au rouge, Bacillus cereus est mannitol —.

Le sulfate de polymyxine B est un antibiotique qui agit notamment sur

des entérobactéries et Pseudomonas aeruginosa. B. cereus est assez
résistant à certaines concentrations de cet antibiotique, ce qui permet
l'inhibition de la flore bactérienne présente dans l'aliment

Le jaune d'oeuf contient de la lécithine ; cette dernière est en général

hydrolysée rapidement par les souches de B. cereus, avant que les
germes secondaires résistant à la polymyxine aient atteint leur plein
développement.
Indicateurs de pH
 Clostridium
Milieu TSN
Tryptone Sulfite Néomycine

La gélose TSN est principalement destinée au dénombrement, à

46°C, des microorganismes et spores des anaérobies
sulfitoréducteurs dans certaines denrées notamment Clostridium
perfrengens.
Composition
 Interprétation
- Les antibiotiques rendent le milieu inhibiteur vis-à-vis
des entérobactéries et autres bactéries à Gram négatifs
et certains Gram positifs.
- La température d’incubation est un facteur sélectif.

- Le critère de différenciation est le sulfite de

sodium dont la réduction est révélée par le citrate de fer
ammoniacal sous forme de précipitation en donnant
des colonies noires.
 D’autres milieux :

Viande foie (VF)

Tryptone-Sulfite-Cyclosérine (TSC)
Gélose RCM (Reinforced Clostridial Medium)
Gélose Rosenow

Peuvent etre utilisées pour les Clostridium

 Staphylococcus
Milieu Chapman
La gélose Chapman permet l’isolement sélectif et la recherche et
dénombrement des staphylocoques pathogènes (principalement
Staphylococcus aureus) dans le lait, eaux, les produits de la mer et
divers autres denrées alimentaires.
Composition
 Interprétation
- La forte concentration en chlorure de sodium (NaCl) inhibe la
croissance de la plupart des bactéries autres que les
staphylocoques (sauf les halophiles).

- La fermentation du mannitol, permet d’orienter le diagnostic.

- Le rouge de phénol est un indicateur coloré de pH. Il met en

évidence cette fermentation en virant vers le jaune dans un
milieu acide.

- La confirmation des staphylocoques pathogènes devra être

confirmée par la recherche de la coagulase et, éventuellement,
de la désoxyribonucléase et de la phosphatase (voir ces tests
un peu plus loin – prochain cours).
Indicateurs de pH
Résultats – colonies caractéristiques
de Staphylococcus aureus Mannitol +
 Staphylococcus
Milieu Baird Parker
La gélose Baird-Parker est un milieu différentiel modérément sélectif
servant à l'isolement et à l'énumération des Staphylococcus
aureus issus d'échantillons alimentaires, environnementaux et
cliniques.

Couleur jaune du
jaune d’oeuf
 Composition

- La croissance des staphylocoques est favorisée par le pyruvate de sodium et la glycine.

- La microflore secondaire est inhibée en présence de chlorure de lithium et de tellurite de

potassium, ainsi que par la forte concentration en glycine.

- L’enrichissement au jaune d’œuf aide à l’identification en démontrant l’action de la

lécithinase. La caractérisation des Staphylococcus aureus qui présentent des colonies
noires (réduction du tellurite en tellure), entourées d’un halo d’éclaircissement du jaune
d’œuf, pourra être complétée par l’épreuve de la coagulase et éventuellement de la
désoxyribonucléase et de la phosphatase. (tests à voir au prochain cours)
 Présomption de
Staphylococcus aureus
 Streptocoques
Columbia au sang
C’est une Gélose au sang

Le milieu Columbia est un milieu de base non sélectif tel que la gélose
nutritive ou gélose PCA. Ce milieu est enrichi avec du sang pour
l’isolement de bactéries exigeantes n'ayant pas besoin de facteurs
particuliers comme Streptococcus.
 Composition – Columbia au sang

• Peptones : …………………………………23 g,
• Amidon : ……………………………………1 g,
• Chlorure de sodium : ………………….5 g,
• Agar : …………………………………………10 g,
• Sang : ………………………………………….50 mL.
• pH est de 7,3.

Cette gélose peut être sélective par ajout d'antibiotiques qui

inhibent les Gram négatifs : acide nalidixique, colistine,
Aztréonam ...
 Résultats
E milieu nous permet de détecter en plus de la croissance le type
d’hémolyse.
L'hémolyse étant la destruction des globules rouges par le microorganisme.
 Autres milieux

D’autres milieux pouvant servir à l’isolement ou l’enrichissement

des streptocoques existent:

- Todd Hewitt (surtout pour enrichissement)

- Milieux Edwards et milieu TKT (surtout pour isolement des

Streptocoques du groupe B responsable de mammites) ex. S.
agalactiae.

- Milieu TYC (surtout pour l’isolement des Streptocoques oraux)

 Enterococcus
Milieu Slanetz
La gélose de Slanetz est un milieu de culture utilisé pour le dénombrement des
Entérocoques (Norme AFNOR NF T 90-416) en microbiologie alimentaire.
 Composition
Agar-agar................................................................10 g

Peptone...................................................................20 g

Azide de sodium.....................................................0,4 g

Glucose.....................................................................2 g

TTC (chlorure de 2-3-5 triphényl-tétrazolium).......0,1 g

pH = 7,2
 Interprétation
Ce milieu contient un critère de différenciation : le TTC
qui lors de sa réduction donne une coloration rouge
aux colonies.

Le milieu contient un inhibiteur des gram -, qui

sélectionne les streptocoques/enterocoques : l'azide
de sodium.

Les colonies présentant une coloration rouge à marron

doivent être considérées comme caractéristiques. Des
tests de confirmation des colonies typiques pourront
être faits.
 Enterococcus
Gélose BEA
Bille Esculine Azide
Utilisé pour Isolement sélectif des Enterococcus et Streptococcus
du groupe D; dans le domaine de la microbiologie alimentaire.
 Composition
-Peptone:..........................................................17,0 g
-Peptone pepsique de viande:.........................3,0 g
-Extrait de levure:.............................................5,0 g
-Esculine :..........................................................1,0 g
-Citrate de sodium:............................................1,0 g
-Citrate de fer ammoniacal:................................0,5 g
-Bile de bœuf déshydratée:...............................10,0 g
-Azide de sodium : ..........................................0,25 g
-Chlorure de sodium:..........................................5,0 g
-Agar:.................................................................13,0 g
pH = 7,
 A propos des constituants

-Peptone
-Peptone pepsique de viande
-Extrait de levure
-Esculine Caractère de
Inhibiteur des Gram +,
différenciation
y compris les -Citrate de sodium
Streptocoques des Révélateur de
autres groupes
-Citrate de fer ammoniacal l’hydrolyse de l’esculine
(autres que D) -Bile de bœuf déshydratée
-Azide de sodium : Inhibiteur des Gram -
Et certains Gram -
-Chlorure de sodium
-Agar
pH = 7,