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Plan
Introduction
1. Besoin nutritifs courants
2. Sources d’énergie et d’électrons
3. Types nutritionnels
4. Absorption des nutriments
5. Milieux de culture
6. Application aux travaux pratiques en bloc 1
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Introduction
• Pour croissance/multiplication microbienne
– Eau
– Nutriments
Substrat
énergie
nouveaux constituants cellulaire (biosynthèse)
– Milieu isotonique
– pH ok
– Température ok
BPL
– Atm ok
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1. Besoin nutritifs courants
• Macroéléments (95% P.S.)
– CHONSP
– Constituants des lipides, protéines et sucres
– ~ gramme/l
• Microéléments = oligoéléments
– Fe, Mg, Mn, Cu, Zn, K, Ca, Na, Cl,…
– Constituants de substances organiques dont
• Enzymes
– Maintien pH
– Maintien pression osmotique
– ~ milligramme-microgramme/l
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1.1. H et O
• H2O
– 75-85% de la masse cellulaire
– Participation à de nombreuses réactions essentielles
• Provenance
– H2O du milieu (1litre de milieu 1 litre d’H2O désionisée)
– Autres (n’importe quels aliments)
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1.2. C
squelette des molécules organiques
• Source de C
– Autotrophes (auto, seul et trophos, nutrition) Cyanobactéries
• CO2 ou ions bicarbonates (inorganiques)
• Beaucoup de bactéries photosynthétiques
• Réduction du carbone consommation de beaucoup
d’énergie peu d’organismes autotrophes
– Hétérotrophes (heteros, autre)
• Composés organiques (protéines, lipides)
– CO2 peut être important:
• Stimulation de la croissance de certaines bactéries
• Si absence pas de croissance pour certaines
– Ex: genre Neisseria sp. = bactérie capnophile -> besoin d’une étuve à
CO2
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1.3. N
synthèse des protéines, a.a., purines et pyrimidines,
certains glucides, …
• Source de N
– Autotrophes
• N inorganique (N2, NH3, NO2-, NO3-, sels inorganiques
d’ammonium)
– Hétérotrophes
• N organique (protéines, peptones, a.a., voire urée)
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1.4. S, P et autres
• Soufre synthèse a.a. soufrés
– Réduction des SO42-
– Sources organiques
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1.5. Facteurs de croissance (FC)
• Eléments chimiques ESSENTIELS qui ne peuvent pas être
synthétisés (≠ ) apports tels quels nécessaires
– Prototrophes : pas besoin de FC
– Auxotrophes : besoin de FC (Haemophilus influenzae)
Facteur X (hémine) et Facteur V (NAD)
– Syntrophie : besoin d’un FC compensé par la présence d’une
autre espèce qui le synthétise
• Types de substances (et [ ]) :
– A. a. (25 mg/l)
– Bases puriques et pyrimidiques (10 mg/l)
– Vitamines (1 à 24 µg/l)
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2. Sources d’énergie et d’électrons
• Source d’énergie :
– Lumière phototrophes
– Oxydation de composés chimiques (organiques ou
inorganiques) chimiotrophes
• Source d’électrons
– Substances inorganiques réduites litotrophes
– Substances organiques organotrophes
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Résumé
Besoin Nature du besoin Type trophique
Energie Lumière Phototrophe
Réactions ox-réd Chimiotrophe
Electrons Minérale Litotrophe
Organique Organotrophe
Carbone/ Minérale Autotrophe
azote Organique Hétérotrophe
Facteur de Nécessaire Auxotrophe
croissance Non nécessaire Prototrophe
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3. Types nutritionnels
• Autotrophes photolitotrophes
• Autotrophes chimiolitotrophes
• Hétérotrophes photoorganotrophes
• Hétérotrophes chimioorganotrophes
– Protozoaires
– Mycètes
– Bactéries pathogènes (et autres non-photosynthétiques)
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4. Absorption des nutriments
• Spécifique
• A partir d’une solution souvent très diluée
• Membrane plasmique sélective
• Plusieurs mécanismes car énorme variété de
nutriments
– Diffusion passive (H2O, O2, CO2)
– Diffusion facilitée
• Protéines de transport membranaires
– Vitesse de diffusion ++
– Passage de molécules insolubles dans les lipides
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Diffusions passive et facilitée
http://mpronovost.ep.profweb.qc.ca/BIONP1/bionp http://www.dematice.org/ressources/DCEM1/phar
1_membrane.html#tm macologie/D1_phar_008/co/Mecanismes_transpor
t_11.html
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Absorption des nutriments (suite)
– Transport actif
• Contre un gradient de concentration
• Protéines de transport
• Nécessite de l’énergie
– Translocation de groupe (chez procaryotes)
• Transfert dans la cellule sous forme modifiée
• Besoin d’énergie
– Capture du fer
• Sidérophores
http://www.dematice.org/ressources/DCEM1/phar
macologie/D1_phar_008/co/Mecanismes_transport
_12.html 15
5. Les milieux de culture
• Utilités
– Croissance (comptage, identification)
– Transport
– Stockage
• Composition
– Source de ‘CHONSP’
– Source d’énergie
– Source d’électrons
– Variable selon la souche à cultiver http://www.amcan.fr/Pages-
Fr/secteurs_activite_biotechno
• Structure logie_fermentation-Fr.htm
Gelidium sp.
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5.1. Milieux synthétiques
• Composition connue (qualité et quantité)
• Utilisés en recherche
Prescott
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5.2. Milieux empiriques (et semi-synthétiques)
• Composition indéterminée
– Peptones (C,N et énergie)
– Extraits de viande (a.a., ac. organiques, nucléotides,
vitamines,…)
– Extraits de levure (vit. B, C & N)
• Riches croissance de nombreux micro-organismes
différents
• Si certains nutriments exactement connus milieu
semi-synthétique
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Milieux empiriques (et semi-synthétiques)
Empirique
Semi-
synthétiques
20
Prescott
5.2. Milieux
C. Différentiels
microorganismes
– Utilités: voir dia suivante
• B. Sélectifs
biochimiques
– Éléments inhibiteurs (obligatoire) sels
biliaires, NaCl, AB, …
– Identification à partir de produit
polymicrobien
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5.3. Milieux polyvalents
• Croissance de la plupart des micro-organismes
• Utilités
– Rajeunissement de souches
– Vérification de pureté de souches
– Dénombrement de flore totale (PCA)
– Orientation d’un diagnostic d’identification si différentiels
• Gélose au sang
• Cled
• Kligler
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Tryptone-Caséine Soja Agar (=TSA)
• Fonction
– Rajeunissement de souches
• Composition
Hydrolysat de caséine
Peptone de soja
NaCl
Agar
pH ~7.3
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Gélose nutritive
• Fonction
– Conservation de souches si inclinée en tube
• Composition
Peptones
Extrait de viande
NaCl
Agar
pH ~7.3
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Gélose au sang
• Fonction
– Mise en évidence du type d’hémolyse (, ou )
• Composition
Hydrolysat de caséine
Peptone de soja
NaCl Gélose nutritive ou TSA
Agar
5% de sang dégradation des GR?
pH ~7.3
25
Gélose au sang
• Lecture
– hémolyse : hémolyse partielle
– hémolyse : hémolyse complète
– hémolyse : pas d’hémolyse
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http://fr.wikipedia.org/wiki/Streptococcus_pyogenes
CLED (gélose)
• Fonction
– Mise en évidence de l’utilisation du lactose grâce à la bêta-
galactosidase
• Composition
Peptone
Extrait de viande
Hydrolysat trypsique de caséine
Cystine
Lactose
Bêta-galactosidase
Bleu de bromothymol
Agar
pH ~7,3
Utilité: orientation diagnostic des BG-
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CLED (gélose)
Lecture
Utilisation du lactose grâce à la bêta-galactosidase
production d’acides milieu jaune (bactéries L+)
Pas d’utilisation pas d’acidification milieu
bleu/vert (bactéries L-)
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Bouillon nutritif
Fonction
Simple multiplication
Composition
Tryptones
Extrait de viande
NaCl
pH ~7,3
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Kligler (gélose)
• Fonction
– Orientation (car différentiel) diagnostic BG-
• F glucose
• F lactose (bêta-galactosidase)
• Production de gaz
• Production d’H2S (thiosulfate réductase)
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Kligler
• Composition
Peptone
Extrait de levure
Extrait de viande
NaCl
Glucose 1g/L
Lactose 10g/L Fermentations
Production de gaz
Rouge de phénol
Thiosulfate de Na Production d’H2S
Citrate de Fe (thiosulfate réductase)
Agar
pH ~7,4
31
Kligler : lecture
Fermentation du glucose : culot
Si oui acides + pH ↓ jaune
Si non culot inchangé rouge = pas de croissance!
Fermentation du lactose (bêta-galactosidase) : culot
Si oui acides ++ (car 10 g/l) culot et pente jaunes
Si non utilisation des peptones en aérobiose ↑ pH pente
rouge
Production de gaz lors des fermentations: culot
Si oui bulles ou gélose ‘éclatée’
Réduction du thiosulfate (thiosulfate réductase): culot
Si oui H2S+ précipité de FeS culot noir ( culot jaune!!)
Si non culot jaune ou rouge
32
Kligler : lecture
33
5.4. Milieux sélectifs (souvent différentiels)
• Utilité
– Sélectionner (et mettre en évidence) des micro-
organismes particuliers identification
• Structure
– Solides isolement et identification
– Liquides enrichissement
• Composition
– Eléments nutritifs particuliers
– Inhibiteur(s)
– Indicateur(s)
• Ex.: Mac Conkey, XLD, bile esculine azide, MSA, Sabouraud +
chloramphenicol
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Mac Conkey (gélose)
Fonction
Mise en évidence de BG- intestinaux fermentant ou
pas le lactose
• Composition
Peptones
Sels biliaires (anti non-’intestinaux’)
Cristal violet (anti Gram +)
Lactose
Bêta-galactosidase
Rouge neutre
NaCl
Agar
pH ~7 35
Mac Conkey (gélose)
Lecture :
Non BG- intestinales +/- inhibées
BG- intestinales lactose + acidification colonies
rouge brique
BG- intestinales lactose - pas d'acidification
colonies incolores
http://thealchemistkitten.wordpress.com/tag/macconkey/
36
XLD (gélose)
• Fonction
– Sélectif (BG- résistants aux sels biliaires) et différentiel
• F un sucre ou plus (lactose, saccharose, xylose)
• Décarboxylation de la lysine
• Production de H2S (thiosulfate réductase)
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XLD
• Composition
Extrait de levure
Désoxycholate de Na
NaCl
Xylose 1g/L
Lactose 10g/L
Saccharose 10g/L Fermentations
Rouge de phénol
Lysine Lysine décarboxylase
Thiosulfate de Na
Citrate de Fe Production d’H2S
Agar
38
XLD : lecture
Si croissance BG- ‘intestinal’
Si au - un sucre + productions d’acides ↓pH
colonies jaunes (+précipité jaune)
Si aucun sucre fermenté colonies incolores
Si LDC + productions de ‘bases’ ↑ pH
Si ! Xylose + et LDC+ colonies incolores
Si lactose et/ou saccharose + colonies jaunes
Si H2S+ réaction avec le citrate de Fe centre noir
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Bile esculine azide (gélose)
Fonction
Mise en évidence de bactéries intestinales utilisant ou
non l’esculine (esculinase)
• Composition
Peptones
Extrait de levure
Citrate de Na
Sels biliaires
Azide
Esculine
Citrate de Fe ammoniacal Esculinase
NaCl
Agar
pH ~7
40
Bile esculine
• Lecture
– Non intestinaux +/- inhibés par sels biliaires
– Gram – inhibés par l’azide
– Dégradation de l’esculine (esculinase) esculétine
esculétine + citrate de Fe colonies marron à noir
– Si Esculine - pas de précipité
41
Chapman (gélose)
Mannitol Salt Agar
• Fonction
– Mise en évidence des Staphylococcus dégradant ou non
le mannitol
• Composition
Peptones
Extrait de viande
NaCl 75g/L inhibe tout sauf les osmotolérants
Mannitol
Rouge de phénol Ferm. du mannitol
Agar
pH ~7
42
Gélose Chapman
• Lecture
– Si croissance Staphylococcus sp. (rares exceptions)
– Si fermentation du mannitol en anaérobiose acidification
milieu jaune Staph. aureus
– Si mannitol - pas d’acidification milieu rouge autre que
Staph. aureus
http://online.santarosa.edu/testbank/?22844
43
Sabouraud (gélose)+ chloramphenicol
Fonction
Mise en évidence de levures et moisissures
• Composition
Peptones
Glucose
Chloramphenicol inhibiteur de bactéries
Agar
pH ~ 5,6
44
Sabouraud (gélose)+ chloramphenicol
Lecture
Si croissance levures ou moisissures
Levures petites colonies blanches
Moisissures mycélium
45
6. Application aux travaux pratiques en bloc 1
• Coques Souches Q2
– Gram +
• Staphylococcus aureus
• Staphylococcus epidermidis
• Streptococcus sp.
• Enterococcus sp.
• Streptococcus pneumoniae
– Gram –
• Branhamella catarrhalis
• Bacille
– Gram +
• Bacillus sp.
• Listeria monocytogenes
– Gram –
• Escherichia coli
• Salmonella sp.
• Klebsiella pneumoniae
• Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
• Morphologie: CG+ en amas
• Site de présence: ubiquitaire de la peau – Portage nez chez certaines personnes
• Caractères biochimiques (importants pour l’Id)
– Hémolyse bêta
– Inhibé par sels biliaires et CV ne pousse pas sur ces milieux
– Pousse sur Chapman et mannitol +
• Pathogène:
– Infections cutanées (fréquentes et bégnines)
• Doigt blanc, panaris, furoncle, …
– Infections des muqueuses (fréquentes et bégnines)
• Otite, sinusite, …
– Voie respiratoire inf.: surinfection pneumonie
– Systémique (septicémie)
– Intestinale
• Intoxication alimentaire
47
Staphylococcus epidermidis
• Pathogène:
– Très faible… besoin d’une mise en évidence répétée
– Cathéter +++
48
Streptococcus sp
• Classification de Lanciefield
49
Streptococcus pyogenes (groupe A)
50
Streptococcus agalactiae (groupe B)
51
Streptococcus (groupe D) – Ex:
Enterococcus sp.
• Pathogène:
– Infection urinaire
– Endocardites - septicémie
52
Streptococcus (non groupable) – Ex:
Streptococcus pneumoniae
• Morphologie: CG+ en diplocoque
• Site de présence: Commensale VRS 5-25-50% des individus
– Forme commensale acapsulée >< forme virulente
– En Belgique: 20 000 infections sévères par an – 2000 morts/an (6/ j) – surtout > 50 ans –
pneumonies
• Caractères biochimiques (importants pour l’Id)
– Hémolyse alpha
– Inhibé par sels biliaires et CV ne pousse pas sur ces milieux
• Pathogène:
– Pneumonie +++
– Sinusite – otite – conjonctivite
– Septicémie
– Méningite
53
Branhamella catarrhalis
54
Bacillus sp.
• Pathogène:
– Intoxication alimentaire
– Faible --> sujet fragile : septicémies
– Bacillus cereus
– Bacillus anthracis (pouvoir pathogène +++)
55
Listeria sp.
56
Entérobactérie: E.coli et Klebsiella
pneumoniae
• Pathogène:
– Infection urinaire +++
– Abcès abdominaux
– Septicémie
– Infection génitale
– VRB: intubation (nosocomiale)
– Pour Klebsiella pneumoniae: pneumopathie possible
57
Entérobactérie: Salmonella sp.
• Pathogène:
– Contamination par voie oral
– Gastro-entérite
58
Pseudomonas aeruginosa
• Pathogène:
– Opportuniste – chez patients défenses immunitaires basses (nourrissons – personnes âgées –
grands brûlés, …)
– Très importants en milieux hospitalier (infection nosocomiale)
59
Pseudomonas aeruginosa
60
CG+
For Gr GS CLED MC XLD BEA MSA KLIGLER
me am
P L P L P L P X L H P E P M P G L H G
o a o a o a o y a 2 o s o a o l a 2 a
u c u ct u c u l c S u c u n u u c S z
s t s s t s o t s u s n s c t
s s s s s s l s i s
e e e e e e e e
Staph C + + β + + - X - X X X - X + + + +/ +/ - -
. a.
/- - -
Staph C + + γ + + - X - X X X - X + - + +/ +/ - -
. e.
/- - -
Etc. C + + γ + + - X + + + - + + - X + + + - -
Strept C + + α + + - X _ X X X - X - X
. pneu
/-
Les résultats du CLED,MC, XLD et Kligler ne sont pas à connaître car sans objet
dans l’identification des CG+.
Néanmoins, ils seront ensemencés aux TP’s,
BG-
For Gr GS CLED MC XLD BEA MSA KLIGLER
me am
P L P L P L P X L H P E P M P G L H G
o a o a o a o y a 2 o s o a o l a 2 a
u c u ct u c u l c S u c u n u u c S z
s t s s t s o t s u s n s c t
s s s s s s l s i s
e e e e e e e e
E.coli B - + β + + + + + + + - - X - X + + + - +
K.p B - + γ + + + + + + + - - X - X + + + - +
Salm B - + γ + - + - + + - + - X - X + + - + +/
o.
-
Pseu B - + β + - + - + - - - - X - X + - - - -
d.
Les résultats des GS, BEA et MSA ne sont pas à connaître car sans objet dans
l’identification des BG-.
Néanmoins, ils seront ensemencés aux TP’s,
62
BG-
Comment différencier Escherichia coli de Klebsiella pneumoniae??
P L P L P L P X L H P E P M P G L H G
o a o a o a o y a 2 o s o a o l a 2 a
u c u ct u c u l c S u c u n u u c S z
s t s s t s o t s u s n s c t
s s s s s s l s i s
e e e e e e e e
Bacill B + + β + + - X - X X X - X - X + ? ? ? ?
us
/-
Les résultats des MC, XLD, Kligler, BEA, CLED et MSA ne sont pas à connaître car sans objet
dans l’identification des BG+.
Néanmoins, ils seront ensemencés aux TP’s,
Autres du Q1 à ne pas oublier mais qui ne seront pas étudiés biochimiquement cette année:
- Branhamella catarrhalis
- Streptococcus sp. (A, B, …)
Voir bloc 2
- Listeria monocytognenes 64
CG+ je regarde la GS, BEA et
Chapman
1. Gélose au sang hémolyse?
α
γ β
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Confirmation: Confirmation:
- Ne pousse pas sur MC et Enterococcus sp. - Je regarde le chapman:
XLD car inhibé par sels croissance et
Confirmation:
biliaires et CV fermentation mannitol
- Je regarde BEA:
- Diplocoques G+ - Ne pousse pas sur MC
croissance et
et XLD car inhibé par
esculine +
sels biliaires et CV
- amas G+
Staphylococcus epidermidis
Confirmation:
- Je regarde le chapman: croissance et pas de fermentation du mannitol
- Ne pousse pas sur MC et XLD car inhibé par sels65biliaires et CV
- Amas G+
BG- je regarde MC et XLD (kligler
mais pas sur bouillon)
1. Je regarde le Mac Conkey
L+
L-
2. Je regarde le XLD
2. Je regarde le XLD
H2S+ H2S-
Sucre + et H2S-
Confirmation: Confirmation:
Taille moyenne et Muqueuse - Xylose + et - Sucres -
lisse: capsulée LDC +
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
NB: Le kligler peut être utilisé pour différencier 66
E. coli/K. pneumo de Salmo et Pseudomonas
mais ce milieu ne peut s’utiliser qu’à partir de colonies pures sur boîte de Pétri
BG+ je regarde GS
1. Je regarde la gélose au sang
Bacillus sp.
67
Attention!!!
68