Cours

Biotechnologie

Tahar Amrouche
 Rappels
Organisme vivant
=
Système ouvert + Milieu extérieur
Cellule animale

Cellule végétale

Bactérie

Cellule eucaryote
Cellule procaryote
Rappels
Bactérie

Mycètes (moisissures)
Production par voie biotechnologique

Substrat Microorganismes
- Matière première alimentaire Objectifs - Inventaire
- Milieu de culture - Choix des critères
- Tests
- Association de souches

Préparation Préparation
- Complémentation - Culture
- Stabilisation - Revivification
- Texture - Dosage

Bioréacteurs Conditions de la bioréaction

- Choix du type de culture - Choix des paramètres
- Choix du matériel - Choix des régulations
Matériaux - Evaluation des contraintes
Volume, puissance… - Niveau de rigueur
- Niveau d'adaptabilité…

Produit
fini
Production de
biomasse Phases et étapes d’une production
par voie biotechnologique
(Techniques de l’ingénieur F 3 501)
Les biotechnologies
Métabolisme microbien
 Rappels

Besoins + Cycle des éléments

Carbone Azote Eau

Oxygène

Organismes
Hydrogène

Soufre
Phosphore
 Métabolisme
Métabolites complexes

Anabolisme

Dégradation Biosynthèse

Catabolisme

Produits simples
 Métabolisme

Énergie solaire

6 H2O + 6 CO2 C6H12O6 + 6 O2

(Eau) (Gaz carbonique) (Glucose) (Oxygène)

Énergie chimique stockée

sous forme de sucres (molécules réduites)

Organismes photosynthétiques (plantes, algues et certains bactéries)

 Métabolisme
Ensemble des réactions chimiques se déroulant dans un système
vivant (cellule, tissu, organe, ou organisme) et servant à :
- Extraire de l'énergie de la matière organique,
- Construire les molécules
- Éliminer les déchets

Chaque réaction chimique est catalysée par une enzyme

(protéine accélérant la réaction). Les réactions enzymatiques
sont organisées en séquences multi-étapes appelées voies ou
cycles métaboliques formant un réseau interconnecté et
coordonné.

Il y a plus d’un millier de réactions chimiques dans un

organisme vivant.
Métabolisme

Carte du
métabolisme
cellulaire
Catabolisme
Protéines Glucides Lipides

Acides aminés
.
Glucose
. Acides gras + Glycérol
.

Glycolyse

Pyruvate

Acétyl-CoA
NADH
(Nicotinamide adénine dinucléotide)

Cycle de
ATP Krebs
(Adénosine TriPhosphate)

Chaîne respiratoire
Phosphorylation
oxydative
 Catabolisme des lipides

Dégradation des triglycérides (TG)

• Les TG sont des lipides servant de réserve d’énergie et

formés par condensation de 3 acides gras identiques ou
différents sur une molécule de glycérol. Les acides gras sont
des composés à longue chaîne carbonée (10 à 24 C) portant à
leur extrémité une fonction carboxylate : R-COO-. Ils peuvent
être saturés ou insaturés (double liaison).

• Leur dégradation s’effectue par 3 hydrolyses successives sous

l’action de trois lipases différentes.
 Catabolisme des aminoacides/protéines
- Transamination des acides aminés
Transfert de l’azote sur α-Cétoglutarate
par une aminotransférase

R-CH-COO- R-COO-
NH2 O
Acide aminé Cétoacide

COOH-(CH2)2-CH-COO- COOH-(CH2)2-CH-COO-
O NH2
α-Cétoglutarate Glutamate

- Désamination oxydative
NAD+ NADH,H+
COOH-(CH2)2-CH-COO- COOH-(CH2)2-CH-COO-
NH2 O
H2O NH4 +

Glutamate
Élimination de l’azote du glutamate
α-Cétoglutarate
 Fermentation:

La fermentation: une réaction biochimique consistant à libérer de

l'énergie à partir de sucre (ex. du glucose). La fermentation ne
nécessite pas d’oxygène (Pasteur : "la fermentation c'est la vie sans
l'air"), elle peut donc avoir lieu en milieu anaérobie Elle se
distingue, par son faible rendement énergétique, de la respiration
cellulaire, qui nécessite, elle, de l‘oxygène (milieu aérobie). Lors de
la respiration, l'accepteur final des électrons provenant des
cofacteurs réduits NADH, H+ sont transférés à l'oxygène, alors que
dans le cas de la fermentation, les électrons sont transférés à des
composés des voies métaboliques, tels que le pyruvate entraînant la
formation d'acide lactique ou de l'éthanol suivant les organismes et
les conditions de cultures.
Fermentation:

• La fermentation permet à
certaines cellules de
produire de l’ATP en
absence d’O2.
• Certains organismes ne
font que de la
fermentation. D’autres
utilisent les 2 processus.

La fermentation produit seulement 2

moles d’ATP par mole de glucose.
Fermentation

Fermentation lactique
Fermentation

Fermentation alcoolique
Autres fermentations
 Anabolisme

L'anabolisme: ensemble de réactions enzymatiques de biosynthèse

impliquées dans la formation de beaucoup de macromolécules ou
de leurs précurseurs. Ces réactions nécessitent un apport d'énergie
(hydrolyse de l'ATP) et/ou par le pouvoir réducteur du NAD(P)H
et du FADH2:

Molécules simples
(AA, AG, Acetyl-CoA…)
Consommation de l’énergie
Anabolisme

Polysaccharides Lipides membranaires Protéines

 Anabolisme

Niveau d’organisation Exemples

Cellules Bactéries
Algues
Mycètes
Protozoaires
Organites

Systèmes Membranes
Complexes
supramoléculaires
enzymatiques

Acides nucléiques
Macromolécules Protéines
Polysaccharides
Lipides

Monomères ou blocs Nucléotides Acides

de construction amines Sucres
Acides gras

Molécules inorganiques CO2, NH3, H2O, PO43-

 Cinétique de croissance

Croissance microbienne:

Au niveau de la cellule:
Croissance= accroissement ordonné de tous les
composants de la bactérie
Eléments nutritifs absorbés et métabolisés=
augmentation en taille et en volume, puis division
cellulaire par scission binaire.

Au niveau de la population:
Croissance= augmentation du nombre de cellules
microbiennes (ou densité cellulaire).
 Cinétique de croissance
Croissance microbienne=
Consommation du substrat
- Formation de la biomasse
- Production de métabolites
- Dégagement de chaleur.
NB: l’appauvrissement du milieu en nutriments
est suivi de son enrichissement en sous-produits du
métabolisme (toxiques?)

Cinétique de croissance= évolution ou allure des

courbes de croissance
 Méthodes de mesure de
la croissance

Mesure de la croissance microbienne=

- Milieu solide: étude de la croissance est

difficile (agrégation des cellules les unes aux autres)
- Milieu liquide: étude est plus pratique (cellules
dispersées, prises d'échantillons facile)

Mesure de la croissance microbienne=

détermination du nombre de cellules ou mesure
de la biomasse (masse bactérienne).
 Méthodes de mesure de
la croissance
- Détermination du nombre de cellules:

Méthode directe: Numération totale des cellules

au microscope en utilisant des hématimètres (lame
creuse) ou au moyen de compteurs de particules.
Concentration = nombre de cellules/ml de milieu.
Inconvénient: pas de distinction entre les cellules
vivantes et les cellules mortes.

Méthode indirecte: Détermination du nombre de

cellules viables: numération des cellules après culture.
Inconvénient: lente et nécessite du matériel
 Méthodes de mesure de
la croissance

- Mesure de la biomasse:
Plusieurs techniques: détermination du poids sec,
mesure de la densité optique, etc.

Mesure de la densité optique (DO)= la technique la

plus simple, la plus rapide et la plus utilisée.
Mesure de DO= mesurer la lumière absorbée par
une suspension bactérienne (culture liquide) à l'aide
d'un spectrophotomètre (650 nm). (DO est
proportionnelle à la concentration cellulaire).
Inconvénient: pas de distinction entre les cellules
vivantes et les cellules mortes.
 Cinétique de croissance
Courbe (ou cinétique) de croissance = 6 phases:

1 : Phase de latence
2 : Phase d’accélération
3 : Phase de croissance
exponentielle
4 : Phase de ralentissement
5 : Phase stationnaire
6 : Phase de déclin

Les différentes phases de la croissance

microbienne (ou cinétique microbienne)
 Cinétique de croissance

Paramètres de croissance bactérienne:

- Temps de génération (ou G) :

G= temps nécessaire au doublement du nombre de
cellules. Il dépend de l'espèce (ou souche) et des conditions
environnementales
Escherichia coli: G= 20 mn
Lactobacillus acidophilus: G=100 mn

- Taux de croissance (ou μ) :

μ= accroissement de la biomasse obtenu à partir d’un
gramme de biomasse, par unité de temps.
μ élevés(intéressants)= moins de temps pour obtenir une
concentration cellulaire donnée.
 Détermination de G et μ

Lors de la croissance microbienne, on considère que:

Nombre de cellules: 1 2 4 8 16 32 …
Nombre de cellules : 20 21 22 23 24 25 2n
Nombre de générations: 0 1 2 3 4 5 n

Si X est le nombre de cellules au temps t et si X0 est le

nombre de cellules au temps t0, alors X = X0 . 2n
Si n est le nombre de générations et si G est le temps de
génération, alors n = t/G
Si n= t/G et X = X0 . 2t/G ,
alors LnX= LnX0 + (Ln2/G)t

Si LnX= LnX0 + µt, alors µ= Ln2/G et G = Ln2/µ

 Détermination expérimentale
de G et μ

Le taux de croissance (h-1) est déterminé

expérimentalement à partir de la courbe Ln X =
f(temps): le taux de croissance est la pente de la
partie linéaire (phase exponentielle de croissance) de
la courbe
Ln X

Temps
 Détermination expérimentale
de G et μ

La détermination de µ et de G peut s’effectuer

comme suit:
Exemple: soit la courbe de croissance suivante:
 Détermination expérimentale
de G et μ

B:nombre de bactéries à un instant donné

B: nombre de bactéries après un intervalle de
temps t,
Selon la division cellulaire, on a:
b=B x 2n où n est le nombre de génération.
b/B = 2n d’où Log(b/B)= nLog2
n = Log(b/B)/Log2 = 3,3Log(b/B)
G= t/3,3Log(b/B)= 240/3,3Log(107/104 )=24 min

µ peut être estimé selon l’équation suivante :

Ln(b)=Ln(B) + µt, ainsi µ = Ln(b/B)/t
µ = Ln (107/103)/240 = 0,03
 Cinétique de croissance
Croissance microbienne=

- Consommation du substrat
- Formation de la biomasse
- Production de métabolites
- Dégagement de chaleur.

NB: l’appauvrissement du milieu en nutriments

est suivi de son enrichissement en sous-produits du
métabolisme (toxiques?)
 Cinétique de croissance

Phénomène de diauxie (Monod)= courbe de

croissance diphasique (02 phases) obtenue avec
milieux synthétiques à 02 sucres= résulte de la
répression catabolique.

Exemple: milieu contenant du Glucose + Lactose

= glucose utilisé en premier grâce à des enzymes
constitutives; par contre la dégradation du lactose
est sous la dépendance d'enzymes inductibles
(induction est réprimée par le glucose).
= quand glucose épuisé, lactose est utilisé
(nouvelle phase de croissance exponentielle après
un temps de latence intermédiaire).
 Cinétique de croissance
Phénomène de diauxie
 Fermentation

Fermentation (industrie)= culture de

microorganismes (bactéries, levures, moisissures)=
= application du métabolisme microbien (forte
activité enzymatique) pour transformer une matière
en produits à valeur ajoutée (variété de substances
utiles).
Fermentation (métabolisme)= cultures ou
réactions en absence d’air (anaérobiose)
Levure
 Fermentation

Intérêt de la fermentation en biotechnologie= les

microorganismes ont des avantages:

• sont faciles à manipuler (sélection, conservation

des souches, amélioration …);

• sont peu exigeants en nutriments et conditions

de culture;

• leur croissance en culture est rapide.

 Fermentation

Fermenteur ou bioréacteur:
= système contrôlé (milieu liquide) ou se produit
la fermentation
= récipients ou cuves dans lesquels se déroule
une réaction (bio)chimique produite par un agent
biologique (enzymes, cellules) transformant le
substrat en produits d'intérêt.

Fermenteur: permet de réaliser les cultures dans

des conditions stériles, physiquement et
chimiquement contrôlées (température, pH, pO2,
agitation).
 Fermentation
Fermenteur: une cuve dont:
- Rapport Hauteur/Diamètre = 2/5
- Volume variable:
< 50 litres (fermenteurs de laboratoire)
50 à 1000 l (installation pilote/semi-industrielle)
> 100 m3 (cuves industrielles).

Exemple :
La compagnie ICI (Imperial Chemical industries)
produit en grande Bretagne 60 000 tonnes de
protéines/an par culture de Pseudomonas dans un
fermenteur de 2 000 m3 alimenté en méthanol
(source de carbone).
 Fermentation
Paramètres de contrôle d’un procédé
de fermentation
 Fermentation
Critères de conception d’un fermenteur:

- Permettre un bon contact Cellules/substrat en

assurant une distribution homogène de cellules /
substrats / produits .
- Capacité de transférer l’oxygène selon le besoin de
la biomasse cultivée (processus aérobie).
- Faciliter les transferts de chaleur Milieu/Cellules.
- L’aération ou l’agitation ne doit altérer par
cisaillement la biomasse microbienne (fragile).
- Protection contre les contaminations extérieures.
- Les micro-organismes s’attachent aux surfaces
intérieures du bioréacteur
(Bourion, 2000).
 Fermentation

Fermenteurs utilisés à l’échelle de laboratoire (Recherche)

 Fermentation

Fermenteurs utilisés à l’échelle pilote (semi industrielle)

 Fermentation

Fermenteurs utilisés à l’échelle industrielle

 Fermentation
Types de fermentation

S: Substrat X: Biomasse P: Produit

 Fermentation
Types de fermentation

- Fermentation en Batch (en discontinu):

Le fermenteur n’est pas alimenté en continu en
substrat durant la fermentation. Le substrat est
introduit au début de la réaction, en une seule fois:
un lot ("batch "en anglais).

Système en batch= le milieu de culture n’est pas

renouvelé et la croissance bactérienne est limitée (la
phase exponentielle de croissance ne peut durer que
quelques heures).
 Fermentation
Types de fermentation

- Fermentation en Batch (en discontinu):

 Fermentation

- Fermentation en Feed-Batch (batch alimenté)

ou fermentation en semi-continu):

Le fermenteur est partiellement alimenté en

substrat (en solution) durant la fermentation (pas de
soutirage de milieu): le volume augmente = arrêt de
la fermentation lorsque le volume atteint le maximum
(risque de débordement, aération incorrecte, ....).
 Fermentation

- Fermentation en Chemostat (fermentation en

continu: le fermenteur est alimenté en substrat de
façon continu (croissance exponentielle continue)=
alimentation en substrat et un soutirage du milieu
(même débit, volume constant).

Avantages du système: transformation du substrat

de façon indéfinie et l’utilisation de l'appareillage à
plein temps (intérêt économique).
Inconvénients: modification avec le temps des
caractéristiques du microorganisme (ex. mutation de
microorganismes).
 Fermentation
Paramètres d’évaluation Croissance/Production
microbienne

Cas de la culture en batch:

Concentration du nutriment (substrat) est faible=

μ dépend de la concentration du nutriment, mais à
des concentrations élevées, μ est maximal
(multiplication importante)
 Fermentation
Fermentation en batch: production de biomasse,
consommation de substrat et concentration en produits
 Fermentation

Calcul du rendement et productivité

(fermentation en Batch)
- Rendement de production en métabolite
d’intérêt: Yp/s = (Pt – P0) / (S0 – St)
Pt et St : concentrations en produit et en
substrat au temps t
P0 et S0 : concentrations initiales en produit et
substrat
- Productivité: concentration du produit obtenu à
l’heure: P = (Pt – P0) / (t – 0)
Pt: concentration en produit au temps t
P0: concentration initiale en produit
t: temps (h, mn ou s)
 Fermentation

Exemple : Une culture de levure produit après 24

h de fermentation une quantité d’éthanol de 38 g/l
à partir de 80 g/l de glucose utilisé.

- Rendement en éthanol:
Y E/G = (Pt – P0) / (S0 – St)= (38–0)/(80–0)=
38/80= 0,47
Soit donc 0,47 g Ethanol/g de glucose
- Productivité:
P = (Pt – P0)/ (t – 0) = (38 – 0) / (24 – 0)=
38/24= 1,58
Soit donc 1,58 g Ethanol/h
 Fermentation
Contraintes biologiques:

- Nécessité de maintenir des conditions de culture

stériles et d'homogénéiser la température et l'aération
dans un grand volume.
- Utiliser des cultures pures, car les microorganismes
de contamination (étrangers) utilisent la matière
première et même le produit recherché.
- L'amélioration des rendements par emploi de
mutants qui accumulent le produit recherché au lieu
de le dégrader (différents des souches sauvages).
 Production de biomasse

Biomasse microbienne: source de protéines

utilisables en alimentation humaine et animale
= Single Cell Proteins (SCP) ou de Protéines
d'Organismes Unicellulaire (POU).

POU: facilement assimilables et équilibrées dans

leur composition en acides aminés.

Acides nucléiques: leur teneur doit être réduite

pour éviter le problème d’acide urique chez
l’Homme.
 Production de biomasse

Biomasse microbienne: produite en fermentation

industrielle:

- sur divers substrats: mélasses, lactosérum,

céréales, pailles, hydrocarbure, ...

- par de nombreux microorganismes: Candida

utilis, Kluyveromyces fragilis, Fusarium
graminearium…).
Production de métabolites primaires

Acides aminés, acides organiques, alcools et

solvants, carburants, lipides, nucléotides,
polysaccharides, vitamines, pigments.
Exemples de métabolites primaires :
Acides aminés :
- L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-arginine, L-
histidine, L-thréonine, L-valine, L-tyrosine…utilisés en
nutrition humaine et animale.
Acides organiques:
- acide acétique : utilisé en chimie
- acide butyrique : synthèse de polymères
- acide citrique : additif alimentaire, pharmacie
- Acides lactique, malique, tartrique…
Production de métabolites primaires

Ethanol : 80 % de la production mondiale

d'origine biotechnologique.
= biocarburant (ou additif) et élément de départ
d'une nouvelle chimie (en remplacement des
produits pétroliers).

Méthane : biogaz (utilisé en énergie)

Butane 2,3 diol : additifs de carburants diesel
Dihydroxyacétone, Glycérol, etc
Vitamines : Vit. B12, vit. B2, ergostérol …
Polysacharides: xanthane, dextrane, pullulane.
Pigments : β caroténoïdes (industrie alimentaire)
Production de métabolites secondaires

Métabolites secondaires:
- Ne sont pas nécessaires à la croissance
- Ont une grande variété de structure et
d'activités (plusieurs milliers de métabolites IIaires)
- Obtenus par des voies de synthèse propres
- Production généralement limitée à un nombre
réduit d'organismes.

Exemples:
- Antibiotiques, Alkaloïdes, Antidiabétiques,
Anticholestérolémiques, Immunomudulateurs
- Insecticides, Pesticides, Herbicides, etc
 Enzymes
Enzymes: protéines qui catalysent (accélèrent) les
réactions chimiques dans les organismes vivants
(plantes, animaux et microorganismes).
 Enzymes

SUBSTRAT PRODUIT
ENZYME
(Protéine)

ACTION ENZYMATIQUE REACTION ENZYMATIQUE

- Déformation liaison rapprochement
- Microenvironnement
- Formation lien chimique temporaire
dépend de:
- Concentration Substrat
- Concentration Enzyme
- Température, pH, Sels
- Autres: coenzymes, inhibiteurs…
 Enzymes: application dans
l’industrie alimentaire

Enzymes d’origine microbienne= suscitent

beaucoup d’intérêt dans le domaine biotechnologique=
nouvelle source d’enzymes pour l’industrie alimentaire.
Enzymes utilisés: ne sont pas toxiques et ont une
action spécifique.

Contrôle des réactions enzymatiques: ajustement

de la température, du pH ou de la quantité d’enzyme.
 Enzymes: application dans
l’industrie alimentaire

Enzymes utilisés dans l’industrie

alimentaire= différents rôles, mais la
majorité des enzymes sont les
hydrolases qui indiquent l’importance
de l’activité hydrolytique dans le
processus de production des aliments.
 Enzymes glycolytiques

- Enzymes glycolytiques ou
Carbohydrases=
Enzymes qui hydrolysent les liaisons
glycosidiques des polysaccharides et
oligosaccharides.

Amylases=
hydrolysent l’amidon sous forme amylose
(chaîne linéaire de glucose) et amylopectine
(chaîne ramifiée de glucose)
 Amylases
α-amylase (endo-amylase): liquéfaction,
dextrinogénique (hydrolyse de α 1,4 de
l’amylose/amylopectine, mais non pas les liaisons 1,6
(amylopectine)= dextrines.

β-amylase (exo-amylase)= saccharification,

hydrolyse les laisons α 1,4 = unités de maltose.
= hydrolyse totale de l’amylose en maltose, et
partielle de l’amylopectine (dextrine).

NB: Enzymes débranchants: amyloglucosidase,

glucoamylase et pullulanase, sont utilisées pour
hydrolyser les points de ramification (liaisons α1, 6).
 Amylases
Applications:
Amylases: utilisées en panification (boulangerie)=
ajoutées dans la farine à faible activité amylolytique=
produire des sucres nécessaires au développement de
la levure (fermentation de la pâte).
Amylases: employées dans le processus de
production de sirop de glucose à partir de l’amidon.

Sources de production d’amylase: moisissures

(Aspergillus oryzae), bactéries (Bacillus subtilis),
céréales (orge germée).
 Enzymes pectinolytiques

Enzymes pectinolytiques ou pectinases

= rôle dans la stabilité au froid des jus de

fruits (ou concentrés), ainsi que dans la
clarification des vins.

= contribuent à l’obtention de jus de fruits

et de vins d’une bonne couleur, d’une bonne
flaveur et d’une bonne apparence.
 Pectinases
Pectinases
= agissent sur les substances pectiques
(colloïdes): acide (1-4)-D-polygalacturonique
estérifié avec le méthanol.
= action de dépolymérisation
(polygalacturonase ou pectine transeliminase)
ou déestérification.
= Endopolygalacturonase dépolymérise
l’acide pectique alors que exopolygalacturonase
élimine l’unité galacturonobiose à partir de
l’extrémité de la chaîne de pectine.
 Pectinases
Pectine esterase= hydrolyse le methyl ester
de la chaîne de pectine en produisant de l’acide
pectique et de la pectine faiblement estérifié.

Enzymes pectinolytiques commerciales=

mélange de pectine estérase+polygalacturonase
obtenues par la culture de Aspergillus.

= utilisées pour renforcer l’activité

pectinolytique normale des fruits (clarification
des jus de fruits (jus d’orange) et des vins.
 Pectinases
Role des enzymes pectinolytiques =
hydrolyse la pectine soluble et d’éliminer les
propriétés colloïdales

= action accompagnée d’une floculation

rapide des particules indésirables qui peuvent
être éliminées par sédimentation, filtration ou
centrifugation.
 Cellulases
Cellulase= enzyme complexe qui catalyse, avec
ß-glucosidase, la séquence de réactions suivante:

Cellulose (insoluble)

Cellobiose

Glucose
 Cellulases

Cellulases= produites par voie

microbienne: champignons produisant endo-
l,4-ß-glucanase, cellobiohydrolase et ß-
glucosidase.

= utilisées dans l’industrie alimentaire pour

modifier les produits végétaux riches en
fibres, la clarification des jus de fruits et la
production de sucres fermentescibles
(production de bière).
 Autres enzymes glycolytiques
Autres enzymes hydrolysant les sucres sont
utilisées dans l’industrie alimentaire=

Exemple:

- Invertase qui hydrolyse le saccharose (sucrose)

en glucose et fructose

- Lactase scindant le lactose en glucose et

galactose.
 Enzymes protéolytiques
(Protéases )
Protéases= dégradent les protéines par
hydrolyse des liaisons peptidiques =utilisées
dans le processus de transformation des
aliments:
- Attendrissement de la viande: (papaïne).
- Prévenir la formation de troubles dans la
bière à basse température (interaction tanins-
polypeptides)
- Protéases (microbienne):papaïne,pepsine,
etc. sont utilisées contre complexe indésirable
Tanins –polypeptides.
 Enzymes protéolytiques
(Protéases )

- Préparation du fromage
= protéases (présure) sont utilisées pour
hydrolyser les caséines, leur action entraîne la
coagulation ou caillage du lait.

- Préparation du pain
= protéases microbiennes (Aspergillus oryzae,
Bacillus subtilis)= améliore les propriétés
rhéologiques (viscoélasticité) du pain en modifiant le
réseau protéique du gluten par hydrolyse des
liaisons peptidiques.
 Enzymes lipolytiques
(Lipases)

Lipases (Glycérol ester hydrolase)= estérases

ayant pour rôle de rompre la liaison ester en
introduisant une molécule d’eau.
= permettent d’hydrolyser les graisses et huiles
insolubles (triglycérides, diglycérides,
monoglycérides).

Exemple: lipases d’origine microbienne utilisées

dans l’affinage des fromages= permettent de
développer la flaveur du fromage.
Immobilisation des
cellules/enzymes
 Introduction
1960: l’idée de fixer les « catalyseurs biologiques »: les
enzymes puis les micro-organismes a rapidement débouché
sur des applications industrielles.

Théorie: l’immobilisation des cellules microbiennes

présente les avantages suivants :

• accroître la vitesse de réaction en augmentant le

nombre de cellules présentes dans le réacteur.

• éviter la perte du micro-organisme en fin de réaction et

donc avoir la possibilité de le réutiliser.

• faciliter la séparation cellules/liquide= permet soit de

mettre fin à la réaction au temps voulu soit de faciliter les
opérations de clarification en fin de réaction.
 Introduction

Inconvénient:

L’immobilisation cellulaire résulte en des

modifications physiologiques et morphologiques par
rapport aux cellules en suspension (la tolérance aux
produits du métabolisme bactérien et aux produits
de nettoyage).
 Définition
L’immobilisation cellulaire consiste à retenir et
localiser des cellules microbiennes dans un espace
précis du système de fermentation afin d’obtenir de
hautes densités de biomasse active.

Immobiliser une enzyme= inclure la protéine

dans un support (matrice) semi-perméable, qui
empêche l'enzyme de partir tout en permettant le
passage de: substrats, produits, cofacteurs.

Matrice d'immobilisation: non dégradable et

compatible avec les enzymes.
Procédé d'immobilisation: assez doux pour ne pas
dénaturer l'enzyme pendant la préparation
Cellules immobilisées versus cellules libres

Cette technologie, comparativement aux

systèmes à cellules libres, permet d’augmenter la
productivité grâce aux opérations en continu, à la
haute densité cellulaire maintenue dans les
réacteurs et à la réutilisation des biocatalyseurs.

De plus, l’immobilisation cellulaire limite les

risques de contamination, augmente la stabilité
plasmidique
 Intérêt

Applications industrielles des enzymes

immobilisées:

- Production des sucres

- Production d’acides aminés

- Etc.
Immobilisation des enzymes :
Deux possibilités:

- Enzymes libres : ceci nécessite une étape de

purification induisant une perte partielle de
celles-ci, mais est idéale pour des enzymes
sécrétées

- Cellules entières : ceci est simple et idéale

pour des enzymes intracellulaires puisqu'elle
évite les étapes de purification. Cependant, des
réactions parasites peuvent interférer sur le
produit et entraîner sa dégradation.
 Enzymes immobilisées versus
enzymes libres

Enzymes immobilisées permettent

d’obtenir une meilleure stabilité des
enzymes, mais peuvent induire des
problèmes de diffusion et d'accessibilité
au substrat contrairement aux enzymes
libres.
 Immobilisation des enzymes

Matrices utilisées:

- Polymères: agarose, cellulose, dextrane, nylons,

polystyrène... La matrice de polymère est aisément
fonctionnelle et l'attachement de la protéine
s'effectue facilement.

- Matériaux inorganiques: exemple silice: billes de

verre microporeuse et gel de silice, qui peuvent
doter les enzymes immobilisées des propriétés
mécaniques sur la stabilité de pression.
 Immobilisation des enzymes

Alginate: polymère le plus largement répandu

pour les technologies d'immobilisation et de micro-
encapsulation.

= extrait d'algue composé de chaînes alternant

les résidus d'acide L-guluronique et d'acide D-
mannuroniques).
Exemple d’application
Lactase immobilisée
 Avantages et inconvénients

Avantages Inconvénients
Économie d'énergie Problèmes liés à la dénaturation des
enzymes

Haute spécificité enzymatique et

Prix élevé de certaines applications
haute vitesse de réaction
Nécessité de co-facteurs (Ca2+,..) pour
Conditions douces d'utilisation
certaines réactions
(pH, T°C)
Catalyseurs actifs à faibles doses Milieux réactionnels variés induisant des
mécanismes enzymatiques complexes
(Demirel et al., 2004).
Techniques d’immobilisation cellulaire

a. Immobilisation dans des bioréacteurs à

membrane
= coupler un fermenteur à une unité
d’ultrafiltration (ou microfiltration).

= cellules non immobilisées dans une matrice

mais retenues dans le système de fermentation
permettant la diffusion de composés solubles de
petite taille, selon la porosité de la membrane
choisie.
 Techniques d’immobilisation cellulaire

Cellules
microbiennes
confinées

Renouvellement continu du milieu de culture fermenté

= diminuer l’inhibition par les produits du métabolisme
bactérien.

Densités cellulaires 10 fois plus élevées qu’en fermentation

batch classique= éliminer les étapes de concentration de
biomasse habituellement effectuées après la production.

NB: au delà d’une certaine concentration cellulaire, l’activité

métabolique est inhibée.
 Techniques d’immobilisation cellulaire
b. Adsorption à un support préformé
L’immobilisation cellulaire par adsorption à une
matrice préformée ou support solide est basée sur
l’affinité des cellules pour certaines surfaces (les cellules
y adhèrent par le biais d’interactions électrostatiques).

Adsorption= mise en contact du support et des

cellules actives pendant une période définie dans le
bioréacteur.

Support inerte sans agent chimique pour l’adsorption

permet une immobilisation dans des conditions douces
(viabilité élevée des cellules immobilisées).
 Immobilisation par adsorption

Les supports sont plus résistants aux

forces de cisaillement produites par
l’agitation des réacteurs.

Inconvénient:
Vulnérabilité du biofilm faiblement
attaché au support et au détachement
qui peut s’en suivre.

Cellules microbiennes en
contact avec le support
inerte
 Techniques d’immobilisation cellulaire

c. Immobilisation dans des matrices poreuses

Inclure une culture bactérienne dans une matrice

poreuse par la gélification d’une solution de polymère
(agarose, gélatine, alginate…) de grade alimentaire.
Billes de gel sont préférées aux films grâce à leur
géométrie sphérique augmentant la surface.