PHYSIOLOGIE

BACTÉRIENNE
OBJECTIFS :
Connaître :
 les principaux éléments de la physiologie bactérienne

1- les conditions de la croissance

bactérienne:
* nutritionnelles
* environnementales
2 - la croissance bactérienne proprement
dite :
* division bactérienne
* dynamique de la croissance
 leurs implications dans la conduite d’un examen

bactériologique et donc le diagnostic d’une infection

bactérienne
NUTRITION BACTÉRIENNE

Définition
Nutrition bactérienne: c’est l'analyse des
besoins élémentaires, énergétiques et
spécifiques nécessaires au fonctionnement
et à la croissance de la bactérie, ainsi que
des facteurs physico-chimiques
susceptibles de les influencer.
1-LES BESOINS ÉLÉMENTAIRES

L’eau : L'eau représente 80 à 90 p.

cent du poids cellulaire. Il entre dans
la composition de tous les milieux de
culture. C’est une source d’H2 et d’O2

Le carbone : c’est un des éléments les

plus abondant de la bactérie ; il doit
être fourni en quantité suffisante.
• Les batéries capables de se
développer avec le C02 autotrophes.
comme seule source de
carbone

• Les bactéries qui exigent

comme source de carbone
des composés organiques hétérotrophes
préalablement élaborés
(l’acide acétique, l’acide
.
lactique, des sucres divers,
…)
L'azote : les substances azotées entrent dans la
composition des protéines bactériennes.
L’azote peut être fixé par la bactérie :

 Sous forme d’azote moléculaire, c.à.d la forme

la plus simple
Ex : Rhizobium- Azotobacter et certains
Clostridiums
 Sous forme de composés inorganiques :
ex : nitrites ( Nitrobacter) , sous forme de sels
d’ammonium (Nitrosomonas).
 Sous forme de composés organiques: dont les
groupements aminés représentent la source
d’azote
Le phosphore
Le phosphore est nécessaire en tant que
constituant des acides nucléiques et de l'ATP.
Les sources peuvent être minérales ou
organiques.

Le soufre
Le soufre entre dans la composition des acides
aminés, des protéines. Les sources de soufre
peuvent être minérales (S, SO4, thiosulfates,
etc.) ou organiques.
L’O2 et l’H2 : sont apportés par l’eau et par l’air
atmosphérique

- En plus faible quantité sont apportés les éléments

minéraux

 Certaines interviennent dans l’équilibre physico-

chimique de la cellule : Na, K, Mg et Cl
 D’autres constituent les enzymes ou les
coenzymes : Fer des cytochromes.
 A l’état de traces, souvent apportés par l’eau :
on les appelle les oligo-éléments car ils sont
indispensables en quantité infime : Ce sont Ca,
Mg, Co, Cu, Mn
 LES BESOINS ÉNERGÉTIQUES.
Ils couvrent les dépenses engagées dans les processus
catabolisme et de biosynthèse.
02 types d'énergie

Les bactéries chimiotrophes

Les bactéries phototrophes

puisent leur énergie à partir de

composés minéraux ou organiques
utilisent l'énergie lumineuse
pour la photosynthèse
(synthèse d'ATP à partir d'ADP
et de phosphate inorganique).
. Elles utilisent des . Elles utilisent des
donneurs et des donneurs et des
accepteurs accepteurs
d'électrons élément d'électrons élément
minéral : bactérie organique : bactérie
chimiolithotrophe ; chimioorganotrophe.
 Oxydation
AH2 A + 2H+ + 2é + Energie
Donneur d’é Produit oxydé

Réduction
B + 2H+ + 2é BH2
Accepteur d’é Réduit

AH2 + B A + BH2 + Energie

3 -LES BESOINS SPÉCIFIQUES :
Ces substances sont nommées facteurs de
croissance. Ce sont des vitamines, des acides
aminés et des bases puriques et
pyrimidiques.

Les bactéries qui doivent trouver ces

facteurs de croissance dans leur alimentation
auxotrophes.
 Les bactéries qui n'ont pas besoin de tels
facteurs prototrophes.
 Classe du besoin Nature du besoin Type trophique

Rayonnement lumineux Phototrophe

Oxydation de composés Chimiotrophe

Source d'énergie
organiques ou
inorganiques

Minéral Lithotrophe
Donneur d'électrons
Organique Organotrophe

Composé minéral Autotrophe

Source de carbone
Composé organique Hétérotrophe

Non nécessaires Prototrophe

Facteurs de croissance Nécessaires Auxotrophe
 Les bactéries d’intéret médical sont chimio
organotrophes et peuvent être
auxotrophes ou prototrophe
4- FACTEURS INFLUENÇANT LA CROISSANCE

a)La Température
- les bactéries mésophiles dont la croissance
est possible de 10 à 45°C mais ayant une
température optimale de croissance
comprise entre 30 et 37°C et parmi
lesquelles se trouvent la plupart des
bactéries d’intérêt médical,
- les bactéries psychrophiles poussant de -15 à 20°C
(optimum : 5-10°C) (exemple : Listeria
monocytogenes, agent de la listériose, dont la
croissance est optimale à la température des
réfrigérateurs),
- les bactéries psychrotropes températures de
croissance proches de 0°C avec optimum de croissance
proche des bactéries mésophiles. Ex. (: Pseudomonas)

- les bactéries thermophiles poussent de 45 à 70°C,

- les bactéries hyperthermophiles pouvant croître à des
températures > à 80°C.
b) Le pH :
 Neutrophiles :bactéries se développent à pH
compris entre 6 et 8 (exemple : Escherichia
coli)
 Alcalinophiles bactéries développent
préférentiellement à pH alcalin (>8)
(exemple : Pseudomonas).
 Acidophiles dont la croissance est optimale
à pH acide (<6) (exemple : Lactobacillus).
c)La pression osmotique : les bactéries ont une
bonne tolérance générale au sel. Certaines
bactéries dites halophiles nécessitent du
chlorure de sodium (NaCl) pour leur
croissance ; d’autres sont dites
halotolérantes.

d) La pression mécanique ou hydrostatique :

les bactéries ont une bonne tolérance
générale à la pression ; certaines espèces
vivants dans les grands fonds marins
supportent une pression très importantes et
sont dites barophiles.
e) L’oxygène moléculaire
1. Les bactéries aérobies strictes (exemple :
Pseudomonas) nécessitant une teneur en
oxygène moléculaire suffisante pour pouvoir se
multiplier,
 2. Les bactéries micro-aérophiles (exemple :
Campylobacter) se développant uniquement
lorsque la teneur en oxygène moléculaire est
réduite,
 3. Les bactéries aéro-anaérobies facultatives
(exemple : Escherichia coli) dont la croissance
n’est pas affectée par la concentration en
oxygène moléculaire,
 4. Les bactéries anaérobies strictes ne se
développant qu’en absence d’oxygène
 LES MILIEUX DE CULTURE
 Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle
des micro-organismes peuvent se multiplier. Il doit donc
satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme
étudié ce qui implique :
La composition de base de ces milieux comprend :
• des substrats nutritifs : acides aminés, peptides, bases
nucléiques, sucres, …,
• un système tampon assurant la constance du pH
• des sels minéraux,
• des vitamines,
• d’autres facteurs de croissance pour certaines bactéries
dites exigeantes : sang, protéines, hémoglobine,vitamines
supplémentaires.
CLASSIFICATION :
On distingue différents critères de classification
 1- la composition chimique : permet de
distinguer les milieux en 3 groupes
 - Naturels ou complexes : à base d’extraits de
matière organique, afin d’apporter tous les
nutriments nécessaires y compris les facteurs de
croissance
 - Semi-synthétiques : milieu synthétique auquel
on rajoute de l’extrait de levure comme source
de facteurs de croissance
 - synthétiques : qui possède une composition
chimique bien définie. ex : Citrate de Simmons
 2- La consistance : distingue les milieux en 3
groupes, en fonction de la concentration en
Agar du milieu :
 -milieu liquide : ex bouillon de BGT bouillon
gélose tamponé ,flacon d’hémoculture
 milieu solide ou gélosé: ex gélose au sang

 -milieu semi-liquide ou faiblement gélosé :

ex milieu Mannitol-mobilité
 milieu semi-liquide ou faiblement gélosé : ex
milieu Mannitol-mobilité
 3- l’utilisation : on distingue :
 -Les milieux d’isolements

1. les milieux usuels ou de base ex : gélose

nutritive, bouillon nutritif
2. les milieux enrichis ex gélose au sang

3. les milieux sélectifs ou électifs ex gélose

hektoen
 les milieux d’identification ex milieu TSI
 -les milieux de conservation
 -les milieux de transport ex milieu TGV
LA CROISSANCE BACTÉRIENNE

 Définition : C’est l’accroissement ordonné

de tous les composants d’un organisme
 chez les organismes unicellulaires (bactéries,
levures), elle aboutit à une augmentation du
nombre d’individus
 La bactérie se multiplie par fission binaire :
la bactérie grandit puis se divise en deux
cellules filles séparées par un septum de
division formé par la paroi cellulaire. Durant
la division, l'ADN se duplique ainsi que les
autres constituants. Divers systèmes
enzymatiques de synthèse et de dégradation
participent à la division cellulaire.
 La croissance bactérienne est caractérisée
par :
- le temps de génération : le temps requis pour
un dédoublement du nombre de bactéries. Ex
E.coli : TG=20mn, M.tuberculosis=20h
 le taux de croissance comme le nombre de
divisions par unité de temps heure (ex : 3
pour E.coli)
 Au cours de la croissance, le milieu
s’appauvrit en éléments nutritifs disponibles
et s’enrichit en produits du catabolisme,
souvent toxiques
 Des modifications y surviennent, touchant le
PH, le potentiel redox, la pression osmotique
 TECHNIQUES DE MESURE DE LA CROISSANCE BACTÉRIENNE

 a- Dénombrement direct des bactéries : les

bactéries sont considérées comme des
particules que l’on dénombre à l’état frais
ou après coloration
a-1- Numération totale : on utilise pour cela :
L’examen au microscope à l’aide d’une cellule
hématimétique : on compte toutes les bactéries.
.
a-Dénombrement direct des bactéries:
1-Numération totale:
 Examen au microscope à l’aide d’une cellule
hématimétrique.

 Mesure automatisée avec un compteur de

particules. La mesure automatisée avec un
compteur de particules, des bactéries en
suspension dans une solution d’électrolyte : on
compte aussi bien les bactéries que des particules
de même taille
COMPTEUR DE PARTICULES
 La méthode d’épi fluorescence : les
bactéries sont colorées par un flurochrome.
 Cette coloration permet le comptage de
toutes les cellules bactériennes (bactéries
totales) sans distinction les vivantes et les
mortes.
 Méthode d’épi fluorescence :
Echantillon

filtration

coloration/acridine-orange

lumière bleue

Dénombrement Bactérien par

Microscope
à épifluorescence.
 a-2- Numération des cellules viables
 Les bactéries cultivables forment des colonies
sur un milieu de culture approprié : on utilise
la culture en boites de pétri.
 Inconvénient : plusieurs cellules agglomérées
peuvent ne donner qu’une seule colonie.
 De nombreuses cellules isolées ne forment pas
nécessairement de colonie.
 On peut utiliser la technique de filtration sur
membrane, qui concentre les bactéries
présentes en faible quantité dans un
échantillon liquide (ex : Colimétrie des eaux
 b- Mesure de la biomasse :

 b-1-détermination du poids sec :

 Microorganismes récoltées par centrifugation ou par
filtration sur membrane lavage soigneux d’un tampon
approprié culot desséché à 10°C-110°C Poids sec
(gr de matière sèche par litre).
 Inconvénient : toute la masse cellulaire est mesurée. De
plus, c’est une technique longue et délicate.
b-2- Mesure de la densité optique (DO)
On évalué la DO du milieu de croissance en fonction
du temps, à une longueur d’onde donnée. En utilisant
la loi qui définit les relations existant entre les
intensités d’un faisceau lumineux avant et après la
traversée d’une culture bactérienne, on peut évaluer la
croissance bactérienne en déterminant la densité
optique de la culture bactérienne.
b-3- Technique de la Cytométrie en flux : Elle consiste
à mesurer un ou plusieurs paramètres spécifiques d’une
cellule isolée, entrainée par un flux liquide. Cette
technique est couramment appliquée en
hématologie .Elle est encore en cours d’évaluation en
microbiologie
C- Marqueurs chimiques : Il s’agit de dosage des
protéines, DNA, ATP, peptidoglycane
CINÉTIQUE DE LA CROISSANCE
BACTÉRIENNE :
 La croissance d'une bactérie s'étudie en
milieu liquide. Il existe 6 phases dont
l'ensemble constitue la courbe de croissance.
 Phase 1 : Phase de latence : le taux de croissance
nul (µ = 0). La durée de cette phase dépend de l'âge
des bactéries et de la composition du milieu. C'est le
temps nécessaire à la bactérie pour synthétiser les
enzymes adaptées au nouveau substrat (pas de phase
de latence si repiquage sur milieu identique au
précédent).

 Phase 2 : Phase d'accélération : il se produit une

augmentation de la vitesse de croissance.
 Phase 2 : Phase d'accélération : il se produit une
augmentation de la vitesse de croissance.

Phase 3 : Phase de Croissance exponentielle : le

taux de croissance atteint un maximum (µ=max).
Cette phase dure tant que la vitesse de croissance est
constante. Le temps de doublement des bactéries est
le plus court. La masse cellulaire est représentée par
des cellules viables (mortalité nulle).
 Phase 5 : Phase maximale stationnaire : la masse
bactérienne est maximale.
Les nouvelles générations équilibrent les vieilles
bactéries qui se lysent.
 Phase 6: Phase de déclin : le taux de croissance est
négatif (µ < 0). Toutes les ressources nutritives sont
épuisées. Il y a accumulation de métabolites
toxiques. Il se produit une diminution d'organismes
viables et une lyse cellulaire sous l'action des
enzymes protéolytiques endogènes. Cependant, il
persiste une croissance par libération de substances
libérées lors de la lyse (croissance cryptique).
LES MODIFICATIONS DE LA
COURBE DE CROISSANCE

 A-Croissance continue
Dans un milieu non renouvelé, la phase
exponentielle de croissance ne peut durer
que quelques heures. Dans un but industriel,
il peut être nécessaire de prolonger cette
phase en renouvelant constamment le milieu
de culture et en éliminant les produits du
métabolisme.
 b- Phénomène de diauxie

 Il se traduit par une courbe de croissance diphasique. Il est

observé dans des milieux synthétiques contenant au moins
deux sources de carbone Par exemple, dans un milieu
contenant du glucose et du lactose, certaines espèces vont
dans un premier temps utiliser le glucose grâce à des
enzymes constitutives. La dégradation du lactose est sous
la dépendance d'enzymes inductibles dont l'induction est
réprimée en présence de glucose. Lorsque le glucose sera
épuisé, les bactéries utiliseront le lactose et donneront une
nouvelle phase de croissance exponentielle après un temps
de latence intermédiaire
 La dégradation du lactose est sous la dépendance
d'enzymes inductibles dont l'induction est
réprimée en présence de glucose. Lorsque le
glucose sera épuisé, les bactéries utiliseront le
lactose et donneront une nouvelle phase de
croissance exponentielle après un temps de
latence intermédiaire
 5 - les applications de l’étude de la
croissance bactérienne
5-1 Application au dénombrement bactérien

Le dénombrement des bactéries par unité de

volume d’échantillon analysé se fait après culture et
permet d’apprécier la quantité de bactéries viables.
L’ensemencement d’un volume défini d’échantillon
sur milieu de culture gélosé permettra, après dénombrement
des colonies bactériennes obtenues après
incubation, de calculer les bactéries présentes dans
l’échantillon analysé. Le résultat est exprimé en Unités
Formant Colonie par millilitre (UFC/ml).
5.3. Application à l’identification bactérienne
L’identification des bactéries repose sur l’étude de leur croissance
en présence de divers substrats ou étude du métabolisme
bactérien, on peut ainsi étudier le métabolisme protéique ou le
métabolisme glucidique des bactéries par exemple. La
combinaison des différents résultats obtenus permet de définir le
profil métabolique de la bactérie analysée ce qui permet
de l’identifier.
 5-3. Application à la détermination de la sensibilité /
résistance bactérienne aux antibiotiques

L’étude de la croissance bactérienne en présence de différents

antibiotiques permet de définir pour chaque bactérie analysée un
profil de sensibilité /résistance aux différentes molécules
antibiotiques.
METABOLISME BIOCHIMIQUE BACTERIEN
 Objectif: L'étude du métabolisme bactérien
permet de définir des caractères d'identification
biochimique qui représentent des critères
essentiels dans la classification (ou Taxonomie)
bactérienne.
 1- Définition :
 Il est défini comme l'ensemble des
transformations chimiques (réactions de
biosynthèse et de dégradation), qui assurent
l'élaboration des constituants bactériens et leur
fonctionnement.
Il comprend des réactions:
 De dégradation de substrats (catabolisme)
 De biosynthèse de substrats (anabolisme).

Ces deux types de réactions nécessitent

l’intervention de catalyseurs qui sont des
enzymes.
 Les réactions cataboliques: permettent à la
bactérie de convertir les aliments
( Protéines , Lipides , Polysaccharides) en
molécules organiques simples ou
métabolites intermédiaires + énergie.
 Les réactions anaboliques: C’est la
biosynthèse à partir de ces molécules
simples de macromolécules intervenant dans
la structure et le fonctionnement bactérien
.
L’énergie utilisée dans ces biosynthèses
provient du catabolisme .
 NUTRIMENTS

Métabolisme
ATP
Mouvements énergétique
Mouvements
cellulaires moléculaires

Divisions cellulaires Anabolisme :

molécules néosynthétisées

Production de biomasse Production de métabolites

LE MÉTABOLISME
ÉNERGÉTIQUE
d’une bactérie chimioorganotrophes est constitué
d’une suite de réactions REDOX partant d’un
substrat organique .
avec libération d’énergie.
Le composé organique peut être:
 Un hydrate de carbone ( surtout le glucose+++)
source la plus importante d’énergie
 Un acide aminé
 Un acide gras
 Un alcane
 Une base purique ou pyrimidique
 REACTION D’OXYDO-REDUCTION
Oxydation
AH2 A + 2H+ + 2é + Energie
Donneur d’é Produit oxydé

Réduction
B + 2H+ + 2é BH2
Accepteur d’é Réduit

AH2 + B A + BH2 + Energie

 L’énergie produite au cours du catabolisme par le
biais de réactions EXERGONIQUES est emmagasinée
dans des molécules d’ATP grâce à des réactions dites
ENDERGONIQUES (absorbent l’énergie)
ou immédiatement consommée dans une réaction qui
nécessite de l’ATP, Pour éviter toute perte d’énergie
sous forme de chaleur.
a-La respiration
b-La fermentation
 Métabolisme énergétique

LES CHIMIOORGANOTROPHES : LES

RESPIRATIONS
O2 NO3- SO42-
Oxydant 2
2H+ + 2e- Y Chaînes de transporteurs d'e- et d'H+
Chaîne
respiratoire
Réducteur 2
YH2 H2O N2, NH4 H2S

RESPIRATIONS aérobie nitrate sulfate

anaérobie
NATURE DE L'OXYDANT
minéral = organique
= Oxydant 2
(O2, NO3 ,...)
-
Y
2H+ + 2e-

Réducteur 2
YH2

RESPIRATION FERMENTATION
 A-La respiration (lieu membrane
cytoplasmique)
 C’est la consommation d’oxygène moléculaire,
elle correspond à une série de transfert d’électrons
jusqu'à un accepteur final qui est l’oxygène
moléculaire (O2) et a une synthèse concomitante
d’ATP.

L’acide pyruvique sera transformé en Acétyl coa par

décarboxylation oxydative, on a 2 étapes :
Cycle de Krebs :
glucose
 La chaîne respiratoire :
C’est une chaîne cytochromique de transfert
des électrons à laquelle sont associées des
phosphorylations oxydative, avec libération
d’une grande quantité d’énergie
Les composants de la chaîne sont :
NAD - Flavoproteines (FMN et FAD) -
coenzymes -Cytochromes
 Glucose (C6H12O6) ATP CO2

Réducteur1 XH2 Oxydant1 X

glycolyse+cycle de Krebs

T TH2
Réducteur2 membrane cytoplasmique Oxydant 2
H2O, (H2O2) Chaînes respiratoires O2

T : coenzyme oxydé ATP

 B-Fermentation et voies fermentaires :
(cytoplasmique)
 Elle a lieu en anaérobiose.
 C’est un processus d’oxydoréduction, mais les
accepteurs finals d’électrons sont des composés
organiques.
 L’énergie est produite par Phosphorylation au
niveau du substrat. Elle est nettement moindre que
la respiration.


A/- LA FERMENTATION ACIDES
COMPLEXES

 C'est le type de fermentation le plus

répandu chez les bactéries.
 Elle peut se présenter sous 2 formes
possibles:
1)- Fermentation acides mixtes : caractéristique des
bactéries dites
« VP - » « RM + »
 les produit finaux de cette fermentation sont :
l’ethanol et différents acides : acide lactique,
méthanoïque , acétique et succinique (d'où son nom !)
(ex.: Escherichia coli, Salmonella, . . . ).
Fermentation acides mixtes
2)- Fermentation butanediolique : Caractéristique des
bactéries dites «VP + »
 Le produit final de cette voie est le 2,3-butanediol
(produit neutre)
B/- Fermentation alcoolique réalisée par:
 Les levures (fabrication de vin, bière et pain).
 Les champignons.
 Les cellules végétales.
C/- Fermentation lactique : On distingue 3 modèles:
 Fermentation Homolactique : retrouvée chez les
Streptocoques : C'est une fermentation sans
production de gaz et s'accompagnant d'une
diminution importante du PH du milieu.

 Fermentation Hétérolactique: retrouvée chez les

Lactobacilles, Comprend une production
importante de CO2 et un PH bas.
NB: à la base de fabrication de yaourt et fromages
 Fermentation Aceto-lactique: retrouvée chez des
bactéries du genre Bifidobacterium,
s'accompagne de la production d'un mélange
d'acide lactique et acétique.
D/- Fermentations des bactéries anaérobies
strictes : (fermentation butyrique des Clostridies)
 Elle se caractérise par une odeur nauséabonde due
au butyrate.
Glucose ——> 2 Acétate + 3 Butyrate + 8 CO2 + H2
 EXPLORATION DU METABOLISME
BIOCHIMIQUE:
*Le but de toute analyse bactériologique que
ce soit d'un prélèvement pathologique ou
autre est l'identification du ou des germes
qui s'y trouvent
 1) On ne doit entamer l'identification d'une
bactérie que si l'on a une souche à l'état pur,
c'est-à-dire constituée par un seul clone
bactérien.
Toutes étude biochimique effectuée sur un
mélange de germes n'a aucune valeur.

*Nous Ne pouvons en pratique courante étudier

tous les caractères d'une bactérie, il faut se
limiter aux caractères principaux qui
permettent une identification rapide et sure.
 ETUDE DU MÉTABOLISME
RESPIRATOIRE
Rapport des bactéries avec l'oxygène:
Étude du type respiratoire

On distingue essentiellement 4 types de bactéries en

fonction de
leur rapport avec l'oxygène de l'air :

- aérobie strictes.
- micro aérophiles.
- apéro- anaérobie facultatives.
- anaérobies strictes.
Le milieu d'étude type est de la gélose viande foie (V.F).

- au moment de l'emploi, régénérer le milieu en plaçant les tubes

15 mn au bain-marie bouillant pour en chasser l'O2.

- refroidir a 45-50 C puis inoculer a laide de pipette pasteur,

préalablement trempée dons une culture en milieu liquide
jusque au fond du tube puis remonter en décrivant des tours de
spires très serrés.

-Incuber a 37C pendant 18 à 24h.

(2) ÉTUDE DES ENZYMES RESPIRATOIRES:

3 enzymes respiratoires sont couramment recherchées

-Oxydase.

-Catalase

-Nitrate réductase
A) RECHERCHE DE L'OXYDASE
Les derniers stades de la respiration cellulaire oxydative fait
intervenir les cytochromes dont seul le dernier maillon, le
cytochrome oxydase réagit directement avec l'oxygène.

Touts les germe aérobies et aérobies facultatifs possèdent une

cytochrome oxydase,

Toutefois sa mise en évidence par la technique utilisée n'est possible

que si le germe possède en même temps le cytochrome.

-l'indicateur employé est la N. dimethyl-para phenylene diamine qui

est oxydée et donne une semi quinine colorée en rouge
Technique:

Prendre un disque de papier buvard déjà

imprégné du réactif ; l'imbiber d'un peu d'eau
physiologique à l'aide d'une pipette pasteur
fermée ou de l'anse de platine , prendre un peu
de culture à partir d'une culture en milieu
solide, la déposer sur le disque :
 

coloration rose violacée oxydase + si pas de coloration oxydase –

B) RECHERCHE DE LA CATALASE

Cette enzyme dégrade l' H2O2

Elle est capable de décomposer l'eau oxygénée selon la

réaction
Technique :
-Déposer une goutte d'eau oxygénée sur une
lame
-Prélever dans la zone d'asepsie une colonie à
l'anse de platine
-Déposer la colonie dans la goutte d'eau
oxygénée.

Si la bactérie possède une catalase, on aura un

dégagement d' O2 sous forme de bulle donc :
Réaction + dégagement de bulles Réaction - pas de dégagement de bulles
C) RECHERCHE DE LA NITRATE
RÉDUCTASE
Au cours de ce test, on recherche la production d’une enzyme :la
nitrate-réductase par la bactérie. Cette étude va donc consister à
mettre en évidence le métabolite nitrite ou la disparition des nitrates
initiaux.
La réduction des nitrates par la nitrate réductase se traduit par la
production de nitrites. Parfois, certaines bactéries peuvent
poursuivre cette réduction , jusqu’à une dénitrification.

Nitrate reductase dénitrification

NO3- NO2 N2
Nitrate Nitrite Diazote
* Coloration rouge:
transformation des nitrates en
nitrites par le zinc. La
bactérie ne possédait pas cette
enzyme. Résultat NR-
* Pas de coloration: les nitrates ont
été transformés par la bactérie au
delà des nitrites. La bactérie
possède cette enzyme. Résultat
NR+
 II- ETUDE DE L'UTILISATION DE DIVERSES SOURCES DE CARBONE:
On utilise un milieu synthétique contenant des sources de carbone et
d'azote bien définie. On ensemence la bactérie à étudier sur ces
milieux.

-s'il y a culture bactéries utilise le substrat étudié comme

source d'énergie
-s'il y a absence de culture bactéries n'a pas pu synthétisé ses
métabolites essentiels à partir du substrat étudié

Le milieu utilisé est le milieu de citrate de Simmons( source d'azote est

le phosphate d'ammonium et la source de carbone est le citrate de
sodium, l'indicateur de coloration est le bleu de bromothymol, le
milieu est vert) .

Le milieu doit être ensemencé à partir d'une culture prélève sur gélose.
Lecture:

S'il y a culture, l'acide citrique (triacide) est transformé

en diacide par décarboxylation oxydative ce qui
entraîne une élévation du PH et donc virage de
l'indicateur dans la zone de culture.
Si pas de virage au bleu / pas de Si on a virage au bleu / culture
culture citrate – citrate +
III-ETUDE DES REACTIONS
CATABOLIQUES:
III- 1-METABOLISME DES GLUCIDES :
a) Étude des différents sucres:
Différents milieux peuvent être utilisés , il sont
additionnés du ou des sucres à étudier +un indicateur
de PH coloré, il existe des milieux :
-liquides: eau peptonée ou bouillon nutritif +sucre
+indicateur, ces milieux sont ensemencés avec
quelques gouttes de suspension
-solides, ce sont des milieux dont la composition varie
avec les exigences des germes.
L'ensemencement se fait en surface
Lecture: après 18h d'incubation, une réaction positive se
traduit par une coloration jaune et une réaction
négative par une coloration rouge( si l'indicateur est du
rouge de phénol)
b) Étude de la voie d'attaque des glucides

les bactérie attaquent les sucres soit par vois

Oxydative

Fermentaire

Ou les 2 à la fois
Le milieu utilisé: MEVAG qui contient le sucre a étudier
+ rouge de phénol, le milieu se présente en culot. Au
moment de l'emploi régénérer les deux tubes, laisser
refroidir puis pour chaque souche ensemencer deux
tubes solidifiés par piqûre centrale à partir d'un
bouillon

Mettre en évidence le rôle de l'O2 en recouvrant un des

deux milieux glucosés avec de la vaseline stérile
fondue. Incuber à 37°c pendant 18-24h.
- si la partie supérieure du tube sans huile est acidifiée, le germe est oxydatif.
-s'il y a acidification des deux tubes, le germe est fermentaire.
- si aucun des 2 tubes n'est acidifié, la souche est inactive, elle n'utilise pas
le sucre employé
c) détermination de la voie fermentaire:
La mise en évidence de la voie fermentaire empruntée
par un germe est très importante pour son diagnostic,
les deux voies que l'on recherche le plus souvent sont:
-voie des acides mixtes : mise en évidence par le test RM
(rouge de méthyle)
-voie butylène-glycol : mise en évidence par la réaction
de Voges Proskauer (V.P)
Le milieu utilisé est le milieu de Clark et Lubs qui
est ensemencé et incubé à 37° pendant 24h. Après
incubation on repartit le milieu dans deux tubes,
Dans le premier tube on ajoute quelque goutte de
RM (rouge de Méthyle)
- Dans le 2eme tube on ajoute une goutte d'alpha
naphtol (VP1) et 2 gouttes de KOH (VP2)
- coloration rouge : VP+
- pas coloration : VP- coloration rouge : RM+
coloration jaune : RM-
d) Etude des enzymes intervenant dans la dégradation
des sucres:

L'enzyme la plus couramment recherchée est la Beta-

Galactosidase responsable de la dégradation du lactose
Principe : certaines bactéries"lactose –négatif"- ne
possèdent pas toutes les enzymes nécessaires à la
dégradation du lactose et notamment lactose-perméase.

Ces germes sont cependant potentiellement capable

d'hydrolyser le lactose ou un galactoside artificiel
Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside (ONPG) ,
l’Ortho-Nitro-Phénol libéré colore le milieu en jaune.
Technique: une anse pleine de culture bactérienne
prélevée sur un milieu lactosé est mise en suspension
dans H2O physiologique.
On ajoute des disque de papier buvard imprégnés de
réactif.
On incube à 37°c pendant 24 h
Une réaction +( ONPG + ) : coloration jaune: présence
d'une Beta-galactosidase
Une réaction – (ONPG - ) : pas de coloration jaune
ONPG- ONPG+
e) Milieu de diagnostic rapide

Ce sont des milieux sucrés complexes qui permettent une

orientation rapide du diagnostic, en fournissant
plusieurs caractères biochimiques.
TSI
Il est composé essentiellement du 3 sucres : glucose,
lactose, saccharose, contient également du sulfate
ferreux et des thio-sulfate et du rouge de phénol, le
milieu est donc rouge
On ensemence en stries serrées la pente puis par piqûre
central le culot.
Les tubes à vis ne sont pas vissée à font pendant
l'incubation
Ensemencement 1) Stries serrées sur la pente

2) Piqûre centrale dans le culot

Fil droit ou pipette boutonnée
La lecture se fait au bout de 24h d'incubation. Ce milieu
permet la recherche de 5 caractères:

- fermentation du glucose

- fermentation du lactose saccharose

- production d'H2S due à la réduction du thiosulfate qui

donne des sulfures de fer noir

- production de gaz
*lecture au niveau du culot:
-fermentation du glucose: virage au jaune s'il y a
fermentation
- production de gaz: décollement de la gélose
- production d' H2S : noircissement du milieu
* lecture au niveau de la pente
-lactose- saccharose- : pente rouge
- lactose- saccharose+ :pente jaune
* production de gaz :
KIA: dont la composition est identique à celle du TSI
mais il contient que 2 sucres: glucose, lactose, utilisé
pour les germes saccharose +
Milieu mannitol mobilité:

- contient du mannitol, nitrates et du rouge de phénol (le

milieu est donc rouge)
- Présenté en culot, Avant d'ensemencer régénérer la
gélose, pour en chasser l'oxygéné qui risque de fausser
la lecture de la mobilité, laisser refroidir puis
ensemencer par piqûre central jusqu'au font du tube,
Incuber à 37°c pendant 24 h
Mannitol- Mannitol+ Mobi + Mob-
III- 2- METABOLISME DES PROTIDES

1- Etude de la dégradation des acides aminés (a a)

a) Recherche de l'uréase, de la tryptophane désaminase et
tryptophanase:
Le milieu utilisé est le milieu de Ferguson qui contient de la
tryptophane et rouge de phénol, le milieu est jaune-orangé
Le milieu est ensemencé richement à l'aide d'une culture prélevée sur
TSI incuber à 37°c pendant 24h
Ce milieu permet la détermination de 3 caractères Urée
TDA
Indole
-Recherche de l'uréase: Urée amido-hydrolase:
Urée+ H2O CO2+NH3
HN3 provoque l'alcalinisation du milieu
lecture:
-si le germe produit l'Uréase, le milieu devient alcalin et
vire au rouge violacée
- dans le cas contraire, le milieu reste inchangé
Urée - Urée +
- Production d'indole ( Tryptophanase):
Certaines bactéries possédant une tryptophanase ,ensemencées en
milieu riche en tryptophanase elles dégradent celui-ci en
provoquant la formation d'indole,
l'indole formé est mis en évidence par para- dimethyl-
aminobenzaldehyde en solution dans l'alcool amylique, en
milieu chlorhydrique ( réaction de Kovacs) qui prend en
présence d'indole, une coloration rouge :
après addition du réactif anneau rouge a la surface
- la recherche de l'indole peut se faire aussi en eau peptonée
exempt d'indole.
Indole - Indole+
- Recherche de la TDA:
les germes possédant cette enzyme, conduisent par
désimination oxydative du tryptophane, a la formation
d'acide pyrivique qui est mis en évidence par
coloration brune qu'il donne avec du perchlorure de fer
- Si couleur rouge brun : réaction +
- Si couleur jaune : réaction -
2- Recherche des décarboxylases:
Les bactérie dégradent les ( L. lysine, L.
ornithine, Ac glutamique, L.arginine) en
empruntant des voies multiples qui, toutes
aboutissent pratiquement à la libération de
NH3 ou d'amine alcalin
Le milieu utilisé est le milieu de Moeller-
Falkow qui contient l'acide aminé à étudier,
contient également du glucose et du
bromocrézol d'ou la coloration violette du
milieu.
L’ensemencement ne se fait à partir d'une suspension en
eau physiologique à raison de 3 à4 gouttes
Recouvrir la surface du milieu de quelques gouttes
d'huile.

-Dans un 1er temps, les bactéries vont fermenter le

glucose, le milieu en s'acidifiant devient jaune.
-Dans un 2eme temps, si les enzymes bactériennes sont
sur les a.a ,il y a formation de substances fortement
alcalines qui font virer au violet l'indicateur de PH

Lecture: coloration violette: réaction +

coloration jaune : réaction -
Il faut toujours faire en parallèle un témoin sans a.a, celui
ci doit être après incubation jaune. sil n'a pas de
virage , la bactérie n'a pas cultivé sur ce milieu ou n'a
pas utilisé le glucose, la réaction est sans valeur: ne
peut être interprétée
 1er : Au départ, tous les
tubes sont «couleur
violette»

2ème temps:
Acidification de tous les
tubes par attaque du
glucose: Tous les tubes
virent au «jaune»

3ème temps: Décarboxylation

et libération de catabolites
alcalins d’oùvirage au bleu
violacé-le tube témoin reste
jauneLecture : tube jaune:
négatif tube violet:
positif1ertemps
3- recherche de la désulfhydrase par mise en évidence
de H2S forme
Certains Bactéries attaquent les a a soufrés en produisant
de H2S qui est mis en évidence par formation , en
présence des métaux lourds d'un sulfure noir, ou sur
milieu TSI se traduit par une coloration noir.
4- Recherche des enzymes protéolytiques:

La gélatinase est l'enzyme responsable de l'hydrolyse de

la gélatine. les bactéries qui sont pourvues liquéfient
la gélatine Plusieurs technique peuvent être utilisées
pour déceler l'hydrolyse de la gélatine. la plus utilisée
est la méthode du film photographique
Principe :
Cette méthode, encore plus simple et plus rapide,
consiste à utiliser du film photographique qui composé
d'une couche fine de sels d'argent dans la gélatine
déposée sur un support transparent.

Prendre un film vierge, l'exposer a la lumière et le

développer, il est noir. découper en languettes qui se
conservant indéfiniment.
Technique:

Pour rechercher la gélatine, faire une suspension épaisse

laiteuse de bactéries dans 0.5 ml environ d'eau
physiologique.

Placer une languette de film dont une partie seulement

immergée

Boucher le tube pour éviter l'évaporation et le placer à

l'étuve ou ,au bain-marie à 37°c
Si la culture possède une gelatinase, le support
transparent de la part immergée du film est mis a nu et
les sels d'argent tombent au fond du tube.
III-3- METABOLISME DES LIPIDES ET
DES LIPOPROTEINES

-recherche des lipases :

Les lipases sont des enzymes qui hydrolysent les esters
d'acide gras à longue chaîne carbonée. . les esters
d'acide gras les plus utilisée pour la mis en évidence de
l'existence des lipases, sont les Tween ( esters de
sorbitol et d'acide gras)
Technique: technique de Sierra
L'acide libéré est mis en évidence par précipitation sous
forme de sels de calcium insolubles, ce qui provoque
l'opacification du milieu gélosé au tour des colonies
2- recherche des lecitinase;
les licithinases ou phosphalipases sont des enzymes de
dégradation des lécithines .la lécithine la plus
utilisée est celle du jaune d'œuf.
Le milieu utilisé est la gélose nutritive au jaune d'œuf, on
ensemence par point, incuber à 37°c pendant 24h

une réaction + se traduit par l'opacification du milieu