Croissance des microorganismes

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 Plan
Introduction
1. Courbe de croissance
2. Paramètres mathématiques de la croissance
exponentielle
3. Influence de l’environnement sur la croissance
4. Mesure de la croissance microbienne
5. Contrôle de la croissance microbienne

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 Introduction
• Croissance =  des constituants cellulaires puis  du
nombre de cellules
– Scissiparité  2 cellules filles de tailles +/-
– Bourgeonnement égales

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• Environnement adéquat sinon vitesse de croissance
 voire stoppe
– H2O
– Source adéquate de nourriture
– Source d’énergie
– pH optimal Facteurs interactifs
– Température optimale
– Teneur appropriée en O2

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 1. Courbe de croissance
• Etude de la croissance d’une population
• En batch (milieu liquide/fermé)  quantité
d’éléments nutritifs  et [déchets]  avec le temps
• Evolution du log10 du nombre de µO viables en
fonction du temps
• 4 phases (5)

http://www.aquoa.net/spip.php?article13

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 1.1. Phase de latence

• Synthèse de nouveaux composants cellulaires avant

division (ATP, ribosomes, nouvelles enzymes)
• Durée variable et dépendante de :
– L’âge et conservation des cellules
• D’autant + longue que l’inoculum est âgé ou froid
– L’adaptation de la souche au milieu
• Allongement si nécessité de synthétiser les enzymes
adaptées au nouveau milieu
– Le volume de l’inoculum
• Plus le rapport Vol inoculum / vol milieu est grand, plus
la phase de latence est courte
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 1.2. Phase de croissance exponentielle

• Développement et division à V max. constante

• Pente de la courbe = taux de croissance (k)
• k dépendant de:
– [facteur limitant]
• k proportionnel à la [ce facteur]
– La température
• k maximal à l’optimum thermique
• De courte durée (quelques divisions) si milieu limité
ou naturel
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 1.3. Phase stationnaire

• Nombre de cellules constant (~109 bactéries/ml)

– Equilibre entre divisions cellulaires et mort ou
– Plus de division mais cellules métaboliquement actives
• Raisons
– Diminution/disparition d’un ou plusieurs nutriments (ou O2
si aérobies)
– Accumulation de déchets métaboliques toxiques
– Les 2!

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 1.4. Phase de mortalité
• Plus de division et mort
• Mort logarithmique  taux constant
• Phase de cannibalisme (phase 5)
– Lyse des cellules  libération de substances (aa,…) 
nutriments pour les survivants  regain de croissance 
taux mortalité 

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 2. Paramètres mathématiques de la croissance
exponentielle
• Temps de génération (g) = temps de doublement =
temps pour que la population double
• n = nombre de générations (divisions)
• Taux de croissance = k = vitesse de croissance = n/t =
constante et max. en phase expo.
• k = 1/g
• Population après n générations = 2n

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 Exemple

• E. coli
• 1 cellule au départ
• g = 20 minutes
• k = 1/g = 1/20 min ou k = n/t = 3/heure
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• Population après 4 générations = 24 = 16 cellules
3. Influence de l’environnement sur la croissance

• Croissance des µO influencée par la nature chimique

et physique de l’environnement
– Température
– pH
– Solutés et activité de l’eau (aw)
– Gaz
– Radiations

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 3.1. Température
• µO unicellulaires très sensibles car
t° interne varie avec t° externe
• Influence de la t° sur
– Activité des enzymes (thermosensibles)  métabolisme et
donc multiplication influencés
– Solidification ou fluidification membranaire

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 3.1. Température (suite)
• 3 températures définies pour chaque espèce =
températures cardinales (variables selon autres
facteurs...)
– Minimum
– Maximum
– Optimum (+ proche de la t° max. que de la min.)
• Sténothermes : échelle de t° de croissance étroite
(ex : N. gonorrhoeae)
• Eurythermes : très large (E.
(ETC faecalis)

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http://www.uwyo.edu/virtual_edge/lab06/environ_temp.htm
 3.1. Température (suite)
• 6 classes, en fonction de l’optimum
– Psychrophiles: 10-15°C (-5°C  20°C)
• Ex. : Pseudomonas, Vibrio, Bacillus, …
– Psychrotrophes: 20-30°C (0°C 35°C),
• Ex.: µO dégradant les aliments réfrigérés (Pseudomonas)
– Mésophiles: 37°C (15-20°C  45°C)
• Ex.: agents pathogènes humains
– Thermotrophes: 30°C ( 50°C)
– Thermophiles: 55-60°C ( 45°C  80-100°C)
• Ex : µO du compost, conduites eau chaude…
– Hyperthermophiles: 80-110°C (55°C  113°C)
• Ex.: bactéries des zones chaudes des fonds marins
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 Croissance des µO/t°

http://deltabiology.com/2011/temperature-requirements-for-bacteria/

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 3.2. pH
• 3 classes:
– Acidophiles: optimum entre 1 et 5.5
– Neutrophiles: optimum de 5.5 à 8
– Alcalophiles: optimum entre 8.5 et 11.5
• La plupart des pathogènes hû: 7.2 - 7.6 (6  8)

http://www.industrie-agroalimentaire.net/programme-du-
concours-inspecteur-dgccrf/biologie-et-
17
microbiologie/metabolisme-microbien/croissance-microbienne/
 3.2. pH (suite)
• Variations importantes
 Destruction de la membrane plasmique
 Inhibition de l’activité des enzymes
 Inhibition de l’activité des protéines de transport
 Altération de l’ionisation des molécules de nutriments 
 la disponibilité
• Systèmes régulateurs (échange de potassium contre
des protons)
• Déchets métaboliques acides ou basiques  ajout
de tampons aux milieux de culture (ex.: milieu U-I)

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 Milieu urée-indole
• Composition (/L)
– L-Tryptophane 3,00 g
– Phosphate monopotassique 1,00 g
– Phosphate dipotassique 1,00 g
– Chlorure de sodium 5,00 g
– Urée 20,00 g
– Rouge de Phénol à 1% 2,50 ml
– Alcool à 95% 10,00 ml
pH~6,7

http://mcavalla.free.fr/galerie/picture.php?
cat=10&image_id=85
19
 3.3. Solutés et activité de l’eau (aw)
• Membrane plasmique perméable sélective 
!! concentration osmotique du milieu
(importance des inclusions)
– Si plasmolyse inactivation du métabolisme, ≠ divisions
– Concentration osmotique  degré de disponibilité de
l’eau  activité de l’eau, aw
– Osmotolérants: très large gamme d’aw (ex. : Sta. aureus)
– La plupart : aw = 0.98 ( aw  conservation)
• Halophiles: concentrations élevées en NaCl

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 3.4. Gaz
• O2
– Aérobies stricts: O2 obligatoire
– Anaérobies facultatifs: O2 pas nécessaire mais poussent mieux si
présence  respiration aérobie
– Anaérobies aérotolérants: ignorent l’O2  fermentation ou
respiration anaérobie
– Anaérobies stricts: ne tolèrent pas l’O2  mort  respiration
anaérobie
– Microaérophiles: faible quantité O2 (2-10%) sinon endommagés
• CO2
– Capnophiles (Capnocytophaga canimorsus)

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Détermination du type respiratoire

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 Toxicité de l’O2 réduit
• H2O2  destruction des constituants cellulaires
– Catalase
• 2H2O2  2H2O + O2
– Peroxydase
• H2O2 + NADH + H+  2H2O + NAD+

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http://iws2.collin.edu/dcain/CCCCD%20Micro/catalase_test.htm
 Culture des anaérobies strictes
• ≠ catalase et ≠ peroxydase  absence d’O2
– Thioglycolate ou cystéine et milieu bouilli  croissance en
profondeur
– Pompe à vide  enlève l’air
• Remplacement de O2 résiduel par N2
• Ajout de CO2 pour une bonne croissance
– Jarres : réactifs + catalyseur  H2 (+1/2O2) H2O

http://www.inra.fr/la_science_et_vous/apprendre_experiment
er/monde_microbien/comment_fonctionnent_les_microorgani
smes 24
 Jarre d’anaérobiose

http://apoptosis.persianblog.ir/page/20
25
 3.5. Radiations
• Rayons X et γ ionisants (λ courte et haute NRJ)
– Faible dose  mutations
– Haute dose  mort
• Lumière (UV)
– Dommageable pour la plupart des µO non
photosynthétiques
 croissance en l’absence de lumière (étuve)

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 4. Mesure de la croissance microbienne

4.1. Nombre de cellules

4.1.1. Comptage direct  microscopie, épifluorescence, automates
4.1.2. Comptage indirect  milieux solides
4.2. Masse cellulaire
Mesure de la turbidité
4.3. Mesure de l’activité bactérienne
4.3.1. ATP : ATPmétrie
4.3.2. CO2
4.3.3. O2
4.4. Biologie moléculaire
 4.1. Comptage du nombre de cellules 4.1.1.
Comptage direct

• Microscopie classique
– Cellule de Thoma, Malassez, Petroff , Burker
• Creux : profondeur connue
• Fond quadrillé : surface connue
 volumes précis délimités au niveau des carrés
• Comptage de 10 petits carrés minimum
• Expression/ml de suspension
• Seuil minimum!!

http://blinks.free.fr/d_2e/planete_Terre/04/mal
assez/malassez.html
 Exemple: cellule de Petroff

• Profondeur: 0.02 mm
• 25 petits carrés : 1mm²
 1 petit carré : 0.04 mm²
• Volume sous chaque petit carré = 0.04x0.02 =
0.0008 mm³
• Comptage sur 10 petits carrés
• !! Compter les cellules sur 2 côtés adjacents!!
Exemple
N= 56
V= 0.0008 x 10= 0.008 mm³
 X= nombre de cellules/ml =
56 x 10³/0.008= 7x106 cell/ml

Prescott
 Avantages/inconvénients

 Facile  Population dense car petits

 Peu coûteux volumes
 Relativement rapide (à  Comptage des morts ET
voir) vivants
 Laborieux si µO petits et
mobiles
 4.1.1. Comptage direct

• Epifluorescence sur filtre

– Filtration vol. connu (pores: ø 0.22µm)
– Fluorochrome (acridine orange* - DAPI)
– Révélation au µscope
• µO morts rouges* http://www.finddiagnostics.org/pro
grams/hat-
• µO vivants  verts* ond/hat/parasite_detection/fluores
cence_microscopy/
 Fixation peu
importe état de
la cellule

Fixation
uniquement si
membranes
endommagées

Activités
cellulaires

Helmi K. (2016). Application de la cytométrie en flux pour le contrôle microbiologique de l’efficacité de traitements de l’eau. Thèse de doctorat
 Avantages/inconvénients (de l’acridine*)

 Rapidité
 Coût élevé
 Sensibilité +
 Bactéries en division 
 Distinction entre µo
fluo rouge*
morts et vivants*
 4.1.1. Comptage direct
• Impédance
– Développé par Coulter en 1956
– Transformation du volume des particules en signal
électrique
• Le passage de cellules en suspension dans un liquide
conducteur à travers un orifice modifie la résistance
électrique entre deux électrodes
• Cette variation d’intensité peut être visualisée sur un
oscilloscope sous forme d’impulsion
– U = I * R (avec U = différence de potentiel constant)
4.1.1. Comptage direct

https://www.youtube.com/watch?v=rsPQ8G9
-GgI
Hémostase bloc 2 Biologie Médicale 35
Hémostase bloc 2 Biologie Médicale 36
 4.1.1. Comptage direct
• Cytométrie en flux
– Principe de la mesure optique
• Les cellules sont analysées les unes à la suite des autres
grâce à la focalisation hydrodynamique (flux laminaire)
= principe de la cytométrie en flux
– LASER =
» lumière monochromatique
» voyager sur une grande distance sans perte d’énergie
» Les ondes sont parallèles dans une direction (en phase)

–  extrême focalisation du faisceau

 4.1.1. Comptage direct
• Cytométrie en flux • Principe de la mesure
optique
– Les cellules sont analysées les
unes à la suite des autres grâce
à la focalisation
hydrodynamique (flux
laminaire) = principe de la
cytométrie en flux
• La focalisation hydrodynamique
– Flux laminaire: présence d’un
liquide de gaine qui ne se
mélange pas à l’échantillon les
cellules sont focalisées, alignées
et passent devant le faisceau
 4.1.1. Comptage direct
• Cytométrie en flux
Exemple: Cytogramme
- SYBR Green II  marquage ADN peu importe état physiologique
- Iodure de propidium (PI)  marquage ADN si perte intégrité membranaire
 Indicateur de non viabilité cellulaire

E de fluo. verte peut être

absorbée par le PI émettant
une fluo. rouge.
 4.1.1. Comptage direct
• Cytométrie en flux
Avantages Inconvénients
 Sensibilité +  Coût élevé
 Rapidité +++ d'analyse
(jusqu'à plusieurs
milliers de
cellules/sec)
 Distinction entre µo
morts et vivants
 Etude d’un nombre élevé
de cellules  tests stats
 4.1.2. Comptage indirect
Milieux de culture solide
• Eau, lait, aliments…
1. Suspension de µO
2. Dilutions décimales
3. Ensemencement dilutions
successives
• Vol. précis et connu
4. Incubation (min. 24h)
5. Dénombrement des UFC intranet.tdmu.edu.ua
6. Application de la formule  N (UFC/ml)
 Milieu solide: mode op.

0
 Avantages/inconvénients

 Sélectivité possible
 Coût relativement faible  Lenteur (24h minimum)
 Cellules vivantes  Infrastructure assez lourde
 Sous-estimation possible si
colonies confluentes
 Filtration: mode op.milieu solide

Prescott

Suspensions peu contaminées

• Filtration sur membrane (porosité de 0,22 à 0.45µm),
10-100ml
• Dépôt du filtre sur milieu gélosé ou milieu ‘buvard’
• Incubation
• Dénombrement des UFC/100ml
 Avantages/inconvénients

 Grands volumes  Mise en œuvre compliquée

d’échantillon   Matériel adapté
sensibilité ++  Coût
 Spécificité possible
 Cellules vivantes
 4.1. Comptage par q-PCR ou RT q-PCR

Retro Transcriptase- Quantitative Polymerase Chain Reaction

• Détection des ARNm
• ARNm présents uniquement chez µorganisme possédant une
machinerie cellulaire fonctionnel
4.1. Comptage par q-PCR ou RT q-PCR
 4.2. Mesure de la masse cellulaire
• Croissance d’une population   nombre de
cellules   de la masse cellulaire totale (morts et
vivants)
– Mesure du trouble du milieu = turbidité
 Mesure de la turbidité
• Cellules dans un milieu de culture  dispersion de la
lumière
• Si  du nombre de cellules  turbidité 
• Mesure de l’absorbance  lien avec la [ ]
• Besoin d’une courbe étalonnage

http://www.spc.ac-aix-marseille.fr/labospc/spip.php?article192
 4.3. Mesure de l’activité microbienne
• Croissance des µO 
– Consommation du substrat
– Accumulation de déchets et constituants cellulaires
– Si relation linéaire  détermination du nombre de cellules
ou de la masse
4.3.1. Quantité d’ATP
– Constante chez les bactéries vivantes, ‘absente’ chez les
cellules mortes
– Mesure basée sur bioluminescence
• luciférine-luciférase + ATP + O2 + Mg++  lux
• Méthode relativement sensible ≥ 105 bactéries
4.3.2. Quantité d’O2 consommée
4.3.3. Quantité de CO2 produit
 4.3. Mesure de l’activité microbienne
4.3.1. Quantité d’ATP
Par marqueur bioluminescent (ATP)
– Quantité ATP constante chez les bactéries vivantes
– Durée de vie ATP en dehors cellules  très courte
– Résultats en RLU (Relative luminescent 58 Unit)  pg d’ATP 
équivalents µorganismes
 4.3. Mesure de l’activité microbienne
4.3.2. Quantité d’O2 consommée
4.3.3. Quantité de CO2 produit
5. Contrôle de la croissance microbienne
5. Contrôle de la croissance microbienne

• Agents physiques
– Sèche : bec Bunsen, four, …

– Humide: autoclavage (121° 15’), eau bouillante, …

5. Contrôle de la croissance microbienne

• Agents physiques
– Radiation
• Ionisante: Rayon X, gamma, ..
• Non ionisante: UV
• Agents chimiques
– Gaz stérilisant : oxyde d’éthylène  objet
thermosensible
• Blocage de la réplication de l’ADN et de l’activité
enzymatique
5. Contrôle de la croissance microbienne

• Agents chimiques
– Gaz stérilisant : oxyde d’éthylène  objet
thermosensible
• Blocage de la réplication de l’ADN et de l’activité
enzymatique

– Liquides:
• Antiseptique, désinfectant
– Composés phénoliques  dénaturation des protéines et
altération de la membrane plasmique
– Les alcools: bactéricides, fongicides mais non sporicides +
détruisent les virus enveloppés
» Dénaturent les protéines, dissolvent les lipides
5. Contrôle de la croissance microbienne

• Agents chimiques
– Liquides:
• Antiseptique, désinfectant
– Composés phénoliques  dénaturation des protéines et
altération de la membrane plasmique
– Les alcools: bactéricides, fongicides mais non sporicides +
détruisent les virus enveloppés
» Dénaturent les protéines, dissolvent les lipides
– Les halogènes : fluor, iode, chlore, brome, …
» Ex de l’iode: tue en oxydant les composés cellulaires
(peut-être sporicide à forte concentration)  teinture
d’iode (2% d’iode)
– Les métaux lourds
– Les aldéhydes
– Les détergents (ammoniums quaternaires)
5. Contrôle de la croissance microbienne

• Agents mécaniques : stérilisants

– Liquide ou air
5. Contrôle de la croissance microbienne

• Agents mécaniques : stérilisants

– Liquide ou air