Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018

Manel BOUDOUAYA

Sommaire
I. Introduction
II. Milieux de culture
Chapitre II II.1. Composition des milieux de culture
Les besoins nutritifs des II.1.1. Constituants chimiques
tissus cultivés en conditions II.1.2. Constituants organiques
II.1.3. Régulateurs de croissance
aseptiques
II.1.4. Divers produits
II.2. Préparation des milieux de culture
II.3. Composition des différents milieux de culture
II.4. Comment choisir le milieu de culture adéquat

I. Introduction
La réussite de la culture des tissus végétaux dépend de la composition chimique des
milieux de culture utilisés ainsi que d’autres facteurs ambiants. Pour une bonne croissance, les
plantes ont besoin d’importantes quantités de sels minéraux (macroéléments et
microéléments). Le milieu de culture doit contenir tous ces éléments ainsi que des hydrates de
carbone (généralement du saccharose ou du glucose) qui viennent de remplacer le carbone
que la plante absorbe de l’atmosphère lorsqu’elle réalise la photosynthèse. Pour obtenir de
meilleurs résultats, il faut ajouter au milieu de culture de petites quantités de composés
organiques dont des glucides, des vitamines, des acides aminés et des régulateurs de
croissances.
II. Milieux de culture
Un des éléments majeurs des conditions contrôlées de culture in vitro est l’apport des
éléments nutritifs sous forme d’un substrat synthétique de composition précise. Ce substrat
s’appelle "milieu de culture1". Il comporte, outre de l’eau et des sels minéraux (macro et

1 Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de

bactéries, de levures, de moisissures afin de permettre leur étude. En principe, les
cellules trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur
multiplication en grand nombre.

13
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

micro- éléments, fer) nécessaires à toute plante, des éléments organiques (sucre, vitamines,
parfois des acides aminés, des phytohormones), et un indicateur coloré de pH. Cette solution
aqueuse est solidifiée avec de l’agar agar (ce gélifiant permettant de donner une texture
ferme au milieu). Ces composants permettent la croissance du tissu isolé en organe, même s’il
n’est pas relié à la plante mère habituellement source d’éléments nutritifs.
La réussite de la culture des tissus végétaux dépend de la composition chimique des
milieux de culture utilisés ainsi que d’autres facteurs ambiants.
II.1. Composition des milieux de culture
En règle générale les milieux de culture sont composés des constituants suivants :
II.1.1. Constituants chimiques (inorganiques)
II.1.1.1. L’eau
On utilise en général de l'eau distillée, déminéralisée ou de l'eau permutée2. Dans
tous les cas la distillation finale doit être faite avec un distillateur en verre.
II.1.1.2. Les sels minéraux
Parmi les éléments nécessaires à la vie de la plante on distingue généralement les
macro- et les microéléments. Toutefois, comme pour les cultures traditionnelles, on trouvera
ces deux groupes d’éléments dans les milieux de culture :
1) Les macroéléments
Les tissus végétaux ont besoin d’une source constante de composés inorganiques. Les
éléments essentiels en plus du carbone, de l’hydrogène et de l’oxygène sont :
 Les cations : NH4, N. P, K, Ca, Mg, S.
 Les anions : NO3, PO4, SO4
Ces éléments sont ajoutés au milieu de culture avec des concentrations variant de 50 à
400 mg par litre.
2) Les microéléments (les oligoéléments
Pour une activité métabolique appropriée, les cellules végétales ont besoin
d’oligoéléments 3 ). Les plus essentiels sont : Fe (fer), Mn (manganèse), Zn (zinc), Cu

Le milieu de culture in vitro a une composition complexe et adaptée à

chaque espèce végétale et à chaque stade de développement de la plante in
vitro. D’une espèce à l’autre, les éléments minéraux changent afin de s’adapter aux
besoins physiologiques de l’espèce.
2 L’eau permutée est une eau débarrassée des ions calcium (Ca2+) et

magnésium (Mg2+), grâce à son passage sur une résine échangeuse d’ion. Est une
eau très souvent utilisée en travaux pratiques, car elle est généralement de qualité
suffisante.

14
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

(cuivre), B (bore), Co (cobalt), Ni (nickel), Al (aluminium), Mo (molybdène), I (iode).

Concentration de l'ordre de quelques milligrammes par litre. Les cinq derniers éléments
sont fondamentaux pour le fonctionnement des chloroplastes et la synthèse de la chlorophylle.
 Le (Fe) est nécessaire pour la formation des précurseurs de la chlorophylle.
 Le (Mn) permet d’entretenir l’ultra structure et le processus de photosynthèse.
 Le (Zn) et le (Cu) sont utiles pour l’oxydation et l’hydrogénation des composés
phénoliques.
 Le (B) est nécessaire pour entretenir l’activité des méristèmes, il participe à la
synthèse des bases azotés et en particulier de l’uracile (base pyrimidique spécifique à
l’ARN). Une déficience du bore (B) inhibe la synthèse des cytokinines mais
augmentent les niveaux d’auxines.
 Divers oligoéléments sont liés à l’activité des régulateurs de croissance, par
exemple : le "Zn-auxines" : le (Zn) est lié à la synthèse du tryptophane, précurseur
de l’AIA (auxine).
 Les chélates de fer 4, par exemple : des petites concentrations de la forme EDTA
(Ethylène Diamine Tétra-Acétique), incitent la croissance et permettent que le fer
soit disponible en petites quantités.
II.1.2. Constituants organiques
II.1.2.1. Les hydrates de carbones (les sucres)
Les tissus en culture in vitro sont largement hétérotrophes au carbone en raison de
l’absence ou de l’insuffisance de l’assimilation chlorophyllienne, la plante n'étant pas capable

3 Les oligoéléments sont surtout de nature minérale et apparaissent comme des

éléments essentiels, car ils ne sont pas produits par les organismes vivants. Ils
sont apportés par l’alimentation, mais parfois il faudra supplémenter en certains
oligoéléments, souvent en même temps que les vitamines.
4 La chélation permet de rendre le fer assimilable par un organisme. Le chélate

(prononcer « kélate ») de fer est obtenu grâce à l'association du fer avec soit :
 une substance argileuse ;
 un acide dit chélateur de fer qui forme des complexes métalliques grâce à son
fort pouvoir chélatant.
Le chélate de fer est capable de traiter la chlorose ferrique, une carence en
éléments nutritifs indispensables pour favoriser le développement des plantes et la
fructification. Un apport en chélate de fer favorise l'assimilation du fer par les
plantes et relance la production de chlorophylle.
Il existe plusieurs formes de chélates de fer, à savoir : la forme EDTA, la forme
DTPA, la forme EDDH.

15
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

de photosynthétiser à ce stade. Dans la nature, les sucres sont photosynthétisés à partir du gaz
carbonique atmosphérique et de l'eau du sol.
Il est donc indispensable d’apporter au milieu de culture des glucides qui sont
nécessaires au métabolisme. Ils sont utilisés comme source d’énergie et comme régulateurs
osmotiques. (Cette pression osmotique, agit dans un certain cas, sur l’orientation ou
l’expression morphogénétique des tissus et sur la maturation des embryons somatiques
produits). On amène en général du saccharose5 ou du glucose à des concentrations de 2 à 6
% en moyenne (Margara, 1984).
II.1.2.2. Les vitamines6
Elles favorisent fréquemment le développement des plants in vitro. Elles sont
nécessaires en petites quantités pour produire une série de réactions catalytiques dans le
métabolisme et il n’est pas exclu que le manque de certains d’entre elles puissent être un
facteur limitant de phénomène d’organogenèse. On utilise généralement des vitamines du
groupe B : thiamine, pyridoxine, biotine, méso-inositol, à des concentrations de l'ordre de 1
mg par litre.
II.1.2.3. Les acides aminés
La présence des acides aminés favorise la prolifération des cals 7. Ils procurent aux
tissus une source immédiate d’azote à assimilation plus rapide qu’avec l’azote inorganique
fourni par le milieu. Les principaux acides aminés dans les systèmes in vitro ont les fonctions
suivantes : la glutamine et l’asparagine transportent l’azote, l’arginine stimule les racines, la
sérine est employée dans la culture de microspores et la cystéine est un agent réducteur.
II.1.2.4. La gélose (ou l’agar-agar8)
C’est un polyoside (glucide) de haut poids moléculaire, qui est extrait de certaines
espèces d’algues rouges du genre Gelidium (Augé & al., 1989). Elle assure un support solide
transparent dans lequel les explants peuvent être repiqués et ne tombent au fond des

5 Le saccharose est le sucre employé universellement. Viennent ensuite par ordre

d’importance le glucose, le maltose, le raffinose, le fructose, le galactose, le
mannose et le lactose. La concentration employée pour le saccharose est de 20 à
45 g/l.
6 Les vitamines du groupe B sont des cofacteurs d’enzymes contrôlant le

métabolisme des nutriments énergétiques.

7 Un cal est une structure de prolifération cellulaire obtenue notamment en

culture in vitro par l'ajout d'hormones végétales.

8 L’agar-agar se compose de deux polysaccharides (glucides), l’agarose et
l’agaropectine.

16
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

récipients. Elle a l’avantage de retenir très peu d’ions, mais en contrepartie elle fournit un
milieu de vie pauvre en oxygène lorsqu’elle est utilisée à une forte concentration. La
concentration d’agar variera avec le type d’organe cultivé, la qualité de l’agar et le pH du
milieu. Généralement, plus le pH est bas, plus l’agar tend à devenir liquide (Augé & al.,
1989).
Les avantages de l’agar sont :
 L’agar forme avec l’eau un gel qui fond à 100°C et se solidifie à 45°C. ceci veut dire
que ce gel est stable quel que soit les températures d’incubation.
 L’agar ne réagit pas avec les constituants du milieu.
 L’agar n’interfère pas avec la mobilisation des constituants du milieu.
D’autres composants ont été testés pour remplacer l’agar, mais sans réel succès. Le
plus connu est peut-être la "Gelrite9".
II.1.2.5. Le charbon actif
Du charbon actif est quelquefois utilisé pour ses qualités de "détoxifiant". Selon
Hamlat (1995), le charbon actif absorbe les phénols, les produits de leur oxydation, accélère la
croissance des cultures et favorise l’enracinement. Dans d’autres cas, il possède un effet
inhibiteur sur l’effet des auxines et les cytokinines contenus dans le milieu (Margara, 1984).

II.1.3. Régulateurs de croissance (phytohormones naturelles)

Il n'est pas surprenant d'apprendre que les plantes produisent également des
hormones, appelées généralement "phytohormones", Ce sont des molécules qui affectent la
croissance, le fonctionnement et la différenciation des cellules de la plante. Normalement,
les hormones sont produites à de faibles concentrations et exercent ainsi leurs actions
respectives.
Il y a au total cinq phytohormones dont l'influence sur le développement des légumes
est de la plus haute importance :
1. Les auxines.
2. Les cytokinines.
3. Les gibbérellines.
4. L’éthylène.
5. L’acide abscissique.

9La Gelrite est un polymère gélifiant d'origine naturelle qui peut être utilisé dans
une variété d'applications comme agent de solidification au lieu de la gélose.

17
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Cependant, récemment, d'autres substances ont été ajoutées à la liste des hormones
végétales. Ceux-ci incluent les jasmonates (JA), les brassinostéroїdes (BR), l'acide
salicylique et même certains peptides. Toutes les hormones végétales coopèrent.

Selon Ross (1969) et Salisbury (1994) In Meyer & al, 2008, une phytohormone est
une substance organique végétale qui régule la croissance et oriente le développement des
tissus vers la prolifération de pousses feuillées ou la croissance de racines. En cours de
culture, il faut donc faire varier les hormones végétales en fonction du type de croissance
recherché : des cytokinines pour favoriser la multiplication des microboutures, puis des
auxines pour favoriser l’enracinement préparatoire à l’acclimatation. Les hormones
utilisées sont principalement : les cytokinines, les auxines et les gibbérellines. Car ces
hormones sont capables d’orienter les explants vers la formation de nouveaux organes :
II.1.3.1. Les auxines (AIA10)
L’auxine est une phytohormone de croissance végétale indispensable au
développement des plantes. Elle joue un rôle majeur dans le contrôle de leur croissance. Elle
intervient dès les premiers stades de l'embryogenèse puis contrôle aussi bien l'organisation du
méristème apical (phyllotaxie) et la ramification des parties aériennes de la plante (dominance
apicale), que la formation de la racine principale, l'initiation des racines latérales et des
racines adventives (rhizogénèse). L'auxine intervient également dans les tropismes en réponse
à la gravité (gravitropisme) ou à la lumière (phototropisme). Ces multiples effets à l'échelle de
la plante résultent du contrôle qu'elle exerce sur la division cellulaire, l'élongation cellulaire
et certaines étapes de différenciation.
Le terme d’auxine a été étendu à un ensemble de substances naturelles aux propriétés
analogues, ainsi qu’à des hormones de synthèse. On parle ainsi des auxines fongiques, qui
jouent notamment un rôle dans la production des ectomycorhizes.
Les rôles de l’auxine sont nombreux. Son action dépend très fortement à la fois de sa
concentration et du tissu sur lequel elle agit. Par exemple, une même concentration peut
inhiber le développement d’un bourgeon alors qu’elle favorisera l’élongation d’une tige.

10Sur le plan chimique, c’est l’acide indole 3-acétique ou AIA, un acide faible qui
peut facilement se dissocier.
L’auxine est synthétisée majoritairement à partir du tryptophane mais aussi à
partir de l'acide chorismique à l’extrémité des tiges (dans l’apex), et dans le
méristème des bourgeons terminaux .

18
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Selon les plantes, une même concentration sur un même organe peut entraîner des
conséquences différentes. Par exemple, l’auxine stimule la croissance du limbe des
monocotylédones alors qu’elle inhibe celle des dicotylédones.
 L’auxine a aussi une action cambiostimulante et est responsable du phototropisme.
 Elle favorise la croissance en longueur en agissant sur l’élongation cellulaire ou
auxèse.
 L’auxine joue également un rôle dans le phototropisme positif des tiges.
 En synergie avec les cytokinines, elle participe à la néoformation des bourgeons. En
revanche elle s’oppose à leur débourrement : c’est le principe de la dominance
apicale11.
 L’auxine joue aussi des rôles dans l’organogenèse.
 Elle agit à forte concentration (de l’ordre de 10-5 g/l) sur la rhizogénèse, favorisant
l’apparition de racines sur les boutures.
 L’action de l’auxine est très importante dans l’induction florale, elle favorise le
développement des fruits.

Figure II.1. Effets de l’auxine en fonction de sa concentration sur la plante

11 La dominance apicale est le phénomène par lequel l'axe principal d'une plante
croit plus vite que ses ramifications. Ce phénomène est expliqué par l'inhibition
des bourgeons latéraux par l'auxine.

19
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

II.1.3.2. Les cytokinines (CK)

La cytokinine est une hormone végétale qui stimule la prolifération des cellules, par
mérèse12, sous réserve qu'elles soient en présence d'auxine. Les cytokinines forment un
groupe de phytohormones qui favorisent la division cellulaire et la différenciation. Son
nom vient du terme "cytokinèse" qui se réfère au "processus de division cellulaire".
Les cytokinines et auxines sont produites à des endroits totalement opposés. Les
cytokinines sont produites préférentiellement dans les apex racinaires d’où elles migrent
vers les différents organes, donc à l'opposé des auxines car les auxines sont plutôt produites
dans les apex caulinaires. Elles ne sont efficaces qu’en coopération avec les auxines. En
présence d'auxine, les cytokinines favorisent la division et la croissance cellulaires, elles
stimulent la mérèse, l’initiation des jeunes pousses, la différenciation des bourgeons et le
débourrement des bourgeons.
Les cytokinines sont des hormones fondamentales dans le processus d'organogenèse
(formation d'organes) chez les plantes (caulogénèse et rhizogénèse) et dans la régulation de
divers processus physiologiques tels que :
 La photosynthèse.
 La régulation de croissance (dominance apicale).
 La sénescence (vieillissement des plantes).
 L'apoptose (mort programmée pour les annuelles par exemple).
 L'immunité végétale (résistance aux agents pathogènes).
 La tolérance et la défense contre les herbivores.
Le développement des cultures in vitro et de leurs applications en horticulture doit
beaucoup à l’utilisation des cytokinines.
Dans un milieu de culture in vitro, la prolifération des cellules se fait sous forme de
cals si le rapport cytokinine/auxine est équilibré. Si ce rapport est élevé, les cellules se
différencient pour donner des pousses feuillées et, si le rapport est faible, ce sont plutôt des
racines qui apparaissent.

12
La mérèse (appelée parfois meresis en latin) correspond au mode de croissance
par multiplication du nombre de cellules (par mitoses successives) chez les
végétaux. Ce phénomène se retrouve principalement au niveau des méristèmes
des apex.
L'autre phénomène fondamental qui intervient dans la croissance du végétal, est
l'auxèse (augmentation du volume cellulaire).

20
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

1. Donc de fortes concentrations en cytokinines alliées à de faibles concentrations en

auxines, nous permettent d'obtenir le développement des bourgeons et ainsi de
multiplier les plantes.
2. Alors que de fortes concentrations en auxines alliées ou non à de faibles
concentrations en cytokinines, nous permettent d'obtenir l'enracinement des tiges
feuillées.
3. Et si on équilibre les concentrations de ces deux hormones, on obtient un cal. Le
cal est le résultat de la prolifération anarchique de cellules plus ou moins différenciées
mais qui n'arrivent plus à s'organiser en tissus et organes distincts.

Elles favorisent la division cellulaire et l’organisation des cals. Elles sont utilisées
pour stimuler la prolifération des tissus en culture. À une forte concentration elles
déclenchent la néoformation de bourgeons sur cals et favorise la prolifération des
méristèmes axillaires en culture d’apex (Margara, 1984).

Le schéma suivant représente les niveaux relatifs d’une auxine et d’une cytokinine
nécessaires pour obtenir différentes réponses morphogénétiques.

Figure II.2. Schéma représentant l’effet organogène des régulateurs de croissance

(auxine/cytokinine) in vitro

21
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Le comportement physiologique d’un explant mis en culture serait le suivant d’après

Augé & al. (1989) :
 Si le rapport hormonal auxine/cytokinine (balance hormonale) est élevé, on obtiendra
un fonctionnement de type rhizogène13 ;
 Si ce rapport est faible, l’explant évoluera vers un fonctionnement caulogène14 ;
 Si le rapport est voisin de l’unité, on aura un comportement calogène.

La cytokinine désigne ainsi chacune des adénines substituées sur l'azote 6 jouant un
rôle hormonal dans la plante (Figure II.3) :

Figure II.3. Structure chimique de la molécule d’adénine (base azotée commune aux
cytokinines)

13 Rhizogène : Qui est relatif à la formation et la genèse des racines.

14 La caulogénèse est un processus qui conditionne la formation et le
développement de la tige du végétal. La caulogénèse est stimulée par les
cytokinines. Cette technique est utilisée en culture in vitro. Les tiges néoformées
in vitro peuvent apparaitre sur l’explant initial ou sur un cal. Ils sont induits sur
n’importe quel type d’organe ou de tissu y compris sur ceux qui ne les produisent
pas dans les conditions naturelles (Camefort, 1977 ; Zryd, 1988 ; Margara, 1989).

22
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Les cytokinines les plus utilisées sont :

Les cytokinines endogènes naturelles Les cytokinines de synthèse
(dérivés de l’adénine (base azotée)) (dérivés de phényl-urée)

La zéatine (C10H13N5O) : (la plus répandue dans La benzyladénine : (ou 6-benzylaminopurine ou

le règne végétal) BAP) :
C’est une hormone végétale naturelle isolée à C’est une cytokinine de synthèse de première
partir du maïs (Zea mays) se situant au niveau du génération, qui a des propriétés analogues à
phloème. Sa forme ribosylée, la zéatine riboside, celles des hormones naturelles mais qui est moins
se retrouve principalement dans les racines des onéreuse à produire. Elle induit la croissance de
plantes. Elle appartient à la famille des la plante, la floraison, la fructification, en
cytokinines et est dérivée structurellement de stimulant la division cellulaire
l'adénine. Elle est impliquée en tant qu'inducteur
dans la division cellulaire, perturbant la
dominance apicale, néoformation d'organes
dans la culture de tissus végétaux, floraison et
développement de chloroplastes. Elle est stable
en milieu aqueux et à la chaleur, utilisée en
concentration de 0,03 à 30 mg/l.

L’isopentényl-adénine (IPA) : La kinétine (KN) (6-furfuryl aminopurine) :

C’est une hormone végétale naturelle de la C’est une cytokinine de synthèse, qui régule la
famille des cytokinines. C'est la seconde croissance cellulaire chez les plantes. elle est
cytokinine découverte à partir de plantes atteintes stable à la chaleur.
par la bactérie Rhodococcus fascians. Elle est
cependant la plus employée.

23
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

II.1.3.3. Les gibbérellines (GA)

Selon Augé & al. (1989) les premières observations (1926) ont été faites sur des plants
de riz japonais contaminés par un champignon pathogène (Gibberella fujikuroi) ; les tiges
avaient des entre-nœuds beaucoup plus allongés et les feuilles étaient chlorotiques. Des
extraits aqueux du champignon provoquaient les mêmes symptômes, d’où l’idée de
l’existence d’une substance responsable de ces effets qui est la "gibbérelline".
La première gibbérelline identifiée est l’acide gibbérellique notée : GA3, c’est un
produit naturel, qui se dégrade rapidement en solution aqueuse. Cette famille de molécules
naturelles est immense, une centaine de types de gibbérellines sont connus, mais seulement
quelques-uns d'entre eux démontrent une activité biologique et sont réellement actives
dans la plante, qui sont, du point de vue chimique, plus complexes que l’auxine. Les plus
courants sont : GA1, GA3, GA4, GA7 et GA9.
L’effet reconnu en premier est l’effet sur la croissance des organes et en particulier
sur l’allongement des entre-nœuds.
Les fonctions principales des gibbérellines sont les suivantes :
1. Les gibbérellines sont essentiellement des hormones de croissance impliquées dans
divers processus de développement des plantes.
2. Accélèrent la germination des graines (l’interruption de la période de dormance).
3. Pendant la germination déclenchent la production des enzymes nécessaires à
l’hydrolyse de l’amidon en sucres simples, destinés à nourrir la plantule15.
1. Stimulent la croissance longitudinale de la tige ainsi que l'allongement des organes
axiaux : pétioles, pédoncules, en stimulant la division et l'allongement des cellules.
2. Influencent l'initiation florale et la formation de fleurs unisexuées chez certaines
espèces.
3. Induisent le développement des bourgeons et favorisent l'établissement et la
croissance des fruits ; dans les cas où les auxines n'augmentent pas la croissance.
4. Régulent la transition de la phase juvénile à la phase adulte.
5. Son action est considérée opposée à celle d'une autre hormone végétale, l'acide
abscissique. La régulation de la gibbérelline est effectuée grâce à des
chémorécepteurs16.

15La plantule est la jeune plante durant la germination jusqu’au développement des
premières feuilles.

24
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Figure II.4. Structure de l’acide gibbérellique (GA3) c’est la molécule de gibbérelline la plus
connue et la plus utilisée en culture in vitro

Figure II.5. Structure de la molécule de gibbérelline GA12

II.1.3.4. L’éthylène (CH2=CH2)

Éthylène (ou éthène) est une hormone végétale, de formule C2H4, ou plus précisément
(CH2=CH2), est un composé gazeux synthétisé à partir de la méthionine dans les tissus
sénescents ou soumis à un stress (Meyer & al., 2008). L’éthylène 17 est un gaz incolore,
volatil, de densité proche de l'air, identifié dans les enceintes de stockage des fruits, il joue
dans le cycle de vie des plantes diverses fonctions. Les principales propriétés de ce régulateur
selon Augé & al. (1989) sont :
1. Contrôle du développement du germe.
2. Déclenchement du processus de maturation des fruits.
3. Accélération du processus d’abscission (vieillissement et chute) des feuilles et des
fleurs.
4. Participation aux réponses des plantes aux stress biotiques et abiotiques.
5. Participation aux processus de floraison (la floraison des bourgeons).

16Les chémorécepteurs, plus récemment appelés chimiosenseurs, est une cellule

réceptrice qui traduit et transmet une substance chimique, endogène ou induite
(un signal chimique) en un potentiel d'action et génère un signal biologique

17 La molécule d’éthylène est la molécule organique la plus produite au monde.

25
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

6. Communication entre les différents organes végétaux et entre les plantes de la

population.

Figure II.6. Structure de la molécule de l’éthylène

II.1.3.5. L’acide abscissique (ABA)
(ABA, pour abscisic acid18) est une phytohormone. Chez les plantes, la production
d'acide abscissique est concentrée au niveau du parenchyme des racines et des feuilles
matures, à l'intérieur des plastides des tissus vasculaires.
Comme hormone végétale, l'acide abscissique participe activement à de multiples
processus physiologiques de la plante :
1. Il régule le vieillissement, la carie des feuilles, la floraison, la maturation des fruits,
le repos des graines et des bourgeons, la transpiration stomatique et d'autres
processus de développement des plantes.
2. Il inhibe généralement la croissance et favorise la dormance.
3. C’est un inhibiteur naturel très répandu dans les plantes, il favorise l’abscission des
feuilles et des fruits et exerce une inhibition de la croissance (Heller & al.,, 1995).
4. Il serait responsable de l'entrée en dormance des graines et bourgeons à l'approche
de la mauvaise saison.
5. Il a aussi une action sur la perméabilité cellulaire aux ions potassium ; par cette
action il provoque la fermeture des stomates en cas de déficit hydrique de la plante
(Augé & al., 1989).

18 Il a été isolé pour la première fois en 1963 sous le nom d'« abscissine », impliqué
dans l'abscission (d'où son nom) des feuilles de cotonnier (Gossypium sp.). En
1964, on désigne la « dormine » comme responsable de la dormance chez les
bourgeons de sycomore. C'est enfin en 1965 que le double rôle dans l'abcission et
la dormance est attribué à l'acide abscissique. Ses synonymes anciens sont donc
les termes abscissine et dormine.

26
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

6. Aide la plante à résister aux conditions défavorables. Pour cette raison, il est appelé
aussi "hormone de détresse".

Figure II.7. Structure de la molécule de l’acide abscissique

D’autres phytohormones ont été récemment découvertes. Certaines sont impliquées

dans la morphogenèse, d’autres dans la défense contre les agents pathogènes : (Meyer & al.,
2008).
II.1.4. Produits divers
Certains produits de composition mal définie se sont révélés comme stimulants, c’est
le cas de certains extraits naturels, lait de coco, extrait de levure, etc. On ajoute parfois ces
additifs tels que :
1) Les antioxydants : comme l’acide ascorbique.
2) Les protéines : comme la caséine hydrolysée.
3) Les jus : "jus de banane", "jus d'ananas", etc.
4) Les extraits de divers fruits : "lait de coco", "l'albumen de Maïs", etc.

Ces substances apportent des régulateurs, mais aussi des acides aminés.

II.2. Préparation des milieux de culture

Elle se fait à partir de solutions-mère, concentrées ou diluées suivant leur contenu. Elle
s’effectue suivant les étapes ci-dessous :
1) Il est important de diluer les substances dans un ordre précis, en général :
 macroéléments ;
 oligoéléments ;
 fer.
2) Contrôle du pH en général vers 5,6. La correction se fait avec le KOH ou le NaOH.

27
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

3) Ajouter les ingrédients mentionnés dans l’ordre ci-dessous en ajustant le volume à

l’aide d’une éprouvette, Il ne faut pas dépasser le volume du milieu qu’on veut le
préparer.
 sucre ;
 gélose ;
 vitamines ;
 régulateurs de croissance (phytohormones) ;
 produits divers.
4) Ensuite, porter à ébullition en agitant jusqu'à ce que le milieu soit clair (dissolution
de la gélose).
5) Remplir les tubes ou les récipients en verre stérile avec la solution.
6) Stériliser le tout, température : 120°C pendant 20 minutes.
7) Après stérilisation sur flacons fermés, la conservation au froid est possible pendant
plusieurs jours (Boutherin & Bron, 2002).

Voici ci-contre un Modèle de fiche pour préparation des milieux de culture

Tableau II.1. Modèle de fiche pour préparation des milieux de culture

Date Fiche de milieu (x)
Constituants Quantités réelles
Caractéristiques
Codes
Eau :
Sels minéraux :
Macroéléments :
Oligoéléments :
Fer :
pH
Sucre (s)
Gélose
Vitamines :
Régulateurs de croissance :
Produits divers :
Observation :

28
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

II.3. Composition des différents milieux de culture

Théoriquement, chaque plante et chaque technique demandent un milieu particulier
mais certains sont relativement polyvalents. Le milieu, de par sa composition, est un élément
important dans la réussite d'une culture in vitro ainsi que le sérieux avec lequel il est préparé.
Il est important pour chaque mise en culture d'établir une fiche où sont notés, outre la
composition, la nature de l'explant, la technique et les produits de désinfection, le pH, la
température, l'intensité et la durée de l'éclairement. Toutes ces notions permettant
éventuellement une analyse de ce qui a été fait, et, en cas d'échec, il est ainsi plus facile de
repérer les points douteux et d'apporter les corrections nécessaires.

Exemple de désinfection d'un explant (bourgeon de chrysanthème) :

10 secondes : - alcool à 70°,

- rinçage à l'eau stérile.
20 minutes : - hypochlorite de calcium (4 %),
- trois rinçages successifs à l'eau stérile,
- mise en culture.

De nombreux chercheurs ont étudié les concentrations des milieux et ces milieux
portent maintenant leur nom (Tableau II.2). Certains d'entre eux sont couramment
commercialisés.

29
 Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Tableau II.2. Composition de quelques milieux de culture

White (1954) - Medium Murashige & Skoog (R.M, 1962) - Medium Gumborg Miller & Ojima (1985) - Medium
Composition Quantité par litre Composition Quantité par litre Composition Quantité par litre
Masse Moles Masse Moles Masse Moles
a) a) a)
Ca(NO3)2, 4H2O 300 mg 1,27 mmol NH4NO3 1650 mg 20,6 mmol NaH2PO4, H2O 150 mg 1,09 mmol
KNO3 80 mg 0,791 mmol KNO 1900 mg 18,8 mmol KNO3 2500 mg 24,7 mmol
KCl 65 mg 0,872 mmol CaCl2, 2H2O 440 mg 2,99 mmol (NH4)2SO4 134 mg 1,01 mmol
Na H2PO4, H2O 19 mg 0,138 mmol MgSO4, 7H2O 370 mg 1,50 mmol MgSO4, 7H2O 250 mg 1,01 mmol
MgSO4, 7H2O 750 mg 3,04 mmol KH2PO4 170 mg 1,25 mmol CaCl2, 2H2O 150 mg 1,02 mmol
b) b) b)
MnSO4, 4H2O 5 mg 22,4 μmol H3BO3 6,2 mg 100 μmol MnSO4, H2O 10 mg 59,2 μmol
ZnSO4, 7H2O 3 mg 10,4 μmol MnSO4, 4H2O 22,3 mg 100 μmol H3BO3 3 mg 48,5 μmol
H3BO3 1,5 mg 24,3 μmol ZnSO4, H2O 8,6 mg 28,9 mmol ZnSO4, 7H2O 2 mg 6,96 μmol
KI 0,75 mg 4,52 μmol KI 0,83 mg 5,00 mmol Na2MoO4, 2H2O 0,25 mg 1,03 mmol
CuSO4, 5H2O 0,01 mg 0,0401 μmol Na2MoO4, 2H2O 0,25 mg 1,03 mmol CuSO4, 5H2O 0,025 mg 0,100 mmol
MoO3 0,001 mg 0,00695 μmol CuSO4, 5H2O 0,025 mg 0,100 mmol CoCl2, 6H2O 0,025 mg 0,105 mmol
CoCl2, 6H2O 0,025 mg 0,105 mmol KI 0,75 mg 4,52 mmol
c) c) c)
Fe2(SO4)3 2,5 mg 6,25 μmol FeSO4, 7H2O 27,8 μmol 100 mmol Séquestrène 28 mg Fe 50,1 mmol
Na2 SO4 2,5 mg 6,25 μmol Na2, EDTA, 2H2O 37,3 μmol 100 mmol 330 Fe
d) d) d)
Sucrose 20 g 58,4 μmol Sucrose 30 g 87,6 mmol Sucrose 20 g 58,4 mmol
e) e)
AIA 1-30 mg 5,71-171 μmol 2,4-D 1 mg 4,52 μmol
Kinétine 0,04-10 mg 0,186- 46,5 μmol
f) f) f)
Thiamine HCl 0,5 mg 1,45 μmol Inositol 100 mg 555 μmol Inositol 100 mg 555 μmol

30
 Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

Pyridoxine HCl 0,1 mg 0,486 μmol Acide nicotinique 0,5 mg 4,06 μmol Acide nicotinique 1 mg 8,12 μmol
Acide nicotinique 0,1 mg 0,812 μmol Pyridoxine HCl 0,5 mg 2,43 μmol Pyridoxine HCl 1 mg 4,86 μmol
Thiamine HCl 0,1 mg 0296 μmol Thiamine HCl 10 mg 29,6 μmol
g) g)
Glycine 3 mg 40 μmol Glycine 2 mg 26,6 g
h)
Caséine hydrolysate 1g 1g
i) i) i)
Agar 5g 5g Agar 10g 10g Agar 6-8g 6-8g

(Boutherin & Bron, 2002)

31
Chapitre II : Les besoins nutritifs des tissus cultivés en conditions aseptiques Dr 2017/2018
Manel BOUDOUAYA

II.4. Comment choisir le milieu de culture adéquat

Comme signalé précédemment, la composition des milieux de culture fait l’objet dans
la littérature de nombreuses formulations qui parfois se distinguent l’une de l’autre par un seul
de leurs constituants. Cette situation complique la prise de décision, du fait que chaque espèce
à ses exigences propres vis-à-vis des macroéléments et microéléments, vitamines,
phytohormones, etc.
Le succès d’une expérimentation dépend de la bonne compréhension des besoins
nutritifs des tissus. De fait, que parmi les facteurs les plus importants pour la réussite de la
culture sont d’origine de l’explant, les composés nutritifs et les régulateurs de croissance
employés. Donc, le choix de la composition nutritive se fait en fonction de plusieurs
paramètres, notamment la nature des tissus cultivés (bourgeons, embryons, méristèmes,
cellules,…etc.) et de la phase de la culture (étape d’initiation, de multiplication, d’élongation
ou de rhizogénèse).
Généralement, les paramètres nutritionnels à prendre en considération pour le choix
d’un milieu de culture sont les suivants :
1. La richesse en azote, en potassium et calcium de la solution minérale adoptée.
2. L’équilibre en azote nitrique et l’azote ammoniacal : NO3-/NH4+.
3. La pression osmotique de la solution minérale qu’on appelle aussi concentration
ionique totale.
En général, il vaut mieux pour gagner du temps, de partir d’un milieu déjà utilisé par
d’autres auteurs pour le même matériel ou pour des exemples comparables et en l’améliorant
ponctuellement. On utilise donc des milieux de composition connue, déjà éprouvés pour des
plantes particulières : MURASHGIE et SKOOG pour le tabac (convenant à de nombreuse
plantes), HELLER pour la carotte, GAMBORG pour le soja, le lin etc.
Mais il suffit parfois d’une modification dans la concentration d’un élément chimique
pour obtenir le résultat : par exemple la multiplication par 100 de la concentration en
manganèse a permis la croissance des apex de Prunus (Boxus & Quoirin, 1974).

32