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Enzymologie Appliquée
(Chapitre 3)
Les enzymes biologiquement actives peuvent être extraites de tout organisme vivant.
Un très large éventail de sources est utilisé pour la production commerciale d'enzymes. Sur la
centaine d'enzymes utilisées industriellement, plus de la moitié proviennent de champignons
et de levures et plus d'un tiers de bactéries, le reste étant réparti entre les sources animales
(8%) et végétales (4%).
Les microorganismes sont préférés aux plantes et aux animaux comme sources
d'enzymes car :
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1.1.3. La ficine : EC number: 3.4.22.3. Tirée des figues. Elle est utilisé dans l'industrie
alimentaire sous le code (E1101(iv)) pour l’attendrissement des viandes et la coagulation du
lait.
1.1.4. L’actinidine : EC number: 3.4.22.14 : extraite des fruits de kiwi. Une enzyme qui
améliore la digestion des protéines et aide à lutter contre les ballonnements. Elle a une
propriété de lutter contre les problèmes de mauvaise haleine, car elle capture certains
composés sulfurés qui se forment dans la bouche et dans l’intestin. Cet effet ne s’observe que
dans le cadre d’une consommation régulière.
1.2.5. La catalase : extraite du foie des bovins ou du cheval. Elle permet la dismutation du
peroxyde d'hydrogène (eau oxygénée) en eau et dioxygène.
1.2.6. Les lipases : extraites du pancréas de porc des ovins ou des bovins.
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La plus grande majorité des enzymes utilisées dans l’industrie est issue des
microorganismes : 50 % provenant des moisissures et de levures, 35 % des bactéries et 15 %
restant d’origines diverses.
Les microorganismes peuvent être cultivés en grande quantité dans une période
relativement courte selon des méthodes de fermentation établies. La production microbienne
d'enzymes est économique à grande échelle grâce aux milieux de culture peu coûteux et les
cycles de fermentation courts.
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Quel que soit le type de cellule choisi pour produire l’enzyme d’intérêt, nous devrons
sélectionner une méthode pour briser ce dernier et en extraire le contenu. À moins que
l’enzyme ciblée ne soit une protéine sécrétée et donc disponible dans le milieu (cas des
enzymes extracellulaire*.
L’extraction désigne l’action de séparer une enzyme d’un composé dont elle fait
partie. Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de
la membrane cellulaire par des procédés mécaniques, physiques, chimiques, ou enzymatiques.
(*) Lorsque l’enzyme est extracellulaire, elle est libérée dans le milieu extérieur avec un petit nombre d’autres
molécules, donc on n’aura pas besoin de passer par l’étape d’extraction. Il suffit donc de séparer le milieu des
cellules pour obtenir un extrait enzymatique brut (passer directement à la purification).
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C. Presse French
Cet appareil a été mis au point pour la première fois par Milner, Lawrence et French
en 1950 pour préparer un extrait à partir d’une Algue Chlorella. Par la suite cette presse
cellule a été utilisée pour la destruction de plusieurs types de microorganismes.
L’appareil vise lui aussi à forcer les cellules à passer dans un espace très restreint ce
qui déchire leur membrane. Il consiste en un cylindre creux en métal, cylindre dans lequel
s’enfonce un piston de métal munis de plusieurs O-rings (circle) en caoutchouc très solide. À
la base du cylindre, une petite valve est installée; celle-ci peut être obstruée par une petite
bille en téflon (Fig. 3).
La presse utilise une pompe hydraulique externe pour entraîner le piston dans le
cylindre qui contient l'échantillon liquide. L'échantillon hautement pressurisé est ensuite
pressé devant une vanne à pointeau. Lorsque l'échantillon passe à travers la valve, le fluide
subit une contrainte de cisaillement et une décompression, ce qui provoque une perturbation
cellulaire. Plus la pression est haute dans le cylindre, plus la lyse est totale (Voir les vidéos
sur mon site pour plus de détails concernant le mode de fonctionnement).
D. Bombe à disruption
Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle de grandes quantités d'azote
sont d'abord dissoutes dans le mélange de cellule sous haute pression dans le récipient sous
pression approprié. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. Puis, lorsque la
pression du gaz est soudainement relâchée; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme
des bulles en expansion qui étirent les membranes de chaque cellule jusqu'à ce qu'elles se
rompent et libèrent le contenu de la cellule ( Fig. 4). (Voir les vidéos sur mon site pour plus
de détails concernant le mode de fonctionnement)
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E. Sonication
Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Une tige de métal le
"sonicateur" à l’extrémité très fine est introduite dans la suspension de cellules (Fig. 5). La
sonde du sonicateur va mettre le milieu en vibration ultrasonique (fréquence de 20 ou 40 kHz)
émettant un bruit fort déplaisant (l’utilisateur doit porter obligatoirement des cache-oreilles).
Les vibrations sont des ondes de pression ultrasoniques qui causent la croissance de
bulles par un phénomène appelé "cavitation". Ces bulles sont soumises à un grand stress par
les ondes ultrasoniques et peuvent subitement grandir, se contracter ou même imploser. Une
telle implosion est accompagnée d'une très haute augmentation locale de la pression et de la
température d’où l’obligation de mettre les échantillons dans un bac de glace, en utilisant des
impulsions courtes avec des pauses pour rétablir une température plus basse (Voir les vidéos
sur mon site pour plus de détails concernant le mode de fonctionnement).
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A. Choc osmotique
Un choc osmotique peut suffire à briser la membrane cellulaire de cellules fragiles,
avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-
osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par
causer une rupture de la membrane plasmique.
Il est possible de lyser les membranes plasmiques sans briser les noyaux. La lyse des
noyaux, si elle arrive accidentellement, se traduira par une soudaine augmentation de la
viscosité de la solution: c'est la chromatine qui est libérée qui en la responsable. Donc
L’éclatement des organites est l’inconvénient de cette technique.
La lyse chimique est basée sur l’utilisation d’un tampon de lyse ; utilisée dans le but
de rompre les cellules. La plupart des tampons de lyse contiennent des sels (par exemple Tris-
HCl ou EDTA) pour réguler l'acidité et l’osmolarité du lysat. Parfois, des détergents (tels que
Triton X-100 ou SDS : (dodécylsulfate de sodium) sont ajoutés pour briser les structures
membranaires. Un tampon de lyse peut être utilisé sur les cellules de tissus animaux et
végétaux ou même sur les cellules microbiennes.
Le lysozyme est utilisé pour digérer le peptidoglycane des parois des bactéries. Le
peptidoglycane est directement accessible au lysozyme chez les bactéries Gram (+),
cependant c’est n’est pas le cas chez les bactéries Gram (-) du fait de la présence de la
membrane externe.
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La Lyticase (une endo-β1-3 glucanase) hydrolysant les liaisons β1-3 des glucanes
appelés laminarine) des parois des levures.
Leur solubilité ;
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Les préparations enzymatiques sous forme de poudre sont obtenues soit par
atomisation, soit par lyophilisation.
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Pour une stabilité optimale, les enzymes doivent être stockées sous leur forme
commerciale d'origine (lyophilisée, suspension de sulfate d'ammonium, etc.) à la
température appropriée indiquée sur l'étiquette.
Les enzymes doivent être diluées pour être utilisées avec un tampon glacé ou de l'eau
distillée, selon le type d'enzyme (le plus souvent les enzymes commercialisés sont
concentrés et doivent subir une dilution préalable).
Les flacons contenant des enzymes lyophilisées (ainsi que des cofacteurs, tels que
NADH et NADPH) doivent atteindre la température ambiante avant d'être ouverts.
Cela permet d'éviter la condensation de l'humidité sur la poudre, qui peut entraîner
une perte d'activité ou une dégradation. Si le réactif est hygroscopique, une seule
mauvaise manipulation peut ruiner le flacon entier.
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Les enzymes doivent être manipulées avec soin pour éviter toute contamination.
Utilisez une nouvelle pipette pour chaque aliquote prélevée dans le flacon initial. Ne
remettez jamais le matériel inutilisé dans le flacon initial. Le port de gants protège à
la fois le manipulateur et l'enzyme.
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