Protéomique

&
métabolique appliquée
TD1

Elaborée par:
Dr. Mariem YAHYA
 Protéome: protéomique:
Terme définit par Wilkins et al., Biotechnol. Gene.Eng.Rev. (1995),
13, 19-50
Concept désignant l’ensemble des produits fonctionnels des gènes
d’un organisme vivant = ensemble des protéines à un temps t d’un
organisme vivant dans un environnement donné.
Protéomique :Etude du protéome, c’est-à-dire l’étude à grande
échelle des protéines, et plus particulièrement l’étude de leurs :
 Niveaux d’expression
 Modifications
 Interactions
 Pourquoi l’étude du protéome ?
Protéines : éléments fonctionnels
Génome et transcriptome : supports de l’information génétique
Chaque protéine a une structure et une fonction qui lui est propre.
- hemoglobine : forme globulaire. Fixation de l’oxygène et du CO2
- actine : filament. Permet la contraction des muscles
 Pourquoi l’étude du protéome ?

 Le séquençage du génome humain a révélé l’existence de 30 000 gènes.

On peut déterminer la séquence des protéines à partir de la séquence
des gènes.
Mais connaître la séquence théorique des protéines ne suffit pas…
 La séquence ne permet pas toujours de prédire la fonction de la
protéine : celle-ci est souvent reliée à sa structure dans l’espace
 La protéine est très souvent modifiée après sa fabrication (coupure,
ajout d’autres composés,…)
 1 gène peut donner plusieurs formes d’une même protéine.
Chez l’homme: 30 000 gènes mais 100 000 protéines supposées
Après l’étude du génome, l’étude du protéome est donc indispensable
et constitue une nouvelle étape.
 Comprendre les processus cellulaires
normaux ou responsables de maladies
(cancers, maladie neurodégénératives, etc...)

Applications Identifier de nouvelles protéines

de la
protéomique

Identifier des protéines indicatrices de

maladies (bio-marqueurs)
Dynamique du protéome
La structure des protéines

 Chaque protéine est élaborée à partir de 20 “briques élémentaires” : les acides

aminés.
 Une protéine est une combinaison, sous la forme d’une chaîne plus au moins
longue et orientée, de ces 20 acides aminés (100 à 200 acides aminés).
 On représente chacun des acides aminés par une lettre.
 La séquence des acides aminés d’une protéine constitue la structure primaire
de la protéine.
 La structure des
protéines

Des régions de la protéine peuvent adopter 2 formes

particulières :
 hélices ou feuillets. On parle de structure
secondaire.
 La structure tridimensionnelle finale qu'adopte la
chaîne d'acides aminés, constitue la structure
tertiaire de la protéine.
La structure des protéines

 Plusieurs protéines peuvent s’associer

pour former des ensembles complexes.
On parle de structure quaternaire.
Techniques d’études des protéines

 Les protéines sont extraites à partir :

- des tissus
- des cellules en culture
- des liquides biologiques (sang, liquide céphalo-rachidien, etc..)
On utilise des solutions à la composition bien définie pour solubiliser les
protéines et les séparer des autres constituants.
On obtient ainsi un extrait protéique = matériel de base pour l’étude des
protéines.
Extrait : mélange d’un grand nombre de protéines (plusieurs milliers). Il faut
individualiser les protéines pour mieux les étudier.
Techniques d’étude des protéines
Stratégie d’ensemble pour purifier
une protéine d’intérêt
Les protéines sont purifiées par des méthodes de fractionnement. On
utilise les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine
étudiée pour l’isoler progressivement des autres substances
cellulaires
 les propriétés physico-chimiques exploitées dans les différentes
techniques de séparation sont:
- la solubilité
- la charge ionique
- la taille moléculaire
- les propriétés d’adsorption et de liaison à d’autres molécules
biologiques
 Stabilisation des protéines au cours de la
purification
L’intégrité structurale des protéines et leur stabilité dépendent de plusieurs facteurs:
 pH utilise des solutions tampon qui maintiennent le pH dans une zone "physiologique" (6.5-7.5/8.0) pour
éviter d’endommager les protéines par des variations brusque de pH.
Température
 les protéines sont facilement dénaturées à hautes températures
 plusieurs protéines se dénaturent lentement lorsque conservées à 25°C
 la purification des protéines se fait normalement à des températures proches de 0-5°C
 une fois purifiées, les protéines peuvent se conserver à long terme à des températures de –20 à -80°C
Protéases
 les cellules contiennent des protéases (enzymes qui hydrolysent les liens peptidiques)
 ces protéases sont libérées lors de la lyse cellulaire et peuvent dégrader les protéines lors de la purification
 l’ajout d’inhibiteurs de protéases permet d’empêcher cette dégradation
Influence de la concentration en sels
(force ionique)
 Il s'agit de l'influence de la concentration en sel de la solution.
Effet dissolvant (salting-in): les ions du sel réduisent les attractions
existantes entre plusieurs molécules de protéines. Ceci facilite leur
dispersion (évite leur agrégation) et donc augmente leur solubilité.
Protéines de faible force ionique

Effet de relarguage (salting-out): il se créé, au-delà d'une certaine

concentration en sel, une compétition vis à vis des molécules d'eau entre
les ions du sel et ceux de la protéine. Les molécules de protéine se
retrouvent donc déshydratées, elles ont alors tendance à s'agréger et à
précipiter.
Phénomène réversible par dilution. Protéines de force ionique élevée
 Influence du pH
 chaque protéine possède un point ou pH isoélectrique où il y a autant de
charges positives que de négatives la charge nette de la protéine = 0
 au pH isoélectrique, une protéine à tendance à devenir moins soluble: une
protéine avec une charge globale nette près de zéro minimise la répulsion
électrostatique et permet aux forces électrostatiques locales de prédominer
menant ainsi à une attirance entre les molécules (agrégation puis précipitation)
 ce phénomène est décrit sous le nom de précipitation isoélectrique et permet
de purifier une protéine sélectivement en amenant le pH au point isoélectrique
de cette protéine
 dans un mélange des protéines, cette situation est compliquée par la présence
d’interactions hétérogènes: des protéines qui possèdent des points
isoélectriques différents s’agrègent afin des former un précipité isoélectrique.
 la spécificité de la précipitation isoélectrique peut être améliorée par
l’inclusion d’un sel qui décroît d’avantage la solubilité de la protéine d’intérêt
Influence des solvants organiques

 Les solvants organiques miscible à l’eau, tels que l’acétone ou l’éthanol, sont généralement
des bons agents pour précipiter les protéines.
Electrophorèse bidimensionnelle
Electrophorèse bidimensionnelle
 Première dimension: séparation selon la charge par Isoélectrofocalisation (IEF) • Dans la
focalisation isoélectrique, les protéines migrent dans un tube étroit de gel de
polyacrylamide dans lequel il est établi un gradient de pH.
 Deux façons pour former un gradient de pH
A) La technique IEF classique: par des ampholytes
 Un gradient de pH généré par des ampholytes vecteurs , développée pour la première fois par
Svensson (1961) et est mise en pratique par Vesterberg en 1969
 Les ampholytes est un mélange d’isomères des acides oligoamino et oligocarboxyliques
aliphatiques de faible poids moléculaire qui génèrent un gradient de pH sous un champ
électrique
Analyse d’image
Analyse d’image