Coursl2 20fevrier2013 R Lebrun

1
La spectrométrie de masse :
Une technique d’étude structurale
des protéines
Cours 2013 L2
Régine Lebrun
rlebrun@imm.cnrs.fr
Plate-forme Protéomique de l’Institut de Microbiologie de la Méditerranée

FR3479 CNRS-AMU
2 Plan du cours sur La Spectrométrie de Masse
Introduction : quelques définitions
Chapitre I : Principes
1.1 Schéma du spectromètre de masse :

source-analyseur-détecteur
1.2 L’ionisation dans la Source

1.2.1. l’ionisation chimique (IC)
1.2.2. Désorption-Ionisation Laser Assistée par
Matrice (MALDI)
1.2.3. l’électronébulisation (ESI)
1.3 Les analyseurs

1.3.1. à temps de vol (TOF)
1.3.2. quadripolaire (Q) et trappe à ions (IT)
1.4 L’analyse MS et la fragmentation MS/MS
1.5 Couplage Chromatographie – Spectromètre de masse

3
Plan du cours sur La Spectrométrie de Masse
Chapitre II: Applications aux peptides, aux protéines et au protéome
2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale

2.1.1. contrôle de l’intégrité de protéine
2.1.2. interactions protéine-ligand
2.1.3. modifications post-traductionnelles
2.1.4. interactions protéine-protéine:
oligomérisation /stoechiométrie
2.2. Identification de protéines : Protéomique Descriptive

2.2.1. quelques définitions
2.2.2. séparation par Electrophorèse 2D
2.2.3. principe et ex de «peptide mass fingerprint »
2.2.4. exploitation de la fragmentation MS/MS
2.2.5. de la protéine au Protéome
2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative

2.3.1. quantification relative
2.3.2. quantification absolue
2.3.3. quantification « label free »
4
Les molécules biologiques sont composées essentiellement de:
Carbone : C
Hydrogène : H
Oxygène : O
Azote : N
Phosphore : P
Souffre : S
A chacun de ces nucléides correspond une masse atomique.

Connaissant la formule brute d’une molécule,
on peut donc calculer une masse chimique.
Par exemple, l’alanine (CH3CHCO2HNH2), soit C3H7N02 =
(3x12,01115)+(7x1,00797)+(1x14,0067)+(2x15,9994)
=89,09474 Da
L’unité de masse (u) est appelée dalton (Da) pour une masse chimique.
Elle est définie comme 1/12 de la masse d’un atome de carbone 12 :
1u =1Da = 1,660540x 10-27 kg

5
La spectrométrie de masse est une technique d'analyse physico-chimique permettant

de détecter, d'identifier et de quantifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse
Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions)
en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).
De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser

la structure chimique des molécules en les fragmentant.
+
Champ
électromagnétique
+
Rapport masse/charge Rapport poids/puissance
6
Chapitre I : Principes

7
1.1 Schéma du spectromètre de masse :
source-analyseur-détecteur
Analyseur en Traitement du
Source d’ions Détecteur
masse m/z signal
Production d’ions Séparation des ions Conversion d’un Représentation des

en phase gazeuse produits en fonction courant ionique en données dans un
du rapport m/z courant électrique spectre de masse
8
1.2 L’ionisation dans la Source :
Les différentes sources

Production d’ions
en phase gazeuse
Chauffage et
Molécules volatiles L’ionisation chimique
introduction du gaz
Désorption/Ionisation
Phase solide
Impact laser Laser
(microcristaux)
Assistée par Matrice
Molécules
non volatiles
Dispersion en
Phase liquide microgouttelettes Electronébulisation
sous haute tension
9 1.2 L’ionisation dans la source
1.2.1. L’ionisation chimique

s’adresse à des composés volatils, apolaires et stables à la chaleur
CH4 (méthane) en large excès
e- électron de haute énergie
M (analyte)
Une molécule de méthane qui reçoit l’impact d’un électron à haute énergie émis par un filament
chauffé à haute température va subir l’arrachage d’un électron pour donner un ion radicalaire
chargé positivement (CH4+.).
Il s’ensuit une réaction qui donne naissance à des ions CH5+ pouvant réagir avec les molécules
d'analyte (M) arrivant dans la source.
Ce type de réactions ions-molécules produit principalement des ions [MH]+ et [MCH4]+..
D’autres gaz d’ionisation chimique peuvent être utilisés, tels que l'isobutane et l'ammoniac.
10 1.2 L’ionisation
1.2.2. Désorption/Ionisation Laser Assistée par Matrice

(MALDI) s’adresse aux molécules polaires, peu volatiles comme peptides/protéines
Laser
Matrices: ac. α-
cyanocinnamique,
sinapinique, 2,5-
dihydroxybenzoïque, etc…
Désorption
L’analyte M est dispersé dans une solution saturée de petites molécules aromatiques
(matrice) et l’ensemble est co-cristallisé par évaporation du solvant. Le dépôt solide
obtenu est irradié par un laser de longueur d’onde où les molécules de matrice ont une
forte absorption. Il en résulte la désorption des ions formés par transfert de proton
(H+) entre la matrice photoexcitée et l’analyte M: [MH]+ .
*Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
11 1.2 L’ionisation
1.2.3. Electronébulisation (ESI)

Débits 1-10 µl/min-
L’électrospray est produit par application
10-100 nl/min
d’un fort champs électrique sur un liquide contenant
l’analyte M traversant un capillaire.
Ce champs provoque une accumulation de
charges à la surface du liquide en sortie du capillaire,
ce qui va former de fines gouttelettes hautement
chargées (nébulisat).
L’évaporation de solvant conduit au
rétrécissement de la taille des gouttelettes jusqu’à
ce que le champs électrique à leur surface soit
suffisant pour provoquer la désorption des ions.
Analyseur
*ESI: ElectroSprayIonisation
12 1.2 L’ionisation dans la source
Les ions produits
L’ionisation chimique Molécules monochargées, essentiellement sous la forme
Le MALDI [M+H]+ donne le rapport m/z: [M+H]

1
L’électronébulisation Molécules le plus souvent multichargées :
[M+2H]2+, [M+3H]3+… [M+nH]n+
Ce qui donne des rapports m/z:
[M+2H] [M+3H] … [M+nH]

2 3 n
13
1.3 Les analyseurs
Analyseur en
Source d’ions
Masse m/z
Production d’ions Séparation des ions

En phase gazeuse produits en fonction
du rapport m/z
14 1.3 Les analyseurs
1.3.1. à temps de vol (TOF)
L’Analyseur : Le Détecteur :
Tube de Vol de longueur l Scintillateur/Photomultiplicateur
1e détecteur linéaire
2e détecteur Réflectron
Analyse Peptides Analyse

Protéine entière
Energie cinétique d’un ion de charge z

soumis à une tension accélératrice Vo
Ec=½ mv2= ½ m(l2/t2)=zVo Miroirs électrostatiques
m/z = 2Vo t2/l2 (Vo, l sont connus)
rapport m/z = fonction du temps de vol t * TOF: Time of Flight

15
Couplage MALDI-TOF
5 10-8 Torr 8 10-8 Torr
Vo
Pompe Turbo :
Laser vide élevé
[A+H]+
337nm
[A+cation]+
[A-H]-
[A+matrice]+
[ions matrice]
1.3.2. quadripolaire (Q)
Les ions émanant de la source sont

soumis à une tension continue (U)
et une tension alternative (V)
appliquées entre 4 électrodes.
Le trajet des ions dans le quadripole est oscillant.

Si l’amplitude des oscillations est trop grande,
les ions sont collectés par les barres du quadripole et ils ne seront pas détectés.
On règle U et V de sorte que seul un ion de rapport m/z choisi

puisse se frayer un chemin jusqu’au détecteur (trajectoire stable).
Pour obtenir des mesures sur une gamme de rapports masse/charge,
on modifie les réglages de l’appareil à haute fréquence.
1.3.2. Trappe à ions (Ion Trap)
Les ions décrivent

des mouvements
oscillatoires stables
au centre de la trappe.
Par application
d’une rampe de Radiofréquences
au niveau de l’électrode annulaire,
les ions vont avoir
une trajectoire déstabilisée
et vont être éjectés
de la trappe
en fonction de leur m/z croissant.
Spectre MS
18
Couplage ESI-Trappe à ions (IT)
L’Analyseur :
Trappe
Capillaire de transfert chauffé
Ionà ions
Trap
Q0
760 Torr 10-3 Torr Q1
1 Torr
2 10-5 Torr
Lentille
ESI Skimmer
Dual Stage Turbo
La Source :
ESI
19 1.4. l’analyse MS
TOF Quadripole Trappe à ions
m/z = 2Vo t2/l2

Gamme des rapports m/z Réglage de radiofréquences
par temps de vol pour sélectionner un m/z
Gamme des rapports m/z
par réglages successifs
Spectre de masse
Intensité
MC/z
Courant 100%
MA/z
ionique
MB/z
m/z
Sensibilité de la spectrométrie de masse
De l’ordre de l’attomole
1 mole N = 6,03 . 1023

milli mole 10-3
micro 10-6
nano 10-9
pico 10-12
femto 10-15
atto 10-18 6,03 . 105
soit 600 000 molécules !!!
Résolution de la spectrométrie de masse

Dépend de la qualité de l’appareil
Fonction du rapport masse/charge
1
∆m + 20%
1,2
10
∆m + 2%
10,2
Rapport poids/puissance
Résolution de la spectrométrie de masse

Dépend de la qualité de l’appareil
Fonction du rapport masse/charge
La résolution mesure l’aptitude d’un analyseur

à séparer l’ion M de l’ion M+ΔM
Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de

2000
peut séparer des pics situés à des valeurs m/z de
2000 et 2001
200 et 200,1
20,00 et 20,01
Isotopes naturels
Masse
Masse atomique Nucléide Abondance relative (%)
Élément exacte
1H 1,00783 99,985
H 1,00797
D (ou 2H) 2,01410 0,0151
12C 12,00000 98,90
C 12,01115 13C 13,00336 1,10
14N 14,0031 99,63
N 14,0067 15N 15,0001 0,37
16O 15,9949 99,76
O 15,9994 17O 16,9991 0,04
18O 17,9992 0,20
P 30,974 31P 30,974 100
32S 31,9721 95,03
33S 32,9715 0,75
S 32,064 34S 33,9679 4,22
36S 35,9671 0,02
Isotopes naturels
Masse monoisotopique
C’est la masse du premier pic du profil isotopique c’est-à-dire celle
qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus
stables (C12, H1, O16, S32, N14, …).
Masse chimique ou moyenne

C’est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le
profil isotopique c’est-à-dire la masse qui prend en compte la masse
des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).
Isotopes naturels et résolution
Exemple : Spectre de l’insuline (Masse moyenne : 5807,22)
Résolution: 6000 500

GYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADK
13C
Résolution 7 637
2 x 13C
12C
Exemple d’un Spectre MS simple par
MALDI-TOF d’un peptide de 1570,632 ua
Analyse d’1fmol de Glu-Fib purifié

En mode Réflectron
Exemple d’un Spectre MS simple par

MALDI-TOF d’une protéine de 66,5 kDa
Analyse de 500fmol de BSA

En mode Linéaire
29 1.4. l’analyse MS-MS
Fragmentation
Consiste à sélectionner un ion (MS-MS), en provoquer la fragmentation, puis analyser la
masse des fragments obtenus (MS-MS).
L’ion sélectionné est conduit dans une cellule de collision remplie d'un gaz inerte (argon par
exemple).
Lorsque l'ion sélectionné rentre en collision avec ce gaz, son énergie cinétique est convertie
en énergie interne.
La dissociation de l'ion se réalisera lorsque son énergie interne sera devenue supérieure à
l'énergie d'activation nécessaire à la fragmentation.
L’analyse de la masse des fragments obtenus renseigne sur la structure de la molécule

analysée.
butane
Par exemple, dans les alcanes linéaires, la fragmentation se manifeste par la perte d'un méthyle;
ce qui donne des fragments de m/z = (masse – 15).
30 fragmentation MS-MS sur une protéine
Nomenclature des fragmentations peptidiques

31 1.4. l’analyse MS-MS
La fragmentation dans une Trappe à ions
Collision avec He et
irradiation à faible
amplitude à la fréquence Fragmentation
propre de l’ion sélectionné
Spectre MS/MS
32 1.4. l’analyse MS et MS-MS
Temps d’acquisition en spectrométrie de masse
TOF Quadripole Trappe à ions
m/z = 2Vo t2/l2 Réglage de radiofréquences Quelques

pour sélectionner un m/z
Gamme des rapports m/z microsecondes
par temps de vol
Gamme des rapports m/z

< 20 msec par réglages successifs
< 200 msec

33 1.5. Couplage Chromatographie – Spectromètre de masse
Compatibilité avec la rapidité d’acquisition des spectres :

1 spectre MS (gamme de masses m/z balayée en 200msec)
Chromatogramme
Courant ionique Total
Gradient
Séparation de mélanges complexes couplée à l’analyse de 70 min: de masse
par spectrométrie
d’un mélange de peptides 32,17
5-50% CH3CN/
HCO2H0.1%
dans H2O/HCO2H 0.1%
HPLC
Phase inverse C18
1 chromatogramme HPLC
Temps(min)
12 000 spectres MS et MS/MS !
Spectre de masse
Intensité relative
Au temps: 32,17 min
m/z
34
Résumé des caractéristiques
de la spectrométrie de masse
-  très sensible : qq attomoles sont détectées
-  haute résolution permet de distinguer les isotopes

naturels d’un élément
-  analyse rapide (qq msec) et compatible avec des mélanges

séparés par chromatographie en ligne
-  génère de nombreuses données : spectres MS, MS/MS

qui renseignent sur la structure de biomolécules
-  compatible avec l’étude de mélanges hautement complexes

comme un protéome entier.
35
Chapitre II : Applications de la

spectrométrie de masse à l étude des
peptides, des protéines et du Protéome
36
Chapitre II: Applications aux peptides, aux protéines et au protéome

2.1.1. contrôle de l’intégrité de protéine
2.1.3. modifications post-traductionnelles
2.1.4. interactions protéine-protéine:
oligomérisation /stoechiométrie
2.2. Identification de protéines : Protéomique Descriptive

2.2.2. séparation par Electrophorèse 2D
2.2.3. principe et ex de «peptide mass fingerprint »
2.2.4. exploitation de la fragmentation MS/MS
2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative

37 2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale
2.1.1. contrôle de l’intégrité d’une protéine
TorA (95 kDa) est une protéine périplasmique d’Escherichia coli.
TorD (22 kDa) est la chaperone stricte de TorA.
Les 39 acides-aminés N-terminaux de TorA

constituent une séquence signal indispensable à la
translocation de TorA vers le périplasme.
On mesure la masse de TorA

produite par deux souches de bactéries E. Coli
En l’absence de sa protéine chaperone,

TorD + TorD - TorA subit un clivage
de 35 acides-aminés en N-terminal
Extraction de protéines (-3877 Da)
Spectrométrie de masse MALDI-TOF
38
Spectre MALDI-TOF
AFEST
Carboxylester hydrolase
AFEST
de l’archeobactérie hyperthermophile
Archaeoglobus fulgidus I Enzyme seule
Le composé « 7600 » est un puissant inhibiteur de II Enzyme + composé « 7600 »

plusieurs sérine carboxylester hydrolases.
100 35480 35769
Intensité relative (%)

Composé « 7600 »
50
Masse moléculaire : 284 Da
0
m/z
Interaction forte mise en évidence
par MALDI-ToF ∆m = 289
39 2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale
2.1.3. Modifications post-traductionnelles
Isoformes glycosylées d’une protéine

N-Glycosylation produite chez Pichia Pastoris
MALDI-ToF
[M+H]+ à 33406
Protéine mutée sur les

[M+H]+ + adduitMatrice,
2 Asn par 2 Gln Glycosylation
à 33589
Protéine non mutée Glycosylation

[M+H]+ à 37719
37060 38507
+4500Da
sucres
40 2.1.3. Modifications post-traductionnelles
Phosphorylation
Mise en évidence d’une phosphorylation
sur la beta-caséine,
par MALDI-ToF
250 fmol
2061.848
Peptide
Phosphorylé?
79.97
Action Phosphatase Alkaline

1981.963
Peptide
Déphosphorylé!
41 2.1.3. Modifications post-traductionnelles
Type Δm (Da)
Tout incrément de masse ∆m

(modification chimique ou
mutation d’AA) peut être
mesuré par spectrométrie de
masse.
Cette détection ∆m dépend de
la Résolution de l’appareil.
Sera d’autant plus notable sur
des peptides où les m/z sont
bien résolus.
42
2.1.4. interactions protéine-protéine
Interactions non covalentes par ESI:
Ex: la Ribonucléotide réductase E. coli
en conditions non dénaturantes
en conditions dénaturantes (tampon bicarbonate d’ammonium) :
(H20/MeOH/AcAcétique) :
Masse mesurée
87 033.6
Masse mesurée M2(Fe-O-Fe)2

43 392
Masse calc.
87 028.8
Dimère actif : avec 1 cluster

Monomère inactif Masse calc. « Fe-O-Fe » lié non covalemment
43 386
sur chaque monomère
43
44 2.2. Identification de protéines : Protéomique Descriptive
Protéome : ensemble des protéines

exprimées par le génome ou par un type cellulaire
ou une cellule (Wilkins, 1996)
Protéomique descriptive : identification et caractérisation

des protéines d’une cellule dans un environnement donné
L’analyse « rapide » et à grande échelle des protéomes

est devenue possible grâce à:
* la connaissance des Génomes et donc des cadres ouverts de lectures (ORF)
* méthodes de séparation des protéines

* la spectrométrie de masse
* la Bioinformatique
45 2.2. Identification de protéines
2.2.2. Séparation par Electrophorèse bi-Dimensionnelle (2-DE)
Principe
1ère Dimension: séparation = f(pI)

Focalisation isoélectrique: IEF
Gradient de pH immobilisé
3 10
+ Strip -
2nde Dimension: séparation = f(PM)

Electrophorèse sur Gel de PolyAcrylamide
en milieu dénaturant Sodium DodécylSulfate : SDS
PAGE
- MW
-
-200
-100
-50
+ -10
+
2.2.2. Séparation par Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE)
1ère Dimension: séparation = f(pI)
Focalisation isoélectrique: IEF
Charge
pH<pI
nette
+ Toute protéine possède une charge nette
Point électrique dont le signe et l’intensité
+ isoélectrique varient en fonction du pH de la solution
(pI)
et de son point isoélectrique :
-
si pH<pI charge +
+
-
si pH>pI charge -
- -
pH=pI pH>pI
Gradient de pH immobilisé Les protéines migrent dans un gradient

3 10 de pH jusqu’à ce qu’elles rencontrent une
+ Strip - zone de pH où elles sont électriquement
neutres : pH=pI
Polymérisation de dérivés d’acrylamide
contenant des Immobilines (acide ou base La séparation des protéines est basée
faible défini par son pK); Gradient obtenu par sur leur différence de charge nette
variation continue du rapport des Imm
électrique.
Strips: gamme de pH 3-10; 6-11, 4-7, 5-6…
2.2.2. Séparation par Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE)
2nde Dimension: séparation = f(PM)

Electrophorèse sur Gel de PolyAcrylamide
en milieu dénaturant Sodium DodécylSulfate : SDS PAGE
-
SDS: charge négative
Gel à
porosité
fixe ou
variable
protéines
+
Acrylamide
SDS
N,N méthylène
-bis acrylamide Liaison SDS-Protéine
stoechiométrique
Toutes les protéines vont se charger

Taille des pores du gel = négativement, la séparation va se faire
f(concentration en Acrylamide)
en fonction de la taille uniquement.
T = 2,5% séparation de protéines de tailles élevées 106 Da

T = 30% …………………………………………………………………faibles 3000 Da
Gradient 5-20%: augmentation de la résolution
48 Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE)
Très
faib
le am
péra
Grad ge (5
ient 0µA
fort )
volta
ge (1
0000
V)
Equilibration du strip: réduction, alkylation
SDS-PAGE
-
Colorations:
Bleu de Coomassie : Résolution 5000
30-100ng/spot
spots / gel
Sypro : 1-2 ng/spot
Argent : 0.5-1.2ng/spot
+
49
Echantillon
1.Extrait 2.Focalisation 3.SDS PAGE 4.Coloration
protéique IsoElectrique
MW
-
+ - -200
-100
pH
3 4 7 10 -50
+ -10
5. Piquage
des spots
6. Spectrométrie de
masse
2.2.3. Principe et exemple de «peptide mass fingerprint »
Identifier une protéine, connaissant son origine (génome),

revient à lui attribuer une séquence en acides aminés
Bien qu’il existe des méthodes physicochimiques de séquençage de protéines,
ces méthodes sont peu sensibles et limitées (N-term bloqué, AA modifié…).
En revanche, il est plus facile de séquencer des acides nucléiques

et d’en déduire la séquence en acides aminés des protéines encodées (ORF).
On dispose à l’heure actuelle de banques de séquences (databases) regroupant

les séquences de plusieurs millions protéines de différentes espèces.
Expérimentation Banques de séquences

Mesures de masses
Calculs « in silico »
d’une protéine à identifier
Comparaison
2.2.3. Principe de «peptide mass fingerprint »
Identifier une protéine, connaissant son origine (génome),
revient à lui attribuer une séquence en acides aminés
Mesure de la masse Calculs « in silico »

d’une protéine à identifier
Comparaison
m/z
différents …
m/z
m/z
identiques
Résultat : masses identiques
mais séquences différentes
Mesure de m/z de protéines peu précis: identification de protéine impossible !

2.2.3. Principe de «peptide mass fingerprint »
Protéase Expérimentation Banques de séquences

Coupure endoprotéolytique
Mesure de la masse Calculs « in silico »
des peptides obtenus
Comparaison
« Fingerprint » différents
Plusieurs m/z
« Fingerprint = empreinte» « Fingerprint » identiques
Résultat : peptides : m/z précis

empreinte de coupure spécifique:
Identification de la Protéine fiable!
2.2.3. Principe et exemple de «peptide mass fingerprint »
Prot c
Basée sur «peptide mass fingerprint »
Prot a Prot g
Prot b Prot f
Prot c Prot e
Compare Prot d
± Tolérance de Masse
Moteurs bio-informatiques de
recherche : Algorithmes de calculs des …
scores basés sur des probabilités
Masses Théoriques
Masses Expérimentales des Banques de
mesurées séquences
2.2.3. Exemple de «peptide mass fingerprint »
Exemple : Protéine adhésive CupB5 de Pseudomonas aeruginosa
«peptide mass fingerprint »
Probabilité très faible que cette

identification soit due
uniquement au hasard (10-15)
Nombre de peptides
identifiés
2.2.3. Exemple de «peptide mass fingerprint »
Exemple : Protéine adhésive CupB5 de Pseudomonas aeruginosa

avec 24 peptides identifiés expérimentalement :
29% de couverture de la séquence théorique
2.2.4. Exploitation de la fragmentation MS-MS
La MS/MS donne une information structurale
renseigne sur l’enchaînement séquentiel d’acides aminés

57
Mesures de MS et MS/MS
des peptides Trypsiques Calculs « in silico »
d’une protéine
Comparaison
m/z=1091.13
1 Masse Expérimentale MS
1 Spectre Expérimental MS/MS
1.  Choix dans la banque des 500 m/z les plus

proches du m/z expérimental (MS)
2.  Comparaison des 500 spectres MS/MS
théoriques associés au spectre expérimental Masse Théorique MS
3.  Classe 10 spectres MS/MS en fonction Spectres Théoriques MS/MS
de leur score
4. Classe les peptides par protéine
Complexes protéiques purifiés Lysats cellulaires
Digestion protéolytique
(Trypsine) Gel 2D coloré
au Nitrate d’argent
Collecte de spectres MS et MS/MS

Gel 1D SDS coloré
au Bleu de Coomassie
nano-LC
MALDI TOF
m/z ESI-Trappe à Ions
en mode Réflectron
Comparaison avec données in silico des banques de séquences
Protéine X
Protéine Y
Protéine Z
59
Identification des constituants d’un complexe protéique

chez une bactérie extrêmophile
par spectrométries de masse et ESI-IT
60
Identification de mélanges très complexes de protéines
par spectrométrie de masse ESI-IT …Orbitrap
Chromatographie en configuration 1D Chromatographie en configuration 2D
é ine s
20 pr ot
ca t i on
e n tifi 1h) éi nes
50
I d LC pro t
HP
( r un
at i on x 1 h)
e n t ific s e ls 4
Id ps de
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> 2 0 0 pr o
d e de r nière
t ion m a sse bitrap

nt ifica e s de pe Or
Ide èt r e ty
r o m n d
ct o
Spe énérati
g
61 Identification de 45 protéines uniques et de
8 complexes individuels
organisés en un édifice supramoléculaire
M. Guiral et al.
New Insights into the Respiratory Chains of the Chemolithoautotrophic and Hyperthermophilic
Bacterium Aquifex aeolicus
Journal of Proteome Research, vol. 8, Avr. 2009, pp. 1717-1730.
62 Identification de Protéomes
de micro-organismes
Analyse du Protéome Analyse du Protéome

de Rickettsia felis de Mimivirus géant
•  115 produits de gène(13%)

•  66 inconnues
•  45 ORFans (11%)
•  5 protéines structurales
(Major Capsid protein…)
•  12 protéines impliquées dans
21.5 la Transcription (DNA
repair, topoisomerases)
•  9 protéines de la voie du
Approche Total métabolisme oxidatif
par 2DGel+ MS 31 •  7 protéines de modification
par nLC MS/MS 109
par les 2 approches 25
Total 165
M. Ogawa et al, Proteomics, 2007 P. Renesto et al, Journal of Virology, 2006

63 2.3. Quantification de protéines: Protéomique Quantitative
But: Comparer et Quantifier des variations d’expression de protéines
dans des situations biologiques variées : conditions de contrôle vs
conditions de stress, pathologiques, avec stimuli chimiques…
Quantification Relative par Spectrométrie de masse après marquage
- marquage métabolique: SILAC

- étiquettes chimiques : ICAT, iTRAQ, …
Quantification Relative par Electrophorèse 2-DiGE après marquage
Quantification Absolue
marqueur interne ex: Aqua-Peptides, …
Quantification sans marquage : « label free »

64 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative
2.3.1. quantification relative par Spectrométrie de masse après marquage
Pour comparer deux situations expérimentales Condition 1 Comparaison

du
Introduction d’un marquage des protéines, Condition 2 protéome
dans l’une des deux conditions à comparer
Cellules, Mesures
tissus, Purification, MS Analyse des
organisme fractionnement Protéines Peptides MS-MS données
Pas de 1 1 1 1 1
1 et 2
marquage 2 2 2 2 2
Marquage 1
1 et 2 1 et 2 1 et 2 1 et 2 1 et 2
métabolique 2
1 1 1
1 et 2 1 et 2 1 et 2
2 2 2
Marquage
chimique 1 1 1 1
1 et 2 1 et 2
2 2 2 2
SILAC : Marquage d’acides aminés par incorporation
d’isotopes stables lourds (13C ou 15N) en culture de cellules
(:Stable Isotope Labeling by Aminoacids in cell Culture)
6x12C de 6x13C de
l’Arginine l’Arginine
∆m =6
Quantification relative des

pics MS d’un même peptide
∆m =6
ICAT : Etiquettes chimiques d’isotopes stables légers ou
lourds greffés sur les Cystéines
(: Isotope-Coded Affinity Tag)
8xX= 1H
-SH ∆m =8
(Cys) 8xX= 2D
Marquage de protéines
Quantification
relative des
ICAT Digestion Ti pics en MS
léger
∆m =8
ICAT Identification
lourd Purification par Spectre
par affinité MS/MS
iTRAQ : Etiquettes isobariques pour la quantification relative
(: isobaric Tagging Reagents for Quantitative proteomic Analysis)
4 étiquettes = 4 situations expérimentales à tester
Rapporteur Balance
114 31 α-NH2-peptide 114 31 -p e p t i d e
Analyse MS/MS
Total 145 Da Identification
Analyse MS : tous les peptides 116 peptide
Masse +145 Da 114
115
quantification
117
68 2.3. Quantification de protéines et étude de protéomes
quantification relative par ITRAQ
Analyse MS et MS/MS de
tous les peptides marqués
Identification
peptide
116
114
115
quantification 117
Quantification relative par la mesure de l’intensité des « rapporteurs »

spécifiques à chaque situation expérimentale testée, et associé à chaque peptide
(quantités moyennées par les différents peptides qui identifient une protéine)
2.3.1. quantification relative par Electrophorèse 2D-DiGE après marquage
variations inter-gel
Colloïdal SYPRO
Coomassie Ruby
1000
100
- sensibilité
Proteine (ng)
Coloration - homogénéité 10
- dynamique
1
Silver
0,1 Nitrate
70
1) Marquage des extraits avec des colorants 2)Mélange 3) Séparation 2-DE

fluorescents: Cy2, Cy3, Cy5 des 3
échantillons 3 pH 11
+ 1- IEF -
S2 MM
+ - -200
-100
S1
-50
Mélange + -10
=
Standard interne
2- SDS PAGE
4) Scan sur les 3 longueurs d’onde 5) Analyse quantitative informatisée

Cy5 Cy3+Cy5
Cy3
Cy2+Cy3+Cy5 STD-cy2 S1-cy3 S2-cy5

Cy2
Rapport d’abondance du spot
Std S1 S2
70b
sans standard interne
Gel 1
-  Corrélation spot à
extrait 1 (Cy3) extrait 2 (Cy5) Standard (Cy2) spot
- Normalisation de
l’abondance par
rapport à chaque spot
du standard
avec standard interne
Gel 2
extrait 3 (Cy3) extrait 4 (Cy5) Standard (Cy2)

71
Impératifs:
. 4 réplicats biologiques obligatoires par extrait

avec inversion des marquages dye
. l’extrait « Std » obligatoire par gel :

corrélation
normalisation intra-gel et inter-gel
•  pH du tampon de marquage: 8.5

•  pas d’amines primaires/pas d’agent réducteur
•  pas de détergent autre que le CHAPS
•  concentration de l’échantillon entre 2.5 et 10µg/µl
•  marquage sur 50µg de protéines/400pmol de dye
STD SS N
72
Analyse informatisée: test sur Asterionella formosa; comparaison en culture standard (N) et
sans silice (SS)
Superposition des images Dige.
•  Spot détection: 10000 spots demandés Cy3-vert=N; Cy5-rouge=SS
•  exclusion filter: volume<30000
Sans filtre: 4500 spots
Avec filtre: 1150 vrais spots
STD SS N
SS STD N
73
Superposition des images Dige.

Cy3-vert=N; Cy5-rouge=SS
SS STD N
Dosage d’une protéine connue dans un mélange
Synthèse d’un peptide marqué (13C, 15N, Δm 6-10 Da)
Caractérisation
par spectrométrie de masse
Ajout d’une quantité connue de ce peptide de synthèse

dans l’échantillon biologique
Digestion protéolytique
Analyse en Spectrométrie de Masse LC-MS et SRM

Comparaison de l’abondance Peptide marqué/peptide natif
2.3.3. « label free »
Condition 1 Comparaison
Pour comparer deux situations expérimentales
du
(ou plus!)
Condition 2 protéome
Cellules, Mesures
tissus, Purification, MS Analyse des
organisme fractionnement Protéines Peptides MS-MS données
Pas de 1 1 1 1 1
1 et 2
marquage 2 2 2 2 2
Nécessité de répéter chaque situation : expériences biologiques et techniques (n=3 à 10)

et rassembler les données : Go-To !
Et exploitation avec divers outils bioinformatiques …travail de longue haleine!
76 2.3.3. Protéomique quantitative « label free »
La protéomique à la recherche de Biomarqueurs

HUPO : HUman Proteom Organization
2002 PPP: Plasma Proteome Project
•  Le sang humain peut contenir des •  Par intégration de ces multiples

protéines provenant de différentes résultats et du développement
parties du corps d’outils bioinformatiques :
•  Un répertoire le plus complet des Établissement d’un atlas de
protéines du plasma humain et de peptides (20433) quantifiés qui
leur quantité peut permettre la réfère à un set non-redondant de
découverte de biomarqueurs de 1929 protéines du plasma humain,
maladies publiquement accessible.
•  Chercheurs du consortium se sont
entendus pour multiplier les
mesures à partir de différentes
préparations et différents
spectromètres de masse avec
différentes méthodes de
quantification
77
Plusieurs déclinaisons de spectromètres de masse

pour répondre aux questions sur la Protéomique…
Orbitrap…
Mass spectrometry and protein analysis. Domon B, Aebersold R.

Science. 2006 Apr 14;312(5771):212-7.
78
Fin du cours

Coursl2 20fevrier2013 R Lebrun

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Plate-forme Protéomique de l’Institut de Microbiologie de la Méditerranée

Chapitre I : Principes

1.1 Schéma du spectromètre de masse :

1.2 L’ionisation dans la Source

1.3 Les analyseurs

1.4 L’analyse MS et la fragmentation MS/MS

1.5 Couplage Chromatographie – Spectromètre de masse

2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale

2.2. Identification de protéines : Protéomique Descriptive

2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative

A chacun de ces nucléides correspond une masse atomique.

Par exemple, l’alanine (CH3CHCO2HNH2), soit C3H7N02 =

1u =1Da = 1,660540x 10-27 kg

La spectrométrie de masse est une technique d'analyse physico-chimique permettant

De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser

Chapitre I : Principes

Production d’ions Séparation des ions Conversion d’un Représentation des

Les différentes sources

1.2.1. L’ionisation chimique

CH4 (méthane) en large excès

e- électron de haute énergie

1.2.2. Désorption/Ionisation Laser Assistée par Matrice

1.2.3. Electronébulisation (ESI)

Les ions produits

L’ionisation chimique Molécules monochargées, essentiellement sous la forme

Le MALDI [M+H]+ donne le rapport m/z: [M+H]

L’électronébulisation Molécules le plus souvent multichargées :

[M+2H]2+, [M+3H]3+… [M+nH]n+

Ce qui donne des rapports m/z:

[M+2H] [M+3H] … [M+nH]

1.3 Les analyseurs

Production d’ions Séparation des ions

1.3.1. à temps de vol (TOF)

Analyse Peptides Analyse

Energie cinétique d’un ion de charge z

m/z = 2Vo t2/l2 (Vo, l sont connus)

rapport m/z = fonction du temps de vol t * TOF: Time of Flight

5 10-8 Torr 8 10-8 Torr

1.3.2. quadripolaire (Q)

Les ions émanant de la source sont

Le trajet des ions dans le quadripole est oscillant.

On règle U et V de sorte que seul un ion de rapport m/z choisi

Les ions décrivent

TOF Quadripole Trappe à ions

m/z = 2Vo t2/l2

Sensibilité de la spectrométrie de masse

1 mole N = 6,03 . 1023

Résolution de la spectrométrie de masse

Résolution de la spectrométrie de masse

La résolution mesure l’aptitude d’un analyseur

Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de

Masse chimique ou moyenne

Isotopes naturels et résolution

Exemple : Spectre de l’insuline (Masse moyenne : 5807,22)

Résolution: 6000 500

Analyse d’1fmol de Glu-Fib purifié

Exemple d’un Spectre MS simple par

Analyse de 500fmol de BSA

L’analyse de la masse des fragments obtenus renseigne sur la structure de la molécule

Nomenclature des fragmentations peptidiques

Temps d’acquisition en spectrométrie de masse

TOF Quadripole Trappe à ions

-  très sensible : qq attomoles sont détectées

-  haute résolution permet de distinguer les isotopes

-  analyse rapide (qq msec) et compatible avec des mélanges

-  génère de nombreuses données : spectres MS, MS/MS

-  compatible avec l’étude de mélanges hautement complexes

1.  Choix dans la banque des 500 m/z les plus

•  115 produits de gène(13%)