31/01/2018

Yannis FRANCOIS
Master CPAM

Laboratoire de Dynamique et Structure

Moléculaires par Spectrométrie de Masse
Spectrométrie de masse
Institut Lebel, 7ème étage
SM
e-mail: yfrancois@unistra.fr

Enseignant : Y. FRANCOIS

Spectrométrie de masse: Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?

1. Présentation générale  Méthode analytique permettant de “peser” les molécules

avec une très grande précision.
2. Instrumentation et principe de la mesure
 On détermine sa masse moléculaire
2.1. les sources d'ions
2.2. les analyseurs
2.3. les détecteurs Exemple d’application :
2.4. Principe de la fragmentation
Rechercher le signal d’un composé donné dans un mélange
complexe (CO ds l’atmosphère de Titan ou un dopant ds les urines)
3. Applications
 Obtenir une 1ere donnée sur une molécule inconnue (molécule
extraite d’une plante médicinale)

Principe de la spectrométrie de masse ? Comment peser une molécule ?

 Méthode analytique permettant de mesurer la masse des  Travailler en phase gazeuse où les molécules sont isolées
molécules par rapports à leur nombre de charge

 Travailler avec des molécules chargées

 Rapport masse sur charge :
 Utiliser les propriétés reliant :

m Énergie / Trajectoire / Masse

z
Travailler dans des champs électriques ou magnétiques

1
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Un spectrométre de masse
mesure la masse de molécules isolées Différentes méthodes d'ionisation
Trois étapes :
 Ionisation d'une molécule neutre par éjection ou capture d'un électron
1- Volatiliser
A-B+.
 Séparer les molécules les unes des autres
 Passer de l’état de matière condensée à un état gazeux
 Ionisation par protonation ou déprotonation

2- Ioniser A-BH+ ou A-B-

 Transformer les molécules en ions
 Utilisation d’un champs électriques
 Ionisation par formation d'adduits (réaction ion-molécule)

A-B-Na+
3- Analyser
 Calculer masse moléculaire à partir du rapport :

m / z = masse / nb de charges

Que détermine-t-on exactement par spectrométrie

de masse ?
Qu’est-ce qu’un spectre de masse ?
1)Masse monoisotopique
c’est la masse du premier pic du profil Distribution Isotopique
C’est la représentation du rapport isotopique càd celle qui ne prend en
masse-sur-charge (m/z) compte que les masses des isotopes les
plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, …).
de molécules individuelles et ionisées

1283.2 1283.2
100 100
Intensité

Intensité

0
600 1000 1500 2000
m/z Thomson 0
600 1000 1500 2000
m/z

Masse monoisotopique Les isotopes

c’est la masse du premier pic du profil isotopique càd celle qui ne prend en
compte que les masses des isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32,
N14, …). • La plupart des éléments apparaissent dans la nature comme des
mélanges d’isotopes

Pic monoisotopique
• Un élément est défini par: AE
Z

– Son numéro atomique Z

– Son numéro de masse A

• Isotopes: atomes de même numéro atomique et de nombre de

m/z masse différents
P P+1 P+2 P+3 P+4
Element Ab (%) Isotope Ab (%) Isotope Ab (%)
Masse monoisotopique: dans le massif
1H 100 2H 0,015
isotopique, on l’appelle le pic P 1 1

Les autres pics du massif isotopique sont 12C 100 13C 1,12 14C 0,057
6 6 6
appelés les pics P+1, P+2, P+3,…. 14N 100 15N 0,36
7 7
Il contiennent tous au moins 1 des isotopes
16O 100 17O 0,04 18O 0,2
lourds d’un éléments. 8 8 8

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Que détermine-t-on exactement par spectrométrie

de masse ? Quelle masse mesure-t-on ?

2) Masse chimique ou moyenne Masse monoisotopique

c’est le barycentre des masses des pics c’est la masse « exacte » du premier pic du profil isotopique c’est-à-
constituant le profil isotopique càd la
masse qui prend en compte la masse des dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les
éléments donnée par le tableau plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, …).
périodique. Masse
moyenne
= barycentre
Masse chimique ou moyenne
c’est le barycentre des masses des pics constituant le profil
isotopique c’est-à-dire la masse qui prend en compte la masse des
éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).

La masse s ’exprime en Dalton (Da)

Elle dépend de la résolution du spectromètre de masse

Quelle masse mesure-t-on ? Pourquoi chercher à obtenir

Influence des isotopes un profil isotopique?
Exemple:
●
Intensité relative

Intensité relative
masse moyenne du brome Br : 79.904 Da
2 isotopes de masse « exacte » : 78.918336 et 80.916289

63 64
63
● Insuline : C257H383N65077S6 64

m/z m/z
5801 (masse entière : 12 pour C; 14 pour N; 16 pour O;...) 62 62

5803.6375 (masse monoisotopique)

HO―CH2―CH2―OH CH3―CH2―SH
5807.6559 (masse moyenne)

m/z = 64 : 2 C13 ou 1 O18 (0.2%) m/z = 64 : 2 C13 ou 1 S34 (4.2%)

Le spectromètre de masse
Pourquoi mesurer une masse isotopique ET/OU
une masse moyenne ?
Sous vide

C’est une question de précision de mesure !!!!

Système
Source Analyseur Détecteur Enregistreur
d'introduction

 On n’a pas toujours un signal sur l’ensemble des

isotopes et donc le barycentre n’est pas complet Comptage des ions
Production d'ions
mesure fausse en phase gazeuse

Séparation des ions

 L’instrument n’est pas assez résolutif en fonction du m/z Traitement du signal
Visualisation du spectre
Le composé est trop lourd pour détecter le 1er isotope

3
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La source d’ions : son rôle est de volatiliser et d’ioniser

Spectrométrie de masse:
Il existe de nombreux types de sources d’ions et chacun de ces types de sources
repose sur un principe physique différent.
1. Présentation générale

Le principe physique qui permet de volatiliser et d’ioniser un type de composé est choisi
2. Instrumentation et principe de la mesure par l’opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de
volatilisation et d’ionisation se font successivement ou simultanément selon le type de
source.
2.1. les sources d'ions
2.2. les analyseurs Les critères de choix principaux sont:
2.3. les détecteurs • la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser
2.4. Principe de la fragmentation •les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation
• la taille des molécules
• les quantités de produit disponibles
3. Le couplage LC – GC/MS
• le type d’introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique)

4. Applications

Sources d’ionisation Sources d’ionisation

Ionisation EI (Electronical Impact) Ionisation EI (Electronical Impact)
Petites molécules volatiles Petites molécules volatiles
Ionisation CI (Chemical Ionisation) et non thermosensibles Ionisation CI (Chemical Ionisation) et non thermosensibles

Ionisation ES (electrospray) Couplage LC-ES sur petites Ionisation ES (electrospray) Couplage LC-ES sur petites
molécules non volatiles molécules non volatiles

Ionisation MALDI (Matrix Assited Ionisation MALDI (Matrix Assited

Biomolécules (1 300 kDa) Biomolécules (1 300 kDa)
Laser Desorption Ionisation) et complexes non-covalents
Laser Desorption Ionisation) et complexes non-covalents

L'impact électronique (EI) L'impact électronique (EI)

Exemple de l'acétone

Pic moléculaire à
Intensité relative

m/z = 58

m/z
- un filament porté à haute T°C par passage d'un courant émet des e- qui peuvent .
La notation M+ signifie qu'il s'agit de la molécule entière après perte d'un électron.
être accélérés par une certaine ΔV.
Elle est chargée positivement comporte un électron libre non apparié.

- Ecin des e- influe sur le rendement d'ionisation et sur l'énergie d'excitation des
ions formés Il s'agit de l'ion moléculaire
rendement optimal : faisceau d'e- accéléré à 70eV

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Exemple spectre EI: L’ionisation par électronébulisation

(Electrospray)
107-CH2=O .
M+

107-HO2 basée sur la formation à pression atmosphérique de molécules chargées issue d’un
M-NO2 M-OH spray créé dans un champs électrique

L’ionisation électrospray : principe de la production du spray Principe de l’ionisation électrospray (ES)

J.B. Fenn (1988)
Débit imposé Tube capillaire
par une pompe
à p atm
0 volt

Effet de pointe qui entraîne

la déformation du liquide
+ 2000 volts en gouttelettes chargées

…………
+ 3000 volts

Emission d’un spray visible à la loupe.

Ces gouttelettes expulsées
sèchent, entament des fissions,
et génèrent des ions désolvatés

L’INTERFACE d’un spectromètre ESI Avantage de l’électrospray

(transmettre et focaliser les ions)
 Fonctionne à basse T°C, à pression atmosphérique,

3 zones successives de pompage pas de dégradation, pas de fragmentation

10-6 mbar
P atm
 Génère de ions multichargés
 Mesure précise de la masse moléculaire (0.1%) soit ± 1 Da sur M = 10000 Da
 Extraction des ions de large masse moléculaire (polymère, biomolécule)
4000 Volts
………… Hexapôle Sensible (C ~ µM)
Analyseur
 Extraction des molécules polaires
Vc
RF Durée de st.
Inconvénient de l’électrospray
 Peu d’information structurale, sauf si on effectue de la MS/MS
 Très sensible à la présence de sels ou additifs
3 paramètres à contrôler suppression du signal
dessalage impératif

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Interprétation d’un spectre electrospray Le spectromètre de masse

z=2
1001.1
L ’ES produit des ions multichargés
100

Sous vide
Intensité relative

z=1
2001.2 Système
z=3 Source Analyseur Détecteur Enregistreur
667.8 d'introduction

0
m/z (Thomson)
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 Production d'ions Comptage des ions
Etat de charge m/z masse calculée en phase gazeuse
1 2001.2 = (M + mH) / 1 2000.2 Da
Séparation des ions
2 1001.1 = (M + 2mH) / 2 2000.2 Da en fonction du m/z Traitement du signal
3 667.8 = (M + 3mH) / 3 2000.4 Da
Visualisation du spectre

Masse de notre composé : 2000,2 Da

Résolution R
Les caractéristiques principales d'un analyseur sont :
R mesure l’aptitude d’un analyseur à distinguer
des ions séparés par M Dalton (l’ion M de l’ion M+M)
• La résolution R
• La gamme m/z qu'il peut analyser M
• La rapidité de balayage en m/z
• La sensibilité
• La vitesse avec laquelle les ions le traversent M M + M
R = M/M
Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces
caractéristiques aux dépens des autres, mais seulement dans certaines
limites.

Vallée à 10 %
Chaque type d'analyseur a son "point fort"
(les 2 pics se recouvrent
sur 10% de leurs hauteurs)

L’analyseur quadripolaire L’analyseur quadripolaire

Formé de quatre barres de métal parallèles entre lesquelles les ions sont Les ions oscillent entre les barres (slalom) grâce à des tensions électriques
injectés avec une énergie cinétique de quelques électron volts.
oscillantes appliquées sur les barres.

Les ions d’une seule valeur m/z arrivent à traverser le système sans heurter les
barres

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L’analyseur quadripolaire: La trappe ionique

Electrode annulaire
Les fonctions qui représentent les tensions appliquées sur les barres Electrode chapeau Electrode chapeau
permettent de calculer les équations de mouvement des ions
+(U-Vcos wt) et -(U-Vcos wt)

Entrée des ions Sortie des ions

Équations de mouvement

Gaz tampon : Hélium

Diagramme de stabilité :
Trajectoires stables
Trajectoires instables
V cos wt

La trappe ionique
Analyse MS et (MS)n dans une trappe ionique

Excitation
3
Accumulation
des ions Isolation Fragmentation
1 2 4
Equations du mouvement des ions identiques à celles pour le quadripole

Les quatres barres parallèles du filtre quadrupolaires sont remplacées par un

"anneau torique" dont l'intérieur est hyperbolique.
5
Les fonctions qui représentent les tensions appliquées sur l'anneau permettent
de calculer les équations de mouvement des ions. 2 6
Int. Int.

Accumulation
m/z des fragments m/z
Détection Spectre MS Détection Spectre (MS)n

Le spectromètre de masse Le détecteur : pour compter les ions

Multiplicateur d’électron (détecteur le plus courant) :

Principe : dopage du signal par la formation d’électron secondaire à l’aide de tubes

Sous vide
en verres dopés au plombs (dynode)

Système
Source Analyseur Détecteur Enregistreur
d'introduction

Production d'ions Comptage des ions

en phase gazeuse

Séparation des ions

en fonction du m/z Traitement du signal
Visualisation du spectre
Avantage : bonne sensibilité et balayage rapide
Inconvénient : moins précis que le cylindre de Faraday, durée de vie limité

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La fragmentation
Spectrométrie de masse:
Principe : consiste à « casser » une molécule à l’intérieur d’un
1. Présentation générale spéctromètre de masse, afin de déterminer ses propriétés structurales

2. Instrumentation et principe de la mesure

Moyens : coupler plusieurs analyseurs et agir de façon séquentielle
2.1. les sources d'ions
2.2. les analyseurs Spectrométrie de masse à plusieurs dimension MSn
2.3. les détecteurs
2.4. Principe de la fragmentation
La MS-MS est un puissant outil de détermination
3. Le couplage LC – GC/MS de structure

4. Applications

Exemple du cholestane Spectrométrie de masse:

1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire
2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure 1. Présentation générale
3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative

Cholestane 2. Instrumentation et principe de la mesure

2.1. les sources d'ions

Pic moléculaire 2.2. les analyseurs
100 217.0
m/z 217 2.3. les détecteurs
m/z 149
218.0 2.4. Principe de la fragmentation
% 149.0
108.9 357.1
372.1
55.0 81.0 94.9 148.0 150.0 219.0
175.0 203.0
262.1 302.1
232.0 373.2
3. Le couplage LC – GC/MS
315.1 343.1 410.1 416.2
0 Da/e
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

Fragments
4. Applications
Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.

Application 1 Application 1
Détermination de l’état de charge d’un composé Détermination de l’état de charge d’un composé m/z = 0.32

On se sert des profils isotopiques z=3

M = 1682.85 Da
562.27
100 561.95
500.5 500.5
501.5 501.0 562.59
%
PG2
502.5 501.5 562.95
562.27
100 0 m/z
559 560 561 562 563 564 565 566
m/z m/z

m/z=1 m/z=0,5
La différence de masse apportée par la présence d’1 isotope est de 1 Da
%
donc le rapport m/z varie de 1/z
842.97
Si z=1 m/z=1 0 m/z
z=2 m/z=0.5
300 400 500 600 700 800 900 1000
z=3 m/z=0.33
etc

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Application 1 Application 1
Détermination de l’état de charge d’un composé Détermination de l’état de charge d’un composé
Problème : dépend de la résolution Cas de mauvaise résolution
17+
Deux pics consécutifs
myo
l1801np 7 (1.028) TOF MS ES+ permettent de
A19 9.32e3
myo Si 100
A21
A20
848.604 893.205 A18
942.742
déterminer M et z1
l1801np 7 (1.028) TOF MS ES+
A19 9.32e3 808.225
A20
100
A21
848.604 893.205 A18
942.742
réso X1 X2
808.225 A22
771.511
A17
A22 998.161
771.511
A17
998.161

A23
% 738.042

A23
m/z
738.042 A16
%
1060.454

Si 100 A24 M + z1 mH M + z 2 mH
A16 707.297
X1 = X2 =
1060.454
A15 z1 z2
A24
707.297
pas de réso On mesure la
1131.120
A14
999.875 1211.838 A13
616.164 A11 A10
A15
1131.120
masse moyenne
1304.991 A12
1413.609 1542.033 1696.147 z2 = z1 - 1
A14
999.875 1211.838 A13
616.164 A11 A10
A12 0
1304.991
1413.609 1542.033 1696.147 % 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
m/z
1800 Système de 2 équations
0
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
m/z
1800 Exemple : myoglobine (MM ~ 17000 Da) à 2 inconnues

Exemple : myoglobine (MM ~ 17000 Da) X2 - 1

0 m/z
Calcul de z: z1 =
997 998 999 1000
X2 - X1

Application 1 Application 1
Détermination de l’état de charge d’un composé Détermination de l’état de charge d’un composé
Cas de mauvaise résolution La masse M et z sont
Cas de mauvaise résolution
myo
l1801np 7 (1.028)
A20 A19
TOF MS ES+
9.32e3
d’abord calculées à partir de
100 848.604 893.205 A18
A21 942.742 2 pics. m/z z Masse
808.225
679,12 25 16953,00 La moyenne des valeurs
A22
771.511 707,31 24 16951,44 trouvées pour la masse
A17 Ensuite, M est calculée à moléculaire est calculée avec
998.161
partir de chacun des pics de 737,99 23 16950,77
721,5 22 15851,00 une déviation standard.
la série d’ions multichargés.
%
A23
738.042
808,28 21 16952,88
848,53 20 16950,60 Plus il y a d’ions multichargés,
A16
1060.454
Dans cet exemple on 893,24 19 16952,56 plus la masse pourra être
A24
707.297
observe 16 états de charges 942,67 18 16950,06 mesurée avec précision
A15
1131.120
différents (10 à 25 charges). 998,18 17 16952,06
A14
616.164
999.875 1211.838 A13
1304.991 A12 A11
1542.033
A10
1696.147
1060,41 16 16950,56
1413.609
La masse mesurée sera 1130,95 15 16949,25
0 m/z
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
donc le résultat de la 1211,81 14 16951,34
Exemple : myoglobine (MM ~ 17000 Da) moyenne de ces 16
mesures, d’où la grande Moyenne : 16951,65 +/- 0,17 Da
Série d’ions multichargés. précision obtenue.
Tous ces pics correspondent à la même
molécule, mais avec un nombre de protons Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses
différents. monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques

Application 2 Application 2
Analyse protéomique différentielle par électrophorèse bidimensionnelle

pH 3.0
Etat A pH 10.0 pH 3.0 Etat B pH 10.0

200 kDa
Application de la SM dans
le domaine de la santé

découverte de nouvelles cibles diagnostiques

ou thérapeutiques
10 kDa

validation de nouveaux médicaments

Rétine normale Rétine pigmentée

Molecular and Cellular Proteomics, 2, 494-505, (2003).

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Application 2 Application 2
Analyse protéomique différentielle par électrophorèse bidimensionnelle Analyse protéomique différentielle par électrophorèse bidimensionnelle
pH 3.0 Etat A pH 10.0 pH 3.0 Etat B pH 10.0 pH 3.0 Etat A pH 10.0 pH 3.0 Etat B pH 10.0

200 kDa 200 kDa

10 kDa 10 kDa

Excision du spot d’intérêt  La précision de mesure de masse permet d’identifier une protéine d’intérêt:

Une MM un enchaînement en AA une protéine !

Identification de la protéine
Par spectrométrie de masse Problème : Limitation par la gamme de masse

La précision de mesure de masse : La précision de mesure de masse :

Une nécessité en protéomique ! Une nécessité en protéomique !
N-ter C-ter 1 N-ter C-ter 1 2 1234.68
Protéine d’intérêt Protéine d’intérêt 606.14
875.46
1002.27
550.45

1. Génération de peptides 1. Génération de peptides

par action d’une enzyme spécifique par action d’une enzyme spécifique
(trypsine) (trypsine)
2. Mesure de la masse moléculaire
de chaque peptide avec une précision de qques ppm !

La précision de mesure de masse : Application 2

Analyse protéomique différentielle par électrophorèse bidimensionnelle
Une nécessité en protéomique !
Liste de masses Génome
N-ter C-ter 1 2 1234.68 expérimentales
Protéine d’intérêt 606.14 373.23
875.46
1002.27 424.20 Banques de données
373.23
550.45 474.29 de séquences
474.29
Comparaison protéiques
507.25 581.31
1. Génération de peptides 537.32
3 638.38
par action d’une enzyme spécifique Séquences de tous
581.31 863.45 les peptides de
(trypsine) 638.38 864.40 digestion
2. Mesure de la masse Interrogation dans 716.38
846.22
de chaque peptide les banques de données 992.41
863.45 Détermination Calcul des masses
3. Existe t-il dans les banques de données une protéine protéine moléculaires pour tous les
864.40
peptides de digestion
dont certains peptides trypsiques ont la même masse (à +/ - 0,xx Da) que 716.38
certains des pics mesurés?
992.41

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Exemple de recherche sur MS-Fit (mesures ESI) MS-Fit donne la liste des peptides reconnus par leur
masse moléculaire et la séquence correspondante

Résultats d'une recherche .

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