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ANNALES  DES  SCIENCES  CLINIQUES  ET  DE  LABORATOIRE,  Vol.  23,  n°  6  
Copyright  ©  1993,  Institute  for  Clinical  Science,  Inc.

Détection  de  variants  d'hémoglobine  à  partir  
d'échantillons  de  sang  séché  par  
chromatographie  liquide  haute  performance* !
P.  DANTE  ROA,  Ph.D.,  ERNEST  A.  TURNER,  M.D.,t  et  MARIA  D  EL  
PILAR  AGUINAGA,  Ph.D.§

Centre  complet  de  drépanocytose,
Départements  de  pédiatrie,  d'obstétrique  et  de  gynécologie,  §
Collège  médical  Meharry,
Nashville,  Tennessee  37208

ABSTRAIT

La  commodité  des  échantillons  de  papier  filtre  de  sang  séché  pour  les  programmes  de  
dépistage  génétique  nous  a  incités  à  tester  la  stabilité  de  ces  échantillons  pour  l'identification  
de  l'hémoglobine  par  chromatographie  liquide  à  haute  performance  échangeuse  de  cations.  
Ce  rapport  montre  que  l'identification  de  l'Hb  AA,  de  l'Hb  AF,  de  l'Hb  AS,  de  l'Hb  FAS,  de  l'Hb  
AJ,  de  l'Hb  FJ,  de  l'Hb  EF  et  de  l'Hb  SS  peut  être  obtenue  par  chromatographie  liquide  à  
haute  performance  même  après  six  semaines  de  stockage  à  température  ambiante.  En  outre,  
une  quantification  précise  de  l'hémoglobine  peut  être  obtenue  à  partir  des  mêmes  échantillons  
dans  les  trois  semaines  suivant  le  stockage  à  température  ambiante.
La  combinaison  d'échantillons  de  sang  séché  et  de  chromatographie  liquide  à  haute  
performance  fournit  un  système  précis  pour  dépister  les  hémoglobinopathies,  même  après  
de  longues  périodes  de  stockage  d'échantillons  dans  des  conditions  ambiantes.

Introduction Dans  le  temps,  une  mauvaise  résolution  des  
bandes  d'hémoglobine  (Hb)  peut  se  produire  et  
interférer  avec  l'identification  précise.9  Les  limites  
Les  échantillons  de  sang  prélevés  sur  du  papier  
filtre  sont  utilisés  pour  les  programmes  de   des  techniques  conventionnelles  ont  incité  
dépistage  génétique  néonatal,  y  compris  la   l'utilisation   de  procédures  plus  sensibles,  telles  que  
drépanocytose.  Les  méthodes  électrophorétiques   l'électrophorèse   à  focalisation  isoélectrique  (IEF)  
conventionnelles  (électrophorèse  sur  gélose  à   et  l a  
c hromatographie   liquide  à  haute  performance  
l'acétate  de  cellulose  et  au  citrate)  sont  largement   (HPLC). ).
utilisées  pour  dépister  les  échantillons  de  sang   La  détection  des  types  d'hémoglobine  à  partir  
séché  à  la  recherche  d'hémoglobinopathies.2,8,10   de   sang  séché  à  l'  aide  de  l'IEF  a  été  déconseillée  
en  
Cependant,  si  l'analyse  est  effectuée  quelques  jours  après   raison   de  l'apparition  de  bandes  floues  qui  rend  
le  prélèvement
difficile  l'identification  des  variantes  courantes  de  
l'hémoglobine.5  Dr  M.  d.  P.  Aguinaga,  employé  
hémoglobinopathies  à  partir  d'  échantillons  liquides . avec  succès  pour  l'identification  des  
Comprehensive  Sickle  Cell  Center,  Meharry  Medical  
College,  1005  DB  Todd  Blvd.,  Nashville,  TN  37208.  t  Le  
soutien  a  
été  fourni  par  NIH  Grant  P60­
HL38737  et  GM  08198.

0091­7370/93/1100­0433  00,90  $  ©  Institut  des  sciences  cliniques,  Inc.
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4  3  4 ROA,  TURNER  ET  AGUINAGA

L'HPLC  e
, st  plus  précise  et  fournit  de  meilleurs   la  phase  A,  contenant  du  bis­tris  40  mM  et  du  KCN  4  
modèles  de  séparation  que  l'IE  F  .3  La  présente  étude   mM  à  pH  6,5,  et  la  phase  mobile  B,  contenant  du  bis­
répond  à  la   tris  40  mM,  du  KCN  4  mM  et  du  NaCl  0,2  M  à  pH  6,8,  
nécessité  d'utiliser  des  techniques  sensibles,  telles   ont  été  réglées  avec  un  débit  de  2,0  ml  par  minute  
que  l'HPLC,  pour  l'identification  et  la  quantification   taux.  L'équipement  utilisé  consistait  en  un  système  
correctes.  de  variants  d'hémoglobine  à  partir  de  sang   de  distribution  de  multisolvants  600  E  avec  un  
séché.  Nos  résultats  ont  montré  que  toutes  les   détecteur  UV/VIS  accordable  700  WISP,  484  interfacé  
variantes  d'hémoglobine  testées  (Hb  AA,  Hb  AF,  Hb   avec  un  programme  de  poste  de  travail  de  
AS,  Hb  FAS,  H  b  AJ,  Hb  FJ,  Hb  EF  et  Hb  SS)   chromatographie  Baseline  810.  À  la  fin  de  chaque  
pouvaient  être  correctement  identifiées  même  après   analyse,  un  pic  qualitatif  et  quantitatif  les  résultats  
six  semaines  et  quantifiées  avec  précision  après  trois   d'intégration  ont  été  automatiquement  exécutés  par  le  
semaines  de  stockage  dans  des  conditions  ambiantes. système  informatique  HPLC  de  W  ater  incorporé.

Méthodes Résultats
Des  échantillons  de  sang  de  nouveau­nés  et  
d'adultes  provenant  d'individus  dépistés  au  Comp   Test  de  validation  HPLC

prehensive  Sickle  Cell  Center,  Meharry  Medical  
Le  sang  anticoagulé  de  157  adultes  présentant  des  
College,  Nashville,  Tennessee,  ont  été  prélevés  dans  
profils  d'Hb  AA  normaux  a  été  déposé  sur  du  papier  
des  tubes  capillaires  héparinés  ou  des  tubes  d'acide  
filtre,  séché  et  élué  chaque  semaine  pendant  10  
éthylènediam  inététraacétique  (EDTA),  déposés  sur  
semaines  consécutives.  Les  évaluations  quantitatives  
des  disques  de  papier  filtre  A  &  S  903,  et  stocké  dans  
HPLC  sont  présentées  dans  la  figure  1.  Chaque  point  
l'obscurité  à  température  ambiante  (TA)  jusqu'à  10  
d'analyse  représente  les  résultats  de  six  à  22  
semaines.  Tous  les  sept  jours  pendant  10  semaines  
échantillons.  En  surveillant  attentivement  les  
consécutives,  chaque  échantillon  de  sang  séché  a  
chromatogrammes  de  pointe,  il  a  été  possible  d'établir  
été  transféré  dans  un  tube  Eppendorff  de  1,5  ml  et  
des  valeurs  relatives  en  pourcentage  (base  100).  
élué  avec  un  réactif  hémolysat*,  centrifugé  à  12  000  
Ces  résultats  ont  démontré  une  diminution  de  la  
tr/min  pendant  15  minutes  à  4  °C  et  filtré  à  travers  un  
composante  Hb  A  de  100 %  (échantillon  de  liquide  de  
filtre  de  0,45  |xm  unité  dans  un  autre  tube  de  1,5  ml.  
référence)  à  0 semaine  (temps  zéro)  à  78 %  à  
Ces  échantillons  d'hémolysat  pourraient  être  analysés  
immédiatement  ou  conservés  à  —  70°C  jusqu'à  un   10 semaines,  c'est­à­dire  que  les  échantillons  de  
papier  filtre  de  sang  séché  ont  montré  une  
an.  Des  hémolysats  provenant  d'échantillons  de  sang  
augmentation  des  produits  de  dégradation  et  du  fond  
anticoagulant  à  utiliser  comme  témoins  ont  été  
à  22 %.  %  après  10  semaines.
préparés  de  la  même  manière.

Des  hémolysats  (10  jxl)  provenant  de  papier  filtre  de   Q  ual  it  at  iveand
sang  séché  et  d'échantillons  de  sang  liquide  ont  été   Q  uant  it  at  ive  An  alys  is
transférés  dans  des  flacons  Nalgene  de  style  H  pour  
La  figure  2  montre  des  chromatogrammes  
la  détection  et  la  quantification  des  variantes  de  
représentatifs  des  hémoglobines  AF,  AS  et  SS  
l'hémoglobine  à  l'aide  d'un  programme  HPLC5  et  
pendant  une  période  de  10  semaines.  Le  composant  
d'une  colonne  en  acier  inoxydable  PolyCat  A  300  
Hb  F  de  départ  de  l'Hb  AF  est  de  cinq  pour  cent  dans  
remplie  de  polymère  cationique  hydrophile .t  Un  
le  contrôle  liquide,  et  les  deux  peuvent  être  identifiés  
gradient  composé  de  m  obiles
après  jusqu'à  six  semaines  de

*  Helena  Laboratories,  Beaumont,  TX  77704­0752.  
t   t  Waters,  Division  de  Millipore,  Milford,  MA  01757.
Polylc,  Columbia,  MD  00000.
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DÉTECTION  DES  VARIANTS  D'HEM  OGLOBINE  À  PARTIR  D'ÉCHANTILLONS  DE  SANG  SÉCHÉ  PAR  HPLC 435

TEMPS  EN  SEMAINES
FIGURE  1.  Test  de  validation  HPLC :  tendances  du  pourcentage  de  chromatographie  liquide  à  haute  performance  (base  100)  
d'échantillons  d'Hb  AA  adultes  normaux  obtenus  à  partir  d'éluats  de  papier  filtre  de  sang  séché.  La  pente  indique  que  les  pertes  de  
composants  Hb  AA  sont  probablement  dues  à  des  processus  de  dégradation.

temps  de  stockage  à  température  ambiante.   ditions  rapportées,  chaque  type  d'hémoglobine  
L'analyse  quantitative  HPLC  est  exprimée  en   présente  des  formes  particulières  de  
pourcentages  relatifs  de  surface.  Les   dégradation  (figures  3  et  4).  Ces  résultats  
tendances  du  pourcentage  de  variantes   ont  démontré  que  les  pourcentages  relatifs  de  
d'hémoglobine  pour  tous  les  échantillons  de   pertes  d'Hb  AA  après  neuf  semaines  sont  de  
sang  testés  (Hb  AA,  Hb  AF,  Hb  AS,  Hb  FAS,   22 %  ou  une  diminution  à  78 %  (figure  3,  
Hb  AJ,  Hb  FJ,  Hb  EF  et  Hb  SS)  ont  montré  que  spanneau  
ous  le  con
A),  ce  qui  est  en  accord  avec  le  pourcentage

TEMPS  DE  RÉTENTION  EN  MINUTES

FIGURE  2.  Chromatogrammes  représentatifs  de  chromatographie  liquide  à  haute  performance  d'échantillons  de  sang  séché  Hb  A ,   F  Hb  AS  
et  Hb  SS :  des  éluats  de  papier  filtre  sanguin  séché  ont  été  préparés  après  0,  1,  6  et  10  semaines  de  stockage  des  échantillons  à  température  
ambiante.  Les  variants  d'hémoglobine  ont  été  séparés  par  HPLC  échangeuse  de  cations.  La  quantification  des  variants  d'hémoglobine  
(pourcentage  relatif)  a  été  effectuée  en  intégrant  les  aires  de  pic  respectives.
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4  3  6 ROA,  TURNER  ET  AGUINAGA

Figure  3.  Tendances  en  pourcentage  des  échantillons  de  sang  séché  Hb  AA,  Hb  AF,  Hb  AS  et  Hb  FAS  par  chromatographie  
liquide  à  haute  performance :  Les  pourcentages  absolus  pour  chaque  variant  d'hémoglobine  sont  donnés  à  chaque  instant.  Les  
éluats  sanguins  ont  été  préparés  à  partir  de  papiers  filtres  sanguins  séchés  conservés  à  température  ambiante  jusqu'à  10  
semaines.

pertes  de  tendance  selon  l'âge  observées  pour   Dans  ce  cas,  la  présence  d'Hb  F  peut  avoir  
l'Hb  AA  dans  le  test  de  validation  HPLC  (figure  accéléré  le  processus  de  dégradation  de  l'Hb  
1).  Pour  l'Hb  AF,  les  valeurs  relatives  en   A.  L'H  b  AS  a  montré  des  valeurs  de  
pourcentage  de  l'Hb  A  et  de  l'Hb  F  après  neuf   pourcentage  relatives  comparables  à  zéro  
semaines  sont  de  57 %  (figure  3,  panneau  B),   semaine  (A  =  91  %,  S  =  89  %),  et  la  stabilité  
ce  qui,  si  on  le  compare  aux  résultats  obtenus   relative  apparente  des  composants  explique  
pour  l'Hb  A  seule  (78 %),  représente  une  perte   les  petites  pertes  observées  (A  =  14  %,  S  =  24  
% ),  équivalent
supplémentaire  de  21  pour  cent.  Dans  ce  particulier

Figure  4.  Tendances  en  pourcentage  des  éluats  de  papier  filtre  de  sang  séché  pour  l'Hb  AJ,  l'Hb  FJ,  l'Hb  EF  et  l'Hb  SS  par  
chromatographie  liquide  à  haute  performance :  les  pourcentages  absolus  pour  chaque  variant  d'hémoglobine  sont  donnés  à  
chaque  instant.  Les  éluats  sanguins  ont  été  préparés  à  partir  d'échantillons  de  sang  séché  conservés  à  température  ambiante  
pendant  10  semaines  maximum.
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DÉTECTION  DES  VARIANTS  D'HEM  OGLOBINE  À  PARTIR  D'ÉCHANTILLONS  DE  SANG  SÉCHÉ  PAR  HPLC 437

prêté  à  des  valeurs  d'Hb  A  de  86  %  et  des   pourcentage,  afin  de  détecter  le  pourcentage  de  
valeurs  d'Hb  S  de  76  %  après  10  semaines  de   variant  d'hémoglobine  qui  se  dégrade  au  fil  du  
stockage  (figure  3,  panneau  C).  Lorsque  F  est   temps.
présent,  c'est­à­dire  Hb  FAS,  le  pourcentage  de  
perte  pour  Hb  A  et  H  b  S  est  plus  rapide  et  plus   Discussion
important,  c'est­à­dire  A  =  36 %  et  S  =  37 %  à  
une  semaine,  passant  à  un  pourcentage  relatif   Test  de  validation  par  HPLC
de  perte  totale  après  six  semaines  de  47 %  pour  
l'Hb  A  et  l'Hb  S,  tandis  que  la  perte  pour  la   Ce  test  valide  corrobore  les  rapports  de  pertes  
composante  Hb  F  était  de  44 %. d'hémoglobine3  et  l'apparition  de  facteurs  
inconnus  qui  interfèrent  avec  l'interprétation  des  
La  détermination  quantitative  de  l'Hb  AJ   résultats  lorsqu'ils  sont  analysés  par  des  
anormale  décrit  une  Hb  A  plutôt  stable  par   méthodes  conventionnelles.9  Dans  ce  cas  
rapport  à  une  composante  Hb  J  plus  responsable   particulier,  l'analyse  de  HPLC  a  reconnu  les  
dans  les  conditions  de  stockage  rapportées. pertes  et  a  identifié  l'échantillon  (Hb  AA)  testé  
Dans  la  figure  4,  panneau  A,  la  dégradation  est   même  après  une  période  de  conservation  de  10  
illustrée  pour  Hb  A  =  3  %  tandis  que  le   semaines   à  température  ambiante.
composant  Hb  J  a  atteint  une  perte  significative  
de  36  %  après  six  semaines.  Des  évaluations  
similaires  pour  l'Hb  FJ,  figure  4,  panneau  B,  ont   Qu  al  it  at  ive  et  Q  uant  it  at  ive
indiqué  d'importantes  réductions  de  tendance   Une  analyse  par  HPLC
en  pourcentage  pour  l'Hb  F  (34  %)  et  des  pertes  
plus  importantes  pour  le  composant  Hb  J  (83  %)   L'identification  des  composants  de  
après  six  semaines  de  stockage. l'hémoglobine  à  partir  des  éluats  de  papier  filtre  
Bien  qu'un  schéma  de  dégradation  rapide  de  la   de  sang  séché  est  possible  par  l'utilisation  de  la  
composante  Hb  J  soit  observé  dans  ces  deux   HPLC  même  après  plusieurs  semaines  de  
échantillons  (Hb  AJ  et  Hb  FJ),  il  semble  que  la   stockage   dans  des  conditions  ambiantes.  Cela  
composante  Hb  F  de  l'Hb  FJ  contribue  à  la   peut  représenter  un  bon  avantage  dans  le  
disparition  rapide  de  l'Hb  J.  Pour  l'Hb  SS  après   processus  de  dépistage  sanguin  des  troubles  
une  perte  de  15  %  la  première  semaine,  il  a   de  l'hémoglobine  tels  que  la  drépanocytose,  la  
diminué  à  12  %  après  une  période  de  10   thalassémie  et  d'autres  hémoglobinopathies.  La  
semaines,  ce  qui  équivaut  à  une  perte  totale  de   détection  de  petites  quantités  d'Hb  AA  est  
27  %  (figure  4,  panneau  C).  Il  apparaît  que  l'état   particulièrement  importante  pour  faire  la  
homozygote  de  l'hémoglobine  a  un  effet  positif   distinction  entre  un  bébé  atteint  du  SAF  ou  de  
sur  le  schéma  de  stabilité  observé.  Une  situation   l'ASF.  L'analyse  par  HPLC  de  huit  échantillons  
similaire  est  observée  avec  l'Hb  EF,  figure  4,   de  sang  total  différents  a  montré  que  les  éluats  
panneau  D.  L'Hb  E,  avec  un  pourcentage  initial   de  papier  filtre  de  sang  séché  stockés  à  
de  91 %,  a  diminué  de  21 %  après  neuf   température  ambiante  pendant  plusieurs  
semaines,  mais  des  pertes  importantes  pour   semaines  souffraient  de  divers  degrés  de  
l'Hb  F  (45 %)  ont  été  observées.  Dans  ce  cas   dégradation  de  leurs  composants  d'hémoglobine,  
particulier,  la  stabilité  apparente  de  l'Hb  E  est   mais  la  sensibilité  de  cette  méthode  a  par  m  ited  
probablement  due  à  son  pourcentage  de  départ   l'évaluation  qualitative  et  quantitative  de  ces  
plus  élevé,  alors  que  l'Hb  F,  comme  indiqué   mêmes  échantillons.  Cependant,  il  n'y  a  pas  
précédemment,  est  plus  susceptible  de  se   d'études  publiées  qui  estiment  la  sensibilité  et  
dégrader.  Dans  les  figures  3  et  4,  la  quantification   la  spécificité  réelles  de  la  CLHP  pour  le  dépistage  
de  chaque  variant  d'hémoglobine  est  donnée   de  l'hémoglobine  dans  les  opa  thies.10
en  pourcentage  absolu  et  non  relatif  par Le  vieillissement  du  sang  séché  ou  de  
l'hémolysat  peut  entraîner  une  augmentation  des  
pics  mineurs  dans  la  région  qui  élue
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438 ROA,  TURNER  ET  AGUINAGA

de  deux  à  cinq  minutes  et  bruit  de  fond  global ;   technique  de  focalisation  et  chromatographie  liquide  
à  haute  performance  pour  la  détermination  des  taux  
cependant,  la  résolution  des  principaux  pics  n'est  pas  
d'hémoglobine  fœtale.  Amer.  J.Clin.  Pathol.  96 :  
affectée  par  le  temps,  jusqu'à  six  semaines.  La  stabilité   109­110,  1991.
de  la  tache  de  sang  séché  et  la  sensibilité  de  la  HPLC   4.  H  u  iS  MA  N  T, HJ :  Utilité  de  la  chromatographie  liquide  
offrent  un  avantage  au  laboratoire  de  détection  de   à  haute  performance  par  échange  de  cations  comme  
procédure  de  test.  Pediatrics  83(Suppl.  5):849­851,  
l'hémoglobine  qui  reçoit  des  échantillons  de  sang   1989.
séché  plusieurs  semaines  après  leur  prélèvement  (c'est­ 5.  Ça  viendra ,  A.,  O  zca  n  JT,  
, e
Ot  .,al :   ,
La  do étection  
brisc   de  
à­dire  des  échantillons  provenant  de  pays  étrangers).   variants  d'hémoglobine  par  isoélectrofocalisation  à  
l'aide  d'échantillons  de  sang  de  cordon  ombilical  
En  raison  des  nombreux  avantages  du  sang  séché  par   recueillis  sur  EDTA  et  séchés  sur  papier  filtre.  Suis.  J
rapport  aux  échantillons  de  capillaires  et  de  tubes  à   Clin.  Pathol.  94:199­202,  1990.
6 .  Ou,  CN,  Buffon  et , GJ,  Reimer   , GL,  et
essai  pour  le  dépistage  des  hémoglobinopathies  (facilité  
ALPERT,  A.  J. :  Chromatographie  liquide  haute  
d'envoi  et  de  manipulation,  de  transport,  diminution  du  
performance  de  l'hémoglobine  humaine  sur  un  nouvel  
risque  d'infection  par  bris  de  verre  et  renversement),   échangeur  de  cations.  J.  Chromatog.  266:197­205,  
con  tin  Des  améliorations  des  méthodes  de  détection   1983.

sont  nécessaires,  ainsi  que  des  procédures  pour   7.  R  oger  s   , B . B ., Wessel  s , R.  A.,  Ou,  C.  N  et  .,GF :  

B  uffon  e , La  chromatographie  liquide  à  haute  
minimiser  les  processus  d'oxydation  et  de  dégradation   performance  dans  le  diagnostic  des  hémoglobinopathies  
de  l'hémoglobine  qui  se  produisent  pendant  le   et  des  thalassémies.  Amer.  J.Clin.
Pathol.  84:671­674,  1985.
stockage  à  température  ambiante.
8 . S  chedlbaue  r , LM  et  P  as  s  K.  A. :  ,Électrophorèse  
sur  gélose  à  l'acétate  de  cellulose/citrate  d'hémolysats  
de  papier  filtre  provenant  d'une  tige  de  talon.  Pediatrics  
83(Suppl.  5):839­842,  1989.
9.  Schmid  t  RM,  
, B  ros  io  u  s  et  al :   , EM,  Hollande  d ,
S ., Utilisation  d'échantillons  sanguins  prélevés  sur  du  
Remerciements papier  filtre  dans  le  dépistage  des  hémoglobines  
anormales .  Clin.  Chim.  22:685­687,  1976.
Les  auteurs  remercient  le  Dr  Bettie  Nelson­Knuckles  
pour  son  aide  dans  l'analyse  statistique  des  données  et   10.  Département  américain  de  la  santé  et  des  services  
sociaux.  Ligne  directrice :  Dépistage  en  laboratoire  de  
Mme  Falicia  Terrell,  MT  (ASMT),  pour  l'électrophorèse  de  
la  drépanocytose.  Laboratoire.  Méd.  24:515­522,  1993.
l'hémoglobine.
11.  Wessel  _ , R.  A.,  R  oger  s   , BB,  O  toi , CN,  et  al :  
Les  références Chromatographie  liquide  utilisée  dans  le  diagnostic  
d'une  combinaison  d'hémoglobine  rare :  hémoglobine  
1.  BISSE , E.  et  W  lELAND,  H. :  Séparation  par   S/Lepore­Boston.  Clin.  Chim.  32:903­906,  1986.
chromatographie  liquide  à  haute  performance  des  
hémoglobines  humaines.  Quantification  simultanée  des   ilson  T.  H.   , JB,  W  pierre  de  droite , RN  et  Huis  12.  W  
hémoglobines  fœtales  et  glyquées.  J.  Chrom.   homme , J. :  Procédure  de  chromatographie  liquide  

434:95­100,  1988. haute  performance  à  échange  cationique  rapide  pour  
2.  Garri  c  M.  ,D ,  P.  e.,t  Guthri  e  D  embur  e  R. :   , la  séparation  et  la  quantification  des  hémoglobines  S,  
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