Hémogramme

L’hémogramme consiste en une analyse

quantitative et qualitative (morphologique)
des éléments figures du sang.
Il consiste a:
1-Faire la numération des cellules sanguines
circulantes
2-Mesurer ou calculer les constantes
hématimetriques
3-Etablir la formule leucocytaire
4-Etudier la morphologie des cellules sanguines
Selon les cas, on peut faire une numération des
réticulocytes.
 I) Numération des GB et GR:
A) Principe de la numération sanguine: est basé sur la
dilution du sang et le comptage des cellules dans un
volume de 1 mm3
Le sang est dilué:
- 1OO fois dans de l'eau physiologique pour les hématies
- et 1O fois dans la solution de LAZARUS pour les
globules blancs en.
Le comptage est réalisé en microscope optique en
utilisant une cellule de numération dotée d'une cuvette
microscopique de 1 mm3 de volume et dont le fond est
quadrillé en carrés. (cellules de MALASSEZ)
B) Mode opératoire:
a) préparation de la dilution: utilisation de la pipette de
POTAIN
La grande pipette est marquée 1O1 au-dessus de la
boule, elle sert au comptage des hématies dont le
nombre est très grand. On dilue donc 1 partie de sang
pour 1OO parties de l'eau physiologique ou s° Marcano.
La petite est marquée 11 elle sert à diluer le sang au
1/1Oème avec la solution de LAZARUS qui détruit les
hématies et colore les globules blancs.
- Bien agiter par retournement pendant 1 minute
- Laisser reposer dans la pipette pendant quelques minutes
b) Comptage:
- Bien nettoyer la cellule avant utilisation
- Prendre la pipette de POTAIN et soufflez pour rejeter les
premières gouttes contenues dans la tige.
- Déposer alors une goutte du mélange sur la zone
quadrillée de la cellule.
- Recouvrir d'une lamelle en évitant les bulles d'air.
- Disposer sous le microscope au grossissement de 40 fois
et compter les cellules.
• Pour le comptage des hématies: dénombrer les GR
dans 1O petits carreaux et faire la moyenne MH
( les carreaux seront choisis au hasard).

MH= (C1+C2+...............C10) / 10

Le nombre d'hématies NH = MH X 2000 X 100

(hématies / mm3 .)

1mm3 = 2000 petits carreaux, dilution du sang 100.

• Globules blancs: leur nombre étant plus réduit on
comptera sur les grands carreaux, on choisira 5 au
hasard et faire la moyenne MGb

MGb=( R1+R2+.....................R5) / 5

Nombre de Globules blancs NG = MGb X 100 X 1O

( Gb /mm3)

1mm3 = 100 grand carreaux et dilution du sang 1O fois

C) Cellule de MALASSEZ:
• Elle est composée d'un certain nombres de traits,
délimitant en fait 10 rectangles horizontaux , 10
rectangles verticaux formant ainsi 100 grands carreaux,
dont certains sont subdivisés en 20 petits carreaux
• Longueur = 2,5 mm Largeur = 2 mm
Profondeur = 0,20 mm
• Le volume total de la cellule est de 1 mm3 (=2,5 x2 x
0,20)
 II) Détermination de l'hématocrite

A) Principe: L’hématocrite est plus précisément le volume

occupé par la masse cellulaire dans un litre de sang. Il
s’exprime en litre par litre (L/L) (Unité Internationale) ou,
dans la pratique courante, en pourcentage (%).

L’hématocrite est déterminé par centrifugation d'une

quantité précise de sang (tubes à hématocrites calibrés) et
lecture du rapport masse cellulaire / plasma par lecture
directe sur le tube (le résultat est exprimé en %).
B) Mode opératoire:
Utiliser les tubes capillaires de type micro-hématocrite, ils
comportent deux repères colorés .
- Plonger l’une des extrémités dans le sang rendu
incoagulable, le sang monte par capillarité.
- Ajuster exactement les niveaux aux repères colorés et
boucher les extrémités à l’aide de pâte à modeler.
- Mettre le tube dans la centrifugeuse pendant 1O minutes
à 1300T/min.
- Lire le niveau atteint par le culot : utiliser pour cela le
gabarit de lecture en faisant coïncider les repères du
tube avec ceux du gabarit.
 III) Dosage de l’hémoglobine:
A) principe du dosage, méthode de
Drabkin: Toutes les formes d'hémoglobine se transforment
en cyanmethémoglobine sous l'action de Cyanures.
L'intensité de la coloration, mesurée par
spectrophotomètre à 540 ,est directement
proportionnelle à la concentration en hémoglobine.
B) Mode opératoire:
a) Réalisation de la droite d’étalonnage:
La droite d’étalonnage doit être refaite à chaque fois
que l’on refait le réactif de Drabkin
1. Préparer 2 dilutions du sang dont on connaît la
concentration en Hb
-A effectuer en tubes à hémolyse à partir du sang bien
homogénéisé
- Liquide dilution : .si possible sérum physiologique (NaCl 9
g/litre)
- Après introduction du sang dans le liquide de dilution il est
indispensable de bien rincer la paroi de l'embouts par
aspirations et refoulements successifs.
 Sérum Etalon
physiologique

Dilution n°1 0,3 ml 0,7 ml

Dilution n°2 0,5 ml 0,5 ml

Soit C la concentration en Hb (g/dl) dans le sang étalon

.la concentration C1 dans la dilution n°1 est C x 0,7 g/dl

.la concentration C2 dans la dilution n°2 est C x 0,5 g/dl

Exemple : C = 15,0 g/dl C1 = 10,5 G/dl C2 = 7,5 g/dl

2. Préparer 4 tubes à hémolyse de la
manière suivante
Tube 1 ( blanc Rf) Tube 2 Tube 3 Tube 4

R. de Drabkin 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

Etalon 0 20 µl 0 0

Dilution n° 1 0 0 20 µl 0

Dilution n° 2 0 0 0 20 µl
3. Tracer la droite d’étalonnage sur
papier millimétré
.abcisses : concentrations d’Hb ;
.ordonnées : absorbance
b) Réalisation du dosage dans le sang des patients
Tube blanc Tube CQ Tube patient

R. de Drabkin 5 ml 5 ml 5 ml

Sang contrôle 0 20 µl 0

Sang patient 0 0 20 µl

- Mesurer l’absorbance des tubes « CQ » et « Patients » à

cette même longueur d’onde.
-Déterminer la concentration en Hb en se référant à la droite
d’étalonnage
- Si le résultat du CQ est conforme au résultat attendu on
peut valider le résultat des
patients.
 IV) Méthode automatique
a) La variation d’impédance : (principe Coulter)
Dans le principe décrit par Coulter (1956), les cellules
sanguines sont utilisées pour interrompre un courant
passant entre deux électrodes appliqué au niveau d’un
micro-orifice.
Les cellules en passant à travers cette ouverture génèrent
une impulsion liée à l'augmentation temporaire de
résistivité dont l'amplitude est proportionnelle au volume de
la cellule analysée. Les impulsions sont comptées et leurs
amplitudes mesurées.
Connaissant le volume de suspension aspiré on peut en
déduire le nombre de cellules dans un volume de sang
donné et mesurer leurs tailles. L'hématocrite peut être
aisément calculé.
La mesure optique : (Laser)
Dans cette méthode plus récente le spécimen sanguin, très
dilué.
Comme dans le principe Coulter, les cellules passent dans
une cuve où il est exposé à un rayon laser.
Chaque fois qu'une cellule traverse le faisceau, elle
déclenche une impulsion dont l'amplitude est
proportionnelle à son volume. Connaissant le volume de
spécimen dilué ayant traversé la cuve et après traitement
électronique approprié des impulsions, la valeur de
l'hématocrite peut être calculée.
 1) Analyse de la lumière diffuse

2) Analyse de la fluorescence
Pour le principe du dosage de l’Hb par les méthodes
automatique est basé également sur la spectrophotométrie

Après lyse des globules rouges par une solution de lyse

(Drabkin pour la méthode manuelle) par réactif «lyse »
, l’Hb est convertie en un chromogène stable
(cyanméthémoglobine).
L’absorbance lue est directement proportionnelle à la
concentration en Hb.
V) Hématimetrie
Constantes érythrocytaires en fonction des unités le plus
souvent exprimées
Hte = Hématocrite en %
Hb = Hémoglobine en g/dl
num GR = Globules rouges ou Hématies en Téra/Litre
1) Volume Globulaire moyen (VGM).
C’est le volume moyen occupé par une
hématie exprimé en femtolitre (fl) ou
microns cube.
• Calcul : VGM = (Hte / num GR) x 10.
• Normale : de 85 à 95 μ3 ou fl.
Microcytose < à 85 μ3.
Macrocytose > à 95μ3.
3)Teneur corpusculaire moyenne en
hémoglobine (TCMH) (ou teneur globulaire
moyenne en hémoglobine (TGMH)).C’est la
quantité moyenne d’hémoglobine par
hématie exprimée en picogrammes (pg) :
• Calcul : TCMH = (Hb / num GR )x 10.
• Normale chez l’adulte : 27 à 38
picogrammes. Elle varie avec l’âge : elle est
plus élevée chez le nouveau-né, elle
diminue par la suite.
2) Concentration corpusculaire moyenne
en hémoglobine (CCMH)
C’est le pourcentage de saturation des
hématies en hémoglobine exprimé en % :
• Calcul : CCMH = (Hb / Hte) x 100.
• Normochromie : 32 à 35 %.
Hypochromie < 32 %.
Les hématies étant normalement saturées
en hémoglobine, la CCMHB ne peut être,
patologiquement, supérieure à la normale.
 VI) Valeurs normales:
La lignée rouge

Homme Femme Enfant

Nbre des GR (106/mm3) 4.5- 6.2 4 - 5,4 3,6 - 5

Hb (g/dl) 13- 18 11,5 - 16 11- 14

Hte (%) 40- 54 35- 47 36- 44

VGM : 80-100 fl
CCMH : 32-36%
TGMH : 27-32pg
• FROTTIS SANGUIN
 INTRODUCTION
L’étude du frottis globulaire autorise :
 l’analyse de la morphologie des globules
rouges(forme anormales,parasite ).
 l’identification de leucocytes pathologiques :
en cas d’anomalie quantitative ou qualitative détectée
par l’automate ou déclenchement d’alarmes par
l’automate, en cas de présence de nombreux
érythroblastes (prématuré, nouveau-né, certaines
hémopathies).
 d’apprécier la taille et le contenu des plaquettes ainsi
que la présence d’éventuels agrégats plaquettaires
permettant de suspecter une fausse thrombopénie.
 Etape N° 1

Réalisation d’un frottis

INTRODUCTION
Bon frottis: de bonne taille (½ à ¾ de la lame)
de bonne densité, goutte étalée en entier,
distant des bords de la lame
donc accessible en tout point
à l’observation microscopique
Ce qu’il ne faut pas faire
 INTRODUCTION
Nous analyserons :
les cellules anuclées du sang : les
globules rouges et les plaquettes ;
puis les cellules nuclées : les leucocytes
ou globules blancs .
 Etape N°2

Coloration au May-
Grünwald-Giemsa
(MGG)
-le May Grünwald (éosine – bleu de méthylène)
-le Giemsa (éosine – azur de méthylène) sur les éléments
cellulaires complémentaires permet d'obtenir quatre
affinités :
• Acidophile: du gris au légèrement rosé
• Basophile: violet foncé au noir
• Neutrophile: rose-violet
 Etape N° 3

Lecture du frottis
Examen des globules rouges
• Diametre:7-7,5
• Noyau: anucléés
• Cytoplasme:pas de
granulations.
• A l’état normal, tous les
globules rouges ont
sensiblement la même
forme, même diamètre,
même coloration et toute
modification traduit un
phénomène pathologique
 Examen des globules rouges
1. les variations de taille
 Examen des globules rouges

microcytose macrocytose anisocytose

 Examen des globules rouges
2. les variations de coloration de l’hématie
 Examen des globules rouges
 Les hématies normales
examinées après
coloration usuelle de
May-Grünwald-Giemsa
ont un aspect rosé. Un
aspect pâle de l’hématie
est noté en cas de défaut
de synthèse de
l’hémoglobine
(hypochromie).
Hypochromie
Cellule cible
- l'aspect sur frottis:
l'hémoglobine étant
répartie en périphérie
et au centre de la
cellule;
- les cellules cibles
s'observent surtout au
cours des carences
martiales et les
thalassémies
 Examen des globules rouges
2. Annulocyte
- c'est une hématie dont
le centre clair est
anormalement
important; cet aspect
correspond à une
hypochromie, le plus
souvent observée au
cours des grandes
anémies ferriprives.
 Examen des globules rouges
 La polychromatophilie
- traduit un contenu
inhomogène de l’hématie
avec coexistence de
zones acidophiles (roses)
et basophiles (bleutées)
(les hématies
apparaissent plus bleues
qu’oranges) : il traduit
l’augmentation du taux
circulant de réticulocytes
en rapport avec une
érythropoïèse accélérée
dans les intenses
régénérations
médullaires (hémorragies
aiguës, hémolyses
 Examen des globules rouges
3. variations de forme

anomalie morphologique érythrocytaire : poïkilocytose

 Acanthocyte
- l'hématie présente des
spicules irréguliers en
nombre variable (3 à
12), de taille et de
répartition inégale,
souvent terminée par
une extrémité
arrondie; en feuille
d’acanthe ou
hématies en oursin ;
 Drépanocyte ou ,
hématie falciforme
- l'hématie prend une
forme allongée,
classiquement en
forme de faucille ou
de croissant, avec
deux spicules
bipolaires : extrémités
pointues, plus ou
moins effilées ;
- cet aspect est
spécifique de la
drépanocytose.
Dacryocytes ou
hématies en larme,
en poire
- les hématies ont la
forme d'une poire
avec une extrémité
arrondie et l'autre
allongée, plus ou
moins effilée;
 Elliptocyte ou ovalocyte
• - l'hématie est dans ce
cas allongée, ovale ;
parfois très allongés,
mais les extrémités sont
toujours arrondies, sans
spicules, comme les
drépanocytes;
• - cet aspect s'observe au
cours de l'elliptocytose
héréditaire, pathologie
congénitale de la
membrane du globule
rouge;
 Rouleaux d'hématies
- les globules rouges
peuvent parfois
s'accoler les uns aux
autres, réalisant une
image de rouleaux ou
de piles d'assiettes;
- cet aspect est observé
au cours des
gammapathies
monoclonales ou
après perfusion de
macromolécules.
 Schizocyte
- correspond à un
fragment d'hématie
irrégulier, de taille et
de forme variables,
pouvant comporter
deux ou trois
extrémités pointues.
L'hématie prend
parfois la forme d'un
casque.
- Cet aspect est
observé au cours :
• microangiopathiques
• prothèses valvulaires
cardiaques
• des brûlures sévères
 Stomatocyte ou
mouth cell
• - globules rouges en
forme de bouche ;
• - on l'observe au
cours d'anomalies
congénitales de la
membrane des
hématies :
stomatocytose.
 Examen des globules rouges
sphérocytes
 Examen des globules rouges
4. Inclusions intra-érythrocytaires
Il s’agit :
 Anneaux de Cabot
 corps de Jolly
 Ponctuations basophiles
Examen des globules rouges
Examen des globules rouges
Les parasites
Plasmodium: divers
aspects
morphologiques
sont observables en
fonction du stade de
maturation du
parasite dans
l'hématie
 Examen des globules rouges
5. Artéfact : fixateur de la coloration pas
totalement anhydre ou GR agglutinés
 Numération des Réticulocytes
A) Principe: Certains colorants, tels le bleu de crésyl
brillant ou le bleu de méthylène nouveau, en se fixant les
restes de ribosomes, de mitochondries et d’ARN, forment
un précipité d’aspect réticulé, visible au microscope (*100)

Le taux de réticulocyte permet d’apprécier la production

médullaire quotidienne des globules rouge qui est de 0.5 à
2% chez un sujet adulte ↔ 25000 – 100 000 /mm³.
B) Mode opératoire:
a) coloration:
• Mélanger dans un petit tube 100µl de sang avec 50µl
de réactif
• Mettre à une température proche de 37° pendant 10 à
20 minutes, sans surchauffer
• Préparer des frottis très minces, laisser sécher. Ne pas
contrecolorer
b) Numération
- Se placer sur des zones dans lesquelles les érythrocytes
sont bien étalés et ne se chevauchent pas et où la densité
d’érythrocytes est à peu près la même :
- On compte le nombre de réticulocytes pour 1000
Hématies (correspondant dans ce cas à environs 5 champs).
- On obtient un nombre de réticulocytes pour 1000 que
l’on divise par 10 pour obtenir un pourcentage.
- Convertir le % en une valeur absolue:
Nbr de GR (donné par numération cellulaire) 100%
Tx de Rét % calculé
Exemple:

sur 1100 hématies (rétic+ GR mûres) 50 rétic

100 hématies (rétic+ GR mûres) % de rétic

% rétic= 100× 50/1100 = 4,5%

Conversion en valeur absolue:

Nombre de GR donné par comptage cellulaire est de 4,2 × 106 elts/mm3
Donc le taux de réticulocytes sera égale à

4,2 × 106 elts/mm3 V 100%

Taux de rétic 4,5%

Taux de rétic= 4,5 × 4,2 × 106

100
Taux de rétic= 189 103 elts/mm3
Le taux de réticulocyte permet donc préciser
le mécanisme périphérique ou central d’une
anémie
• Lorsque le taux de réticulocyte est < 120000/mm³ →
anémie Arégénérative anémie centrale
• Si le taux de réticulocyte est > 120 000/mm³ →
anémie Régénérative anémie périphérique