Ministère de l’enseignement Supérieur et de la recherche scientifique

Université Frères Mentouri Constantine 1

Sciences de la Nature et de la Vie Filière
Sciences Biologiques/ Biologie animale
Spécialité / Immunologie Moléculaire et Cellulaire Pr. CHETTOUM Aziz

TP No 05 : Dosage de l’hémoglobine sanguine et mesure de l’hématocrite

But : le but de cette manipulation est de déterminer la concentration en hémoglobine d’un

échantillon du sang frais prélevé sur EDTA.

Théorie : l’hémoglobine est une protéine riche en fer qui se trouve dans les globules rouges et
qui leur permet de transporter l’oxygène jusqu’aux tissus. Sa concentration est directement liée
à l’état de santé du patient (anémie) et apparait sur un hémogramme. Une fois mesurée, elle est
comparée aux valeurs de référence

Homme13 /18 g/dl

Femme…12/16 g/ dl

Enfant 12/ 14g/dl

Nouveau-Né 15/ 22 g dl

Hémolyse de globules rouges :

Les globules rouges du sang dans l’échantillon doivent être lysés pour libérer l’hémoglobine
on ajoute donc du détergent pour faire éclater (solution de drabkin).

Préparation de solution de drabkin :

Solution concentré :

Ferricyanure de potassium ……………….10g ……..toxique

Cyanure de potassium (kcn)……………..2.5g……….toxique

Phosphate mono potassique………………7g

Eau distillée……………………………….1L

Solution dilué de drabkin :

1 ml de drabkin concentré avec 49ml d’eau distillée conservé au réfrigérateur

Principe de la réaction :
Le fer (Fe2+) de l’hémoglobine est oxydé en (Fe3+) de la méthémoglobine qui, à son tour réagit
avec le cyanure ionisé (CN-) pour former le cyan méthémoglobine un dérivé stable qui absorbé
a 540 nm, l’intensité de la coloration produit est proportionnelle à la concentration de
l’hémoglobine totale.

Une fois l’hémoglobine libérée, le fer (Fe2+) se fait oxyder par un oxydant pour devenir du
(Fe3+) qui n’a pas d’affinité avec l’O2 donc il ne peut plus remplir son rôle.

Formation d’un complexe coloré :

La méthémoglobine réagit avec un composé qui permettra la formation d’un complexe coloré
qu’on va mesurer par spectrophotométrie.

Méthode manuelle

Introduire dans des tubes à Blanc Dosage

essai

Réactif 5ml 5ml

Eau distillée 20ul

Sang totale 20ul

Bien rincer la pipette par aspiration refoulement dans le réactif .bien mélanger et incuber ou
moins 3 minutes à température ambiante, lire l’absorbance à 540nm contre le blanc réactif. A
l’abri de la lumière, la réaction est stable ou moins 1heur.

Calcule :

Hb(g/l) à 540nm = ABS X 367.7

Hb (g/dl) à 540nm = ABS x 36.77

Hb ( mmol) à 540nm = ABS X 22.82

 Determination de l’hématocrite (méthode de tube capillaire par
centrifugation)

Principe : la mesure de l’hématocrite (Hte) consiste à apprécier le volume occupé

par les globules rouges par rapport au volume occupé par le plasma, permettant
de rechercher une hémoconcentration ou une anémie, l’hématocrite s’exprimait
en pourcentage car c’est un rapport de volume.

Volume de globules rouges x 100

Hte =
Volume de sang total

Matériels Et Méthodes

-Echantillon du sang prélevé sur EDTA

-Tubes capillaires héparinés

-Centrifugeuse à hématocrite

-Pâte à modeler

-Echelle pour lecture de résultats

Méthode :

1- Placer l’extrémité rouge ou bleu du tube capillaire hépariné dans une goutte
de sang, le sang pénètre par capillarité. Remplir de sang le tube capillaire
au trois quart.
2- Boucher à la pâte à modeler l’extrémité de tube qui n’est pas entrée en
contact avec le sang.
3- Déposer le tube capillaire dans une des rainures numérotées du rotor de la
centrifugeuse ; l’extrémité bouchée du capillaire doit être placée vers
l’extérieur de la centrifugeuse.
4- Equilibrer la centrifugeuse en mettant les tubes capillaires l’un en face de
l’autre.
5- Fermer le couvercle et centrifuger à grande vitesse.
6- Après centrifugation, le tube contient 3couches :
  En haut, une colonne de plasma
 Au milieu, une fine couche (GB, plaquettes)
 En bas, une colonne de globules rouges

Lecture:

Mettre le tube sur l’échelle de lecture en plaçant le bas de la colonne de globules

rouges sur le 0 zéro et le haut de la colonne de plasma sur le 100.

Lire le pourcentage donné dans la fenêtre de lecture. Déplacer la latte mobile

pour que le trait coïncide avec le haut de la colonne des globules rouges.

Valeurs de références : les valeurs d’hématocrite varient en fonction de l’âge, de

sexe et de l’altitude.

Age Hte %
Nouveau-née 50 à 58
Nourrisson 3mois 35 à 40
1ans 31 à 36
5ans 33 à 37
Adulte féminin 36 à 45
Adulte masculin 42 à 49

Compte rendu : dans Cinq cas interpréter un taux élevé et un taux bas de
l’hématocrite et de l’hémoglobine