Diagnostic biologique des pathologies gntiques de l'hmoglobine

Frdric Girard Lyce Docteur Lacroix - Narbonne

1. Phase pr-analytique
La phase pr-analytique d'une tude de l'hmoglobine au laboratoire suppose de connatre le contexte de
la demande : dpistage systmatique chez un sujet risque, enqute familiale suite la mise en vidence
d'une pathologie gntique de l'hmoglobine, diagnostic tiologique d'anomalies hmatologiques (anmie
hmolytique, microcytose, pseudo-globulie, etc). Les donnes doivent galement prciser l'origine
ethnique du patient. Toute tude de l'hmoglobine comporte aussi le recueil des donnes biologiques
suivantes : hmogramme, rticulocytose, sidrmie, capacit totale de fixation de la transferrine,
ferritinmie.
2. Prlvement
Le prlvement est recueilli sur un anticoagulant (hparine, citrate ou EDTA). Il est conserv en sang total
4C. Le dlai de conservation ne doit pas excder une semaine en raison de l'apparition de fractions
dnatures dans le prlvement ainsi que la dgradation de certaines fractions comme l'hmoglobine
ftale. La recherche d'hmoglobines l'tat de trace ne peut par ailleurs se faire que sur un chantillon
frais : c'est le cas de l'hmoglobine Bart 4) prsente chez les nouveaux-ns atteints d'-thalassmie
majeure.
3. Techniques lectrophortiques d'tude de l'hmoglobine
Dans la plupart des laboratoires, l'analyse de rfrence est l'lectrophorse de zone pH alcalin (pH =
8,6) sur actate de cellulose. Elle est le premier lment d'orientation pour une exploration plus
spcialise, et est le prlude la demande d'examens complmentaires ncessaires l'interprtation de
profils lectrophortiques anormaux. Les principaux examens complmentaires sont l'lectrophorse sur
citrate agar pH acide (pH = 6,0), l'isolectrofocalisation, le test d'Itano, le test de falciformation. Dans
un petit nombre de cas, l'identification d'un mutant rare ncessite des techniques plus complexes
(lectrophorse des chanes d'hmoglobine, spectromtrie de masse) relevant de laboratoires
spcialiss.
Les techniques de quantification dpendent des fractions tudier. Le dosage de l'HbA2 fait appel des
tehcniques chromatographiques et doit pouvoir tre rendu avec une prcision de 0,1 %. Le dosage de
l'HbF est ralis par la mthode biochimique de dnaturation alcaline de Betke modifie par Pembrey.
Cette mthode est performante pour des taux d'HbF infrieurs 15 %.
3.1. lectrophorse de zone pH alcalin (pH = 8,6)
L'lectrophorse pH alcalin est ralise sur actate de cellulose pH = 8,5 0,1.
HbA2
HbC HbS
HbE HbD HbF

HbA1 HbH

+
lectrophorgrammesuractatedecellulose,pH8,6
Origine

L'HbS migre entre l'HbA2 et l'HbA1, mais plus de 50 variants ont t dcrits qui migrent au mme
endroit que l'HbS, hmoglobines anormales appartenant au groupe des hmoglobines D, G et P. L'HbS, de
loin la plus frquente, devra tre identifie par le test d'Itano o elle est la seule prcipiter en milieu
rducteur. Ces rsultats peuvent tre confirm par l'lectrophorse en citrate-agar pH acide o l'HbS
prsente une migration spcifique. Affirmer la prsence d'HbS permet aussi de poser le diagnostic de
drpanocytose htrozygote, si elle est retrouve en mme temps que l'HbA1, ou homozygote, si elle est
le seul constituant majeur. Dans ce dernier cas, l'HbF peut tre augmente dans des proportions variables.

Les hmoglobines HbC et HbE migrent comme l'HbA2. Ces deux mutants sont silencieux l'tat
htrozygote. Oriente par le contexte ethnique, la distinction peut tre ralise l'lectrophorse en
citrate-agar pH acide ou par isolectrofocalisation.
3.2. lectrophorse sur citrate-agar pH acide (pH = 6,0)
La migration des hmoglobines sur gel d'agar en citrate pH acide n'est pas proprement parler une
lectrophorse puisque la migration n'y est pas en rapport avec la charge. Dans ces conditions,
l'hmoglobine se lie de faon rversible l'agaropectine, et le complexe form migre vers l'anode. D'autre
part, le courant d'lectro-endosmose provoque une diffusion continue vers la cathode. Ces deux
mouvements de directions opposes sparent donc les hmoglobines en fonction de leur affinit pour
l'agaropectine. Cette affinit est directement lie la conformation de certaines rgions de la molcule, en
particulier celle o se situe la substitution de l'HbS, et toutes les zones impliques dans les interactions
avec les anions.
L'lectrophorse sur citrate-agar pH acide est l'un des tests classiques de diagnostic positif de l'HbS.
L'lectrophorse sur citrate-agar pH acide est l'un des tests classiques de diagnostic positif de l'HbC.
Les hmoglobines HbD et HbE migrent au mme endroit que les hmoglobines HbA.
HbC

HbS

HBA1
HbA2
HbD
HbE

HbF

lectrophorgrammesuragar,pH6,0
Origine

3.3. Isolectrofocalisation

Identification de variants de l'hmoglobine par isolectrofocalisation

Principaux variants caractriss par isolectrofocalisation

L'isolectrofocalisation est une technique trs rsolutive, et est l'heure actuelle la technique de rfrence
dans le diagnostic nonatal des hmoglobinopathies. Les diffrentes hmoglobines sont spares en
fonction de leur point isolectrique (pHi). En effet, l'isolectrofocalisation diffre de l'lectrophorse
classique par le fait que la migration, sous l'effet du champ lectrique, ne s'effectue plus dans un tampon
de pH fixe mais dans un gradient de pH (gradient de pH form grce l'utilisation de molcules
amphotres). L'lectrofocalisation permet de sparer des protines dont les pHi sont diffrents de 0,005
unit pH.
3.4. Techniques lectrophortiques des chanes d'hmoglobine en milieu dissociant
Les techniques lectrophortiques prcdentes ne tiennent compte que des charges exposes vers le
milieu aqueux environnant. Les charges diriges vers l'intrieur de la molcule ne sont pas, ou seulement
partiellement, prises en compte. Pour que toutes les charges soient exposes, l'analyse doit tre effectue
dans un milieu chaotropique.On ralise essentiellement des lectrophorses en milieu ure 6M pH 6,0 et
pH 9,0. L'ure est utilise forte concentration (6M, soit 360 g.dm -3). Elle entrane une dnaturation
complte de l'hmoglobine (disparition de la structure quaternaire, des structures tertiaire et secondaire).
La comparaison des migrations entre pH acide et pH alcalin permet de caractriser certaines mutations,
par exemple celles impliquant un rsidu histidinyl, rsidu charg positivement pH 6,0 et neutre pH

9,0. Ces lectrophorses sont parfois compltes des lectrophorses en milieu ure 6M en prsence de
dtergent (Triton-X-100).
4. Quantification des hmoglobines : exemples de rsultats

Drpanocytose htrozygote AS
HbA1 = 58 %
HbS = 35,3 %
HbA2 = 4,7 %
Non Hb = 0,2 %

Drpanocytose homozygote SS
HbS = 95,6 %
HbA2 = 4,4 %

-thalassmie
HbA1 = 0 %
HbF = 98,8 %
HbA2 = 1,2 %

5. Tests spcialiss
5 .1. tude de la fonction oxyphorique des hmaties
L'tude de la fonction oxyphorique consiste tablir la courbe de dissociation de l'oxyhmoglobine sur
des hmaties entires. L'affinit pour le dioxygne est apprcie par la valeur de la P50, pression partielle
en dioxygne laquelle 50 % de l'hmoglobine est sature en dioxygne. Une P50 leve traduit une
diminution de l'affinit et une cyanose ; l'inverse, une P50 diminue correspond un dplacement de la
courbe vers la gauche et traduit une augmentation de l'affinit pour le dioxygne, ventuellement
responsable d'une polyglobulie. Il est noter que la valeur de la P50 mesure n'a d'intrt qu'aprs avoir
dos le 2-3 DPG intrarythrocytaire. La corrlation de ces deux paramtres permet de distinguer les
anomalies de l'affinit dues une hmoglobine anormale de celles rsultant d'une perturbation du
mtabolisme du 2-3 DPG.
5.2. Dtermination du spectre d'absorption
L'tude du spectre d'absorption de l'hmoglobine est principalement ralise dans le cadre du diagnostic
des HbM. Le problme principal est la distinction entre une HbM et une mthmoglobinmie congnitale
(dficit en cytochrome b5 rductase) ou acquise.
5.3. Mesure de rapport de biosynthse des chanes de globine
La mesure des taux respectifs de biosynthse des chanes de globine peut tre apprcie en incubant
rythroblastes en prsence d'un mlange d'acides amins dont un est marqu par un traceur radioactif.
Cette tude est trs lourde dans sa ralisation pratique et ses applications diagnostiques sont limites
l'adulte.
6.Techniques de biologie molculaire
Ces techniques sont rserves certains laboratoires spcialiss et font appel classiquement la PCR,
suivie ventuellement d'tudes de modification de site de restriction, de squencage. Les principales
indications sont les suivantes :
diagnostic prnatal : propos systmatiquement lors d'une suspicion d'hydrops ftalis, de maladie de
COOLEY, d'un syndrome drpanocytaire majeur. Il permet notamment de proposer, en cas de rsultat
positif, un avortement thrapeutique.
tude pidmiologique dans une zone risque.