Chapitre II.

Techniques et instrumentations
Méthodes d’étude des biomolécules
Electrophorèse

Plan du cours

1. Définition et principes de fonctionnement

2. Les différents types d’électrophorèse
2. 1. Electrophorèse libre
2. 2. Electrophorèse sur support ou électrophorèse en zones
2. 2. 1. Electrophorèse sur papier
2. 2. 2. Electrophorèse sur gel
a. Electrophorèse horizontal sur gel d’agarose
b. Electrophorèse vertical sur gel de polyacrylamide (PAGE)
3. Les Techniques d’électrophorèse
3. 1. Electrophorèse en condition non dénaturante
3. 2. Electrophorèse en conditions dénaturantes
3. 3. Electrophorèse bidimensionnelle
3. 4. Electrophorèse en champ pulsé
3. 5. Immunoélectrophorèse
3. 6. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
3. 7. Southern blot
3. 8. Northern blot
3. 9. Western blot
3. 10. T-RFLP : Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
3. 11. DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis 1
4. Conclusion
 1. Définition et principes de fonctionnement

Support (papier ou gel)

3 composantes principales Tampon de migration
Cuve d’électrophorèse: porte le support Moule
de migration Peigne
Générateur de courant électrique continu Echantillon
Cuve de révélation des produits séparés Tampon de charge
Solution de révélation

Les molécules à séparer sont déposées sur un support imbibé ou plongé

totalement ou partiellement (par ses extrémités) dans une solution facilitant le
passage du courant. Dans cette solution (solution tampon) se trouve deux
électrodes. Les électrodes sont reliées à un générateur de courant.

2
 Anode +
Cathode -

3
 Principe de la migration électrophorétique

Champ électrique

Cathode (-) Force électrique Anode (+)

Force de friction

Ffriction = vf
Félectrique = QE
(f = 6π . ƞ . r)
Q: charge de l’ion
E: champ électrique
v: vitesse de migration
f : coefficien defrottement
Ƞ: coefficient de viscosité
r: rayon de la particule 4
 Félectrique = Ffriction
QE = vf (f = 6 π . ƞ . r)
QE = v . f soit v = QE/f

µ = v/E = Q/f
(µ = v = vitesse de migration pour un champ électrique E de 1 volt/cm)

µ: mobilité électrophorétique

Donc la mobilité d’une particule migrant dans un champ électrique uniforme dépend
de 3 facteurs :
- elle est proportionnelle à sa charge (Q)
- elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu
- elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).

La charge Q est fonction du pH isoélectrique de la particule et du pH du solvant.

5
 On appelle pH isoélectrique d'une particule (pHi ou pI) le pH pour lequel
cette particule ne migre pas dans un champ électrique

si pH > pHi charge nette négative (anion) migration vers l'anode (+)

si pH < pHi charge nette positive (cation) migration vers la cathode (-)

si pH = pHi charge nette nulle pas de migration

La différence pH – pHi détermine l'intensité de la charge Q d'une particule : plus cette

différence est grande en valeur absolue, plus la charge est importante.

6
1. La mobilité électrophorétique µ = v/E = Q / 6π . ƞ . r

2. Le champ électrique E : E = v / µ
3. Les courants liquidiens

Le courant d'électro-endosmose

Le courant d'évaporation

4. La durée de migration

5. Les facteurs liés à la nature du support

Lorsqu'une solution contenant différents électrolytes est soumise à l'action d'un champ électrique, on assiste dans un
premier temps à un phénomène de déplacement des molécules ionisées vers leur électrode respective. Les anions,
chargés négativement, se dirigent vers l'électrode positive, l'anode, alors que les cations, chargés positivement, se
dirigent vers l'électrode négative, la cathode. La force électrique qui s'exerce sur chaque espèce moléculaire dépend
de la valeur de leur charge effective qui, pour un électrolyte faible ou un amphotère, dépend du pH du milieu. 7
 2. Les différents types d’électrophorèse
Electrophorèse libre ou
Electrophorèse en veine liquide ou
Electrophorèse à front mobile

Mesurer la mobilité électrophorétique

Vérifier la pureté des protéines

Mélange par convection!!!!!

un ensemble de particules est mis en
mouvement par un mobile au sein du
mélangeur. Ceci nécessite le plus
souvent l’intervention d’une force
extérieure telle qu’une pale d’agitation
pour amener une forte énergie au
solide divisé.

Pour éviter le mélange par convection des protéines en mouvement, on doit

utiliser un appareillage lourd nécessitant de grandes quantités de produits à
analyser.

8
Électrophorèse zonale
 Electrophorèse sur support ou électrophorèse en zones

Cette technique permet de stabiliser la phase liquide grâce à l’utilisation d’un

support poreux imprégné d'un solvant tamponné.

Ce support peut être solide ou semi-solide, poreux homogène et inerte.

Champ électrique Migration

une séparation en zones distinctes ou bandes des différentes molécules chargées.

9
 Les différents types de supports

Les supports solides Les supports semi-solides

Papier wattman Gel d’agarose

Acétate de cellulose Gel de polyacrylamide

Les différents types d'électrophorèses de zones

Electrophorèse sur papier Electrophorèse sur gel

Electrophorèse sur gel d’agarose

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)

Electrophorèse en condition non dénaturante (Focalisation

isoélectrique : électrophorèse dans un gradient de pH)
Electrophorèses en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
Electrophorèse bidimensionnelle
Electrophorèse en champ pulsé
Immunoélectrophorèse (pour détecter une interaction
antigène-anticorps)
10
 Electrophorèse sur papier

Papier wattman: séparation des

acides aminées simples

Acétate de cellulose: séparation

des protéines d’un milieu
complexe (plasma)

Coloration des protéines par le rouge Ponceau

Coloration des acides aminées par la ninhydrine
L’intensité de la coloration des bandes est proportionnelle à la concentration des molécules

11
 59% 39%
4% 3%
9% 9%
11% 9%

17% 40%

Séparation des protéines sériques dans le plasma : l’albumine et les différentes classes
de globulines contenues dans le sérum des êtres vivants.

Rechercher dans les sérums des patients des modifications dans les proportions des
différentes classes des protéines sériques accompagnant certaines infections
pathologiques.

12
 Electrophorèse sur gel
Electrophorèse horizontal sur gel d’agarose

(0.6 à 3% TBE ou TAE)

Cette technique permet la séparation, la visualisation, l’étude et la manipulation

des fragments d’acide nucléique 0.2 et 20Kb.

13
1. Préparation de la moule du gel
2. Disposition des peignes
3. Préparation de gel d’agarose 0,6 à 3%: -
- Mélanger de la poudre d’agarose dans
TAE ou TBE
-Chauffer jusqu’à ébullition 1 mn
- Verser le gel dans la moule munie de
peigne
- Enlever les peignes
- Plonger le gel dans la cuve
électrophorétique remplie de tampon

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-Mélanger les échantillons à analyser avec le tampon
de charge (bleu de bromophénol+saccharose+glycérol)

-Déposer le mélange dans le puits

- Fermer la cuve par le couvercle (éviter le courant

d’évaporation)

- Appliquer un champ électrique

- Après migration plonger le gel dans une solution de

BET

-Visualiser le gel sous UV

15
 Electrophorèse vertical sur gel de polyacrylamide (PAGE)

(APS/TEMED)

Composition d’un gel de polyacrylamide

Analyse des protéines et des fragments d’acide nucléique <0,2kb

16
≠% de polyacrylamide ≠ pores de gel
Gel de polyacrylamide 6%:

Eau distillée stérile et filtrée

TBE 10 x (890 mM Tris, 890 mM acide borique et 20 mM
EDTA (pH 8,3))
Acrylamide/Bisacrylamide (30%)
APS (10% Ammonium Peroxo Disulfate dans l’eau)
Induction de la polymérisation d’acrylamide et de
N,N'-méthylène-bis-acrylamide
TEMED (Tétra-méthyl éthylène diamine)
Stabilisation de radicaux libres

17
La porosité des gels obtenus dépend de la concentration totale en monomères et de la proportion d'agent
monomère réticulant

T : concentration totale en monomères

%T = (a+b)*100/v

a : Masse d'acrylamide en g
b : Masse de bisacrylamide en g
v : Volume total de solution en ml

%T augmente => La porosité diminue

C: proportion d'agent réticulant (bisacrylamide)

%C = b*100/a+b

%C ≤ 5% Gel à porosité homogène

%C > 5% Gel à porosité hétérogène

Par augmentation du % de réticulation
18
Structure moléculaire du gel polyacrylamide

19
 Réaction de polymérisation
L'acrylamide se polymérise en longue chaîne et, de temps en temps, une molécule de bis
acrylamide est incorporée dans le polymère. La polymérisation de l'acrylamide est un
exemple de catalyse par radicaux libres initiée par l'addition de persulfate d'ammonium
APS et de TEMED. Le TEMED catalyse la décomposition des ions persulfates pour donner
un radical libre R (molécule avec un électron seul) :

Initiation de la polymérisation
Si on représente ce radical R et M un monomère d'acrylamide, on peut alors représenter
la polymérisation ainsi :

Réaction de polymérisation

La polymérisation continue jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de monomère d'acrylamide (M)
libre. Cette polymérisation incorpore des molécules de bis acrylamide comme si c'étaient
des molécules d'acrylamide, ceci ne change rien à la réaction de polymérisation en elle-
même, mais permet de lier deux polymères d'acrylamide entre eux. 20
La concentration en acrylamide du gel de séparation est fonction du poids moléculaire
des molécules à séparer.

Poids moléculaire (KDa) Pourcentage d'acrylamide (%)

10 - 40 15 - 20>
40 - 100 10 - 15
100 - 300 5 - 10
300 - 500 5
> 500 2-5

21
 3. Les Techniques d’électrophorèse
1 Electrophorèse en condition non dénaturante
La molécule d’ADN est chargée négativement

22
 La protéine peut être chargé
négativement positivement

Fonction acide carboxylique

fonction amine
Aspartate ou acide aspartique Glutamate ou acide glutamique Lysine

Fonction thiol

Arginine
Fonction guanido

Ionisation de cystéine

Histidine Fonction imidazole

Fonction alcool
Thréonine Sérine Tyrosine 23
 La protéine (dans les conditions non dénaturantes)

Négative ? positive
Migration Migration

Anode Dépôt à mi-chemin des deux électrodes Cathode

ADN/ARN
Négative

Migration

Anode

Molécule non chargée

X Pas de migration

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1 Electrophorèse en condition non dénaturante 2 Electrophorèse en condition dénaturante
Molécules non dénaturées (état natif)
T°
Séparation Dénaturation pH
Forces ioniques
Agent chimique (urée ou SDS)

La charge native
Molécules dénaturées
Isoélectrofocalisation (Le point isoélectrique)
La masse moléculaire Séparation
La structure tridimensionnelle
La masse moléculaire

A : marqueurs de masse moléculaire

X
La charge native
La structure tridimensionnelle

B et E : DBH (dopamine-β-hydroxylase)
purifiées à partir de phéochromocytomes de SDS (destruction de la structure
rat IIaire d’une protéine)
C et D : DBH purifiées à partir de Chargé négativement
phéochromocytomes humains Dénaturation des protéines
B et C: SDS + β-mercaptoéthanol (75-80 ou Fixation sur les acides aminées (2
80kDa) SDS/1 acide aminé)
D et E: SDS (170 ou 180 kDa)
β-mercaptoéthanol (destruction de
la structure IIIaire d’une protéine)
Agent réducteur : réduction des
Une électrophorèse en conditions non dénaturante
aurait donc donné une bande au delà des 300 kDa. ponts disulfures des protéines
Colonne;;.
Information sur la structure
25des
protéines
 SDS-PAGE

+ Protéine
•Charge négative
•Dénaturation des protéines
•2 SDS/1 acide aminé

26
1 + 2 = 3 Electrophorèse bidimensionnelle

27
 4 Electrophorèse en champ pulsé

Le champs électrique multidirectionnel

• Renforcer la migration des ADN>10kb
Agarose ADN 50pb

1µm 18µm

Champs électrique multidirectionnel

• Séparation d'ADN < 1 kb (cellule incluses

dans des blocs d’agarose)

Chaque changement de champ électrique

réoriente la molécule d’ADN dans le gel
augmentant ainsi la probabilité que la
molécule d’ADN soit orientée de façon à ECP couplée à une digestion enzymatique
passer à travers les mailles du gel
28
 5 Immunoélectrophorèse

On introduit le sérum à analyser dans le puits

pratiqué dans la gélose

Électrophorèse :
migration des protéines sériques selon leur charge
et leur poids moléculaire

Introduction de l'antisérum dans une gouttière

creusée dans la gélose

Diffusion des anticorps et des antigènes et formation

d'arcs de précipitation

29
 PCR-RFLP: Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism
6
ou ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

Extraction d’ADN Amplification: PCR

ADN chromosomique Plasmides

Matrice vivante (cellule)

Ou
Matrice environnementale

Limiter le fragment à étudier par des amorces spécifiques

Obtenir une quantité importante d’ADN

Visualisation sous UV Séparation des fragments

des ADN après d’ADN selon leurs tailles Digestion par des enzymes
coloration par électrophorèse de restriction

30
 Site de restriction et température optimale de certaines enzymes
Température
Enzyme Source Site de digestion optimale
(°C)
5’…AG▼CT…3’ ou
AluI Arthrobacter luteus 3’…TC▲GA…5’ 37

5’…C▼CGG…3’ ou
MspI Moraxella species 3’…GGC▲C…5’ 37

5’…GCG▼C…3’ ou
HhaI Hemophilus haemolyticus 3’…C▲GCG…5’ 37

5’…T▼CGA…3’ ou
TaqI Thermus aquaticus 3’…AGC▲T…5’ 65

Rhodopseudomonas 5’…GT▼AC…3’ ou
RsaI sphaeroides 3’…CA▲TG…5’ 37

Haemophilus aegyptius 5’…GG▼CC…3’ ou

HaeIII
3’…CC▲GG…5’ 37

31
 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M M 1 2 3 4 5 6 7 8

M: marqueur de taille
1-8: Echantillons à étudier

Analyse
1 2 3
Comparaison des profils
électrophorétiques avec des Classification des génotypes par la Southern blot
profils de référence réalisés construction des dendrogrammes
théoriquement moyennant
des programmes (DNAman)
AluI HaeIII HhaI MspI RsaI TaqI

32
Streptomyces clavifer
 7 Southern blot
Dénaturation d’ADN par NaOH
Migration d’ADN digéré

Enlever les sondes non

liées (en excès)

Transfert des fragments

sur filtre de nitrocellulose
Hybridation des fragments
d’ADN avec des sondes
marquées

Exposition des fragments à des

radiations électromagnétiques

8 Nouthern blot ARN

9 Western blot 33
Protéines
 10 T-RFLP Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

Thermocycleur

Détecteur de fluorescence Séquenceur

34
 11 DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
TGGE: Temperature Gradient Gel Electrophoresis

Profils électrophorétiques obtenus par DGGE Séparation des fragments d’ADN de même taille

35
 Acrylamide / bisacrylamide

très dangereux

Effets génotoxiques et cancérogènes

Voie respiratoire
Voie digestive
Voie cutanée

Ne jamais rejeter ces deux produits dans l'environnement

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