Electrophorèse

capillaire
Introduction/Généralités
 Introduction/Généralités

• L'électrophorèse:
▪ une technique séparative introduite par une chimiste suédois Arne
Tiselius (Prix Nobel en 1948) pour l'étude de la chimie des protéines
dans les sérum

▪ basée sur la migration, des espèces porteuses d'une charge

électrique globale, présentes dans une solution d'electrolyte, sous
l'action d'un champs électrique
 Introduction/Généralités

L’électrophorèse est très utilisée par les chimistes et les

biochimistes :
▪ Analyse de molécules biologiques de faible masse (AA, peptides) ou
de masse élevée (protéine)

▪ Analyse d'ions ou petites molécules organiques dans le domaine de

l’environnement, du médicament, de l'alimentaire
 Introduction/Généralités

• Classification des différentes techniques de l’électrophorèse

▪ Selon le type de conditions expérimentales
• Electrophorèse de zone (ZE) : pH et champ électrique constants,
séparation selon le rapport charge sur taille des molécules

• Focalisation isoélectrique (IEF) : pH variable et champ électrique

constant, séparation selon le point isoélectrique de la protéine

• Isotachophorèse (ITP) : pH constant et champ éléctrique variable,

séparation selon la mobilité des ions
 Introduction/Généralités

• Classification des différentes techniques de l’électrophorèse

▪ Selon le type de support
• Sur papier : libération des électrolytes sur papier

• Sur gel : utilisé dans le domaine de la biochimie

• Dans un capillaire : le plus utilisé en chimie analytique

Electrophorèse capillaire
(EC)
 Principe de EC

• Technique séparative basée sur la migration,

dans un capillaire, de molécules chargées sous
l'effet d'un champ électrique
 Appareillage

• Capillaire

• Solution électrolytique de séparation

• Un dispositif électrique (électrodes + générateur de

tension)

• Un système de détection et d'acquisition

 Appareillage

EC : migration au sein d’un capillaire de molécules chargées dans un champ

électrique
 Appareillage

Capillaire
▪ Tube fin
▪ Silice vierge ou greffée,
recouverte de polyimide
▪ Longueur totale : 0,20 < L < 1 m
▪ Diamètre interne : 10 µm < di <
100 µm
 Appareillage

Capillaire
▪ Longueur utile (l) de la séparation : entre entrée du capillaire
et fenêtre de detection
▪ longueur totale (L) : de bout à bout des extrémités du
capillaire
 Appareillage

Injection de l’échantillon dans le capillaire

• Injection hydrodynamique
▪ application d’une surpression à l’entrée ou d’une dépression
à la sortie
• Injection électrocinétique
▪ application d’une tension aux extrémités du capillaire
 Appareillage

L'électrolyte de séparation
▪ le plus souvent une solution aqueuse (tampon)

▪ Conductrice

▪ Permettant de fixer le pH
• Contrôle de l'état d'ionisation des molécules ionisables (acides
faibles et bases faibles)

• Contrôle des phénomènes de migration

 Appareillage

L'électrolyte de séparation
▪ Solution tampon : acide faible + base conjuguée

▪ Exemple :
• Tampon phosphate (pKa : 2,1)

• Tampon acétate (pKa = 4,8)

• Tampon borate (pKa = 9,1)

 Appareillage

Dispositif d'application de la haute tension

▪ Electrodes de platine
▪ Générateur de tension : 5kV < U < 30kV (tension continue)
==> Champ électrique intense E (V.cm-1) : E=U/L, L étant la longueur
totale du capillaire
 Appareillage
Système de détection
• Détection « On colonne » :
▪ Détection directement sur le capillaire, à proximité d’une des extrémités
▪ Une partie de la surface du capillaire est brûlée afin de créer une fenêtre de
détection
▪ Spectrophotomètre UV-Visible (le plus utilisé), spectrofluorimètre, Détecteur
électrochimique (conductimétrie ou ampérométrie)

• Détection « off colonne »

▪ Nécessite de concevoir une interface adaptée
▪ Cas de EC couplée à un spectromètre de masse
 Mécanisme de séparation en EC

• Deux phénomènes sont à l'origine du déplacement des solutés

dans le capillaire :
▪ Electromigration

▪ Electro-osmose
 Mécanisme de séparation en EC
Migration électrophorétique
• Toute molécule porteuse d'une charge électrique placée dans
un champs électrique E se déplace vers l'électrode de signe
opposé

Anode Cathode

Vep : Vitesse électrophorétique (cm.s-1)

 Mécanisme de séparation en EC
Migration électrophorétique
Vep = µep x E
E : champ électrique (V.cm-1)
μep: mobilité électrophorétique (cm².V-1.s-1)
𝒒
μep = ; q : charge de l’ion, r : rayon de l’ion solvaté, η : viscosité de la
6πηr
solution
▪ μep est propre à chaque ion
▪ μep est fonction du rapport charge/rayon hydrodynamique solvaté
▪ Si cations : μep> 0, migration vers la cathode (-)
▪ Si anions : μep< 0, migration vers l’anode (+)
▪ Si molécules neutres, μepi = 0, pas de migration
 Mécanisme de séparation en EC

Ecoulement ou flux électroosmotique

• Le flux électroosmotique est un phénomène particulier au
capillaire de silice, correspondant à l’écoulement d’un liquide
remplissant un capillaire (dont la paroi interne possède une
charge de surface) lorsque celui-ci est soumis à un champ
électrique
• Dans le cas d’un capillaire en silice fondue, les charges de
surface sont dues à l’ionisation négative des groupements
silanols dès que le pH est supérieur à 2.
 Mécanisme de séparation en EC

Ecoulement ou flux électroosmotique

• Lorsque le capillaire est rempli d’un tampon électrophorétique,
les cations du tampon sont attirés vers les charges négatives
de la surface du capillaire, formant ainsi une double couche
électrique, caractérisée par un potentiel de surface ou potentiel
zéta (ζ)
δσ
ζ= avec δ = épaisseur de la double couche, σ = densité de
ε
charges par unité de surface, ε = constante dilectrique du milieu
 Mécanisme de séparation en EC

Ecoulement ou flux électroosmotique

• Lors de l’établissement d’un champ électrique à cette interface, les
cations de charge opposée à celles de la surface du capillaire de
silice fondue et présents en excès dans la couche de diffusion
migrent vers la cathode et entraînent avec eux les molécules de
solvant, créant ainsi un écoulement de toutes les espèces
présentes au sein du capillaire, nommé électroosmose.
 Mécanisme de séparation en EC

Ecoulement ou flux électroosmotique

• La solution se déplace à une vitesse appelée vitesse du flux
électroosmotique Veof , Veof = E x µeof
▪ µeof est la mobilité du flux électroosmotique
εζ
▪ µeof = avec ε: constante diéletrique de la solution, ζ : potentiel zeta,
η
η : viscosité de la solution
 Mécanisme de séparation en EC

Ecoulement ou flux électroosmotique

• L’écoulement électroosmotique dépend des caractéristiques
du potentiel zéta, de la viscosité et de la constante diélectrique
du tampon électrophorétique.
• Il s’exercera dans le sens du champ électrique ou dans le sens
opposé selon le signe de la charge surfacique du capillaire.
 Mécanisme de séparation en EC
Ecoulement ou flux electroosmotique

Migration des cations majoritaires dans la couche diffuse → Déplacement de la

solution vers la cathode → Flux électroosmotique
 Mécanisme de séparation en EC

Ecoulement ou flux électroosmotique

• Ecoulement global de la solution d’électrolytes de l’un des
électrodes vers l’autre (en général de l’anode vers la cathode)

• Phénomène non sélectif auquel vont être soumises toutes les

espèces présentes en solution
▪ ==> déplacement de toutes les espèces vers la cathode (cations,
anions et molécules neutres)
 Mécanisme de séparation en EC

Flux électroosmotique (EOF) cathodique et anodique

EOF cathodique EOF anodique

• Surface chargée négativement • Surface chargée positivement (silanols

(silanols déprotonés) déprotonés + adsorption d’hémi-micelles
• double-couche formée de cations d’ammonium quaternaire à longue chaîne)
• Migration vers la cathode • double-couche formée d’anions
• Migration vers l’anode
 Mécanisme de séparation en EC

Electroosmose + électromigration = séparation

• Le mouvement des solutés dans le capillaire résulte de la somme
du flux électrophorétique et du flux électroomostique
• La vitesse de migration VM d’une espèce est définie par la relation
: VM = µapp x E avec µapp = µep + µeof
• La mobilité apparente µapp est la mobilité mesurée et indique si
l’espèce ionique se comporte dans les conditions
électrophorétiques choisies comme un cation ou un anion
L.l
▪ µapp = (L : longueur totale du capillaire, l : longueur utile, t : temps de
t.V
migration de l’espèce, V : tension appliquée
 Mécanisme de séparation en EC
Electroosmose + électromigration = séparation

Seuls les ions sont séparés entre eux selon leur rapport charge/taille, contrairement aux
molécules neutres qui migrent toutes en même temps donc ne sont pas séparées
Mécanisme de séparation en EC

Electrophérogramme
 Paramètres d’optimisation en EC

• Le pH du tampon est le paramètre le plus important puisqu’il détermine

l’état d’ionisation des espèces analysées ainsi que l’amplitude du flux
électroosmotique.
• La force ionique influe aussi de façon importante sur le flux
électroosmotique ainsi que sur la mobilité électrophorétique des ions
analysés.
• Possibilité d’utiliser une phase hydroorganique pour améliorer la
solubilité des analytes, moduler la sélectivité et améliorer la forme des pics
électrophorétiques.
• Enfin, la tension appliquée et la température représentent des
paramètres secondaires dans l’optimisation d’une séparation.
 Avantages de l’EC

• Domaines d’application très étendus (ions organiques, inorganiques,

protéines, virus etc.)
• Orthogonalité / chromatographie (technique complémentaire à la
chromatographie
• Quantitativité
• automatisation, rapidité
• Technique miniaturisée
• Absence de phase stationnaire (moins de risques d’adsorption
irréversibles, mise en équilibre rapide des capillaires…)
• coûts de fonctionnement modérés
 Inconvénients de EC
• Liés à la miniaturisation
▪ Perte rapide d’efficacité en dehors des conditions idéales (échauffement par
effet Joule, adsorption aux parois)
▪ Capacité préparative limitée (volume injecté : quelques nL)
▪ Diminution de la sensibilité des détections spectrophotométriques
 Applications de EC

• Détermination de pureté
• Confirmation d’identité (qualitative)
• Validation croisée des méthodes (orthogonalité à la
chromatographie)
• Rapidité : suivis cinétiques (réaction chimique, enzymatique, test de
dissolution…)
• Détermination de contre-ions, bilan ioniques
• Analyse de traces
• Matrices difficiles, échantillons complexes :
▪ Faibles risques de bouchage (absence de phases stationnaires)
▪ Simplification des procédés de prétraitement des échantillons
• Détermination de constantes (kéq, kcomplexation, CMC, logP…)
Applications de EC
Molécules analysées
 Applications EC
Secteurs d’application
• Très utilisée
▪ en génomique et protéomique:
peptides, protéines, acides
nucléiques
▪ en pharmacie : molécules polaires
et chirales, anticorps monoclonaux
• mais aussi en
▪ environnement
▪ agro-alimentaire
▪ énergie
▪ police scientifique

(LC-GC, The Column, 2011)