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La Cintique Enzymatique

Les ractions chimiques dans les cellules sont faites par des enzymes. Les mesures cintiques sont parmi les outils les plus puissants pour lucider les mcanismes enzymatiques. C'est donc un des aspects les plus importants de l'enzymologie; ces mesures nous informent sur la spcificit de la raction enzymatique et sur les caractristiques physiques de l'enzyme. En pratique, ces mesures sont essentielles en biochimie clinique, puisqu'elles permettent de dtecter des anomalies pathologiques. L'tude de la cintique enzymatique a commenc en 1902 quand Adrian Brown a examin la vitesse d'hydrolyse de saccharose par l'enzyme invertase saccharose + H2O glucose + fructose Brown a dmontr que lorsque la concentration de saccharose S dpasse celle de l'enzyme, la vitesse de la raction devient indpendante de la concentration de saccharose ou ordre zro par rapport au saccharose.
Vitesse maximale

[S] Il a donc propos que la raction globale est compose de deux ractions lmentaires : le substrat forme d'abord un complexe avec l'enzyme, puis ce complexe se dcompose en produit et enzyme. Soit

k1 E+S k-1 ES

k2 E+P

o E, S, ES, et P symbolisent l'enzyme, substrat, le complexe enzyme-substrat et le produit, respectivement Selon ce modle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment importante afin de capter toute lenzyme sous forme ES, la deuxime tape de la raction est limitante et la raction globale devient insensible aux augmentations supplmentaires en concentration de substrat.

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Les principes gnraux des ractions chimiques s'appliquent aux ractions enzymatiques. Dans une raction chimique, le taux de catalyse (v) est dfini par le changement dans la concentration du produit final par unit de temps. Le taux de catalyse est proportionnel la concentration du substrat.
v= d [ S ] d [ P] = = k[ S ] dt dt

Dans une raction enzymatique, le taux de catalyse (v) est aussi la variation dans la concentration du produit final par unit de temps. La vitesse globale de la raction est dfinie de faon similaire par v=
d [P ] = k2 [ES] dt

La vitesse de production de ES est la diffrence entre les vitesses des ractions lmentaires dcrivant la formation de ES et sa disparition
d [ES ] = k1 [E][S] - k-1[ES] - k2 [ES] dt

Cette quation diffrentielle ne peut pas tre intgre de faon explicite pour tous les cas sans des approximations simplifies: 1. quilibre rapide En 1913, Lonure Michaelis et Maud Menten ont fait lapproximation que k-1 >> k2 pour que la premire tape de la raction soit toujours en quilibre rapide. Donc, KS = k-1 / k1 = [E][S] / [ES] qui est la constante de dissociation du substrat de l'enzyme. Le complexe non-covalent ES entre enzyme et substrat est connu par le nom de complexe Michaelis. 2. tat stationnaire La concentration dES est relativement constante pendant la majorit de la raction, si [S] >> [E]. (Voir courbes dvolution des composs et noter les rgimes stationnaire et transitoire) Ceci implique que la vitesse de formation de ES doit tre gale sa disparition. Par consquent, d[ES]/dt = 0. Dsignation connue sous forme d'approximation de l'tat stationnaire propos d'abord par Briggs et Haldane en 1925. L'approximation de l'tat stationnaire en assumant que la raction est l'tat stable, c'est--dire que [ES] est stable est moins restrictive que celle de Michaelis-Menten et sera utilise dans le dveloppement de la relation entre [S] et v.
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Les concentrations de [E] et [ES] ne sont pas de faon gnrale mesurable. Mais la concentration totale de l'enzyme [E]T = [E] + [ES] peut tre facilement dtermine. Vu que la vitesse v = k2 [ES] comment peut-on dfinir [ES] ? Selon la prmisse que [ES] est stable durant la raction, la formation de [ES] est gale sa dcomposition. Donc, k1 [E][S] = k2 [ES] + k-1 [ES] et

[ES ] =

[E ][S ] [E ][S ] = ( k -1 + k 2 ) / k 1 KM

o KM = (k-1+ k2)/k1 reprsente la constante de Michaelis-Menten. Comment peut-on dfinir les valeurs de [E] et [S] ? Pour les conditions stationnaires, il faut que la concentration du substrat soit beaucoup plus grande que celle de l'enzyme. Donc la portion de substrat associe au complexe ES est ngligeable. Par consquent, [S] est trs prs de [S] totale. Par contre, [E] = [E]T - [ES] En remplaant [E] dans l'quation prcdente, nous obtenons une quation dans laquelle toutes les valeurs sont mesurables. [S ] [ ES ] = ([E ] T - [ES ]) KM [E ] T [S ] [ ] = ES d'o: K M + [S ] Nous pouvons remplacer la valeur de [ES] dans l'quation originale v = k2 [ES] pour obtenir :

v=

k 2 [E ] T [S ] K M + [S ]

Le taux de catalyse maximal definit par Vmax = k2 [E]T (M.s-1) car, le taux de catalyse maximal est obtenu lorsque tous les sites de liaison sont saturs, c'est--dire lorsque la concentration du substrat est plus grande que le KM. Dans ces conditions, le ratio [S]/([S] + KM) tend vers 1. Le ratio [S]/([S] + KM) reprsente la fraction des enzymes occups par un substrat puisque

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f ES =

[ES ] [S ] v [S ] v = = = f ES et [E ] T K M + [ S ] k 2 [E ] T K M + [S ] V MAX

Le taux de catalyse est donc :

[S] v = V MAX K M + [S]

Cette quation est connue sous le nom de l'quation de Michaelis-Menten Le taux de catalyse est donc proportionnel : au taux de catalyse maximal, VMAX, et la fraction des enzymes qui sont occups par un substrat, fES. Implicite dans le modle michaelienne est que la formation du produit P partir du complexe ES soit irrversible, qui nest pas raliste. Afin dassurer que la vitesse de retour, E + P en ES, soit ngligeable exprimentalement, elle doit tre mesur avant quil y ait une accumulation importante en concentration de P. La vitesse initiale de la raction dans le rgime dtat stationnaire (pas transitoire) satisfait la condition dirrversibilit et elle est dfinie par la mesure de v t = 0. d [P ] )t = 0 , reprsente la vitesse initiale et qui sexprime en Donc, v0 = ( dt fonction des quantits exprimentalement mesurable [E]T et [S]. L'utilisation de la vitesse initiale, mesure dans l'intervalle correspondant au moins que 10% consommation de substrat, minimise non seulement des facteurs potentiels de complications comme la raction rversible, mais galement linhibition de l'enzyme par produit et linactivation progressive de l'enzyme. Signification de la constante de Michaelis L'quation de Michaelis-Menten est l'quation de base des cintiques enzymatiques est connue mathmatiquement comme une courbe hyperbolique. Selon l'quation, lorsque [S] est gale KM, v = Vmax/2. C'est donc dire que KM est gal la concentration du substrat laquelle le taux de catalyse est la moiti du taux maximal. La valeur du KM varie avec les enzymes, la nature du substrat, le tissu o l'enzyme a t isol, le pH, la temprature, etc.

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Vitesse initiale en fonction de [S]

Variation de la vitesse initiale, v0 , en fonction de la concentration en substrat pour une raction Michaelis-Menten simple. Les points sont disposs des intervalles de 0.5KM pour des concentrations en substrat comprises entre 0.5 - 5KM.

La constante de Michaelis peut tre exprime comme

KM =

k -1 k 2 k + = KS + 2 k1 k1 k1

Le KM peut tre gal la constante de dissociation KS, si et seulement si la dissociation du complexe ES en E et S est beaucoup plus rapide que la formation de E et P. Dans ces conditions, k-1 >> k2 et KM KS. Ceci permet de mesurer l'affinit de l'enzyme pour le substrat; un KM lev signifie une faible association alors qu'un KM faible indique une forte association. Les valeurs KM sont souvent proches des concentrations physiologiques de leur substrat. Le taux de catalyse tant extrmement sensible la concentration du substrat prs du KM, une variation mineure dans la concentration du substrat peut changer toute une voie mtabolique. Analyse des donnes cintiques. haute concentration de S, v0 VMAX mais mme [S] = 10KM, v0 = 0.91VMAX. Donc aujourdhui des analyses non linaires sont utilises pour obtenir des estimations exprimentales de VMAX et KM. Traditionnellement les estimes des valeurs cintiques, Vmax et KM ont t obtenues partir dune mthode propose par Lineweaver et Burk et connue sous ce
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nom. Une courbe de v en fonction de [S] permet de dfinir les valeurs de KM et Vmax, directement en utilisant l'quation rciproque et tracer une courbe 1/v en fonction de 1/[S]. Une ligne droite sera obtenue.

1 1 KM = + v V MAX V MAX [S ]
partir de cette courbe, comme indiqu, nous pouvons directement calculer les valeurs de Vmax sur laxe et de KM partir de la pente de la courbe. Reprsentation en doubles rciproques (Lineweaver-Burk) 1 / v0
Pente = KM / VMAX

1 / VMAX [S] = 5 Km - 1/Km

[S] = 0.5 Km

1 / [S]

Les points sont obtenus partir des donnes de la figure prcdente. Notez leffet important de petites erreurs pour [S] faibles (1/[S] leves) et le rapprochement des points pour [S] leves. Barres derreurs de 0.05 VMAX

Mesure de la constante catalytique et de l'efficacit enzymatique. a) Les paramtres cintiques d'un enzyme permettent de mesurer son efficacit catalytique. Nous pouvons d'abord dfinir la constante VMAX catalytique (kcat, ou le turnover number) comme tant le k cat = [ E ] T nombre de molcules de substrat converties en produit par unit de temps par chaque site actif, quand l'enzyme est satur. La valeur de kcat (s-1) = k2, dans les ractions possdant un mcanisme de type Michaelis-Menten. La valeur inverse 1/kcat reprsente le temps requis pour convertir 1 molcule de substrat en produit. b) L'efficacit enzymatique peut tre calcule lorsque l'enzyme est non-satur, [S] << KM c'est--dire quand beaucoup de sites sont libres. Dans les conditions physiologiques, il est trs rare qu'un enzyme soit satur, puisque la concentration du substrat est gnralement infrieure au KM de l'enzyme. Dans les conditions o la
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concentration d'enzyme libre est peu prs gale la concentration d'enzyme total, [E] [E]T, on a

k cat k [S ][E ] T cat [S ][E ] KM KM

Le taux de catalyse dpend donc de la valeur de kcat/KM(M-1s-1), qui reprsente une pseudo constante bimolculaire et il mesure l'efficacit catalytique de l'enzyme ou sa spcificit. Est-ce qu'il y a une limite l'efficacit catalytique ? De l'quation ci-haut on a :

k cat k kk = 2 = 1 2 K M K M k -1 + k 2
Cette quantit est maximale si k2 >> k-1, a veut dire que la formation des produits obtenus partir dES est trs vite par rapport la dcomposition de ES en substrat et enzyme et on obtient kcat / KM k1. Cette constante de deuxime ordre k1 ne peut pas dpasser la frquence avec laquelle le substrat combine avec l'enzyme. La limite de la valeur k1 est la vitesse de diffusion avec laquelle le substrat rencontre lenzyme. Certains enzymes ont atteint une efficacit catalytique tellement grande quelles ne sont que limites par le coefficient de diffusion des molcules (108 109 M-1s-1). Le tableau sur la prochaine page montre les valeurs de KM, kcat, et kcat/KM pour plusieurs enzymes et substrats. savoir, la catalase, lactylcholinestrase, la fumarase, et possiblement lanhydrase carbonique remplissent cette condition et ont donc pratiquement atteint la perfection catalytique. C'est donc dire que l'enzyme combine avec le substrat aussitt qu'il le rencontre. Vu que le site actif de l'enzyme est une surface restreinte comment le substrat est-il guid au site actif reste une question laquelle la rponse n'est pas encore claire.

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Enzyme Actylcholinestrase

Substrat Actylcholine CO2

KM (M) 9.5x10-5 1.2x10-2 2.6x10-2 2.5x10-2 4.4x10-1 8.8x10-2 6.6x10-4 5.0x10-6 2.5x10-5 2.5x10-2

kcat (s-1) 1.4x104 1.0x106 4.0x105 1.0x107 5.1x10-2 1.7x10-1 1.9x102 8.0x102 9.0x102 1.0x104

kcat/KM (M-1 s-1) 1.5x108 8.3x107 1.5x107 4.0x108 1.2x10-1 1.9 2.9x105 1.6x108 3.6x107 4.0x105

Anhydrase carbonique HCO3Catalase H2O2 Ester thylique de N-Actylglycine Chymotrypsine Ester thylique de N-Actylvaline Ester thylique de N-Actyltyrosine Fumarate Fumarase Malate Urase Ure

noter en cas des substrats pour chymotrypsine, lenzyme dmontre la meilleure efficacit envers le substrat de lester thylique de N-actyltyrosine.

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