Ecologie Moléculaire

& Génétique Evolutive

Travaux Pratiques
Plan des enseignements
TP.1. Introduction à l’extraction de l’ADN
TP.2. Extraction, purification et Mesure de la concentration de l’ADN génomique végétal
TP.3. Extraction, Purification et Mesure de la concentration des ARN totaux
TP.4. Extraction de l’ADN Plasmidique
TP.5. Transformation de bactéries par un plasmide
 Préparation des solutions tampons et extraction des plasmides
 Génération des bactéries compétentes et Transformation des bactéries
TP.6. Electrophorèse de l’ADN plasmidique sur gel d’agarose
 Rappel sur le principe d’électrophorèse et Préparation des solutions tampons
 Préparation de l’échantillon (extraction l’ADN Plasmidique)
 Lancement de l’Electrophorèse sur gel d’agarose
TP.7. Electrophorèse des protéines en conditions dénaturantes SDS-PAG
 Préparation des solutions tampons
 Préparation de l’échantillon (extraction des protéines)
 Lancement de l’Electrophorèse des protéines en conditions dénaturantes sur SDS-PAG
TP.6. Electrophorèse des protéines en
conditions dénaturantes SDS-PAG
 ÉLECTROPHORÈSE

On appelle électrophorèse, la migration de particules chargées en solution

sous l’action d’un champ électrique,

L’ électrophorèse est une technique séparative. Elle est utilisée le plus

souvent dans un but analytique mais également pour purifier des molécules
biologiques solubles. Elle n’est donc pas adaptée à la séparation des lipides

Origine de la charge électrique

la charge électrique provient de l’ionisation d’une fonction chimique

(libération ou capture d’un proton).
Les protéines sont des ampholytes, c’est-à-dire qu’elles peuvent
porter simultanément des charges positives et négatives.

Le pH des solutions joue un rôle très important dans l’acquisition des charges
électriques. Ainsi, dans le cas des protéines, le pH auquel la charge électrique
globale est nulle est appelé point isoélectrique (PI)

• Une protéine en solution portée à un pH inférieur à son PI, se comporte comme

une base et capte des protons H+. Elle devient chargée positivement.
• Une protéine mise à un pH supérieur à son PI, se comporte comme un acide et
cède des protons H+. Elle sera chargée négativement.
Déplacement électro-phorétique
Sous l'action d'un champs électrique, E, une protéine se déplace avec une
vitesse, v, proportionnelle au champs:

v = µ E, avec µ appelée 'mobilité électrophorétique‘ µ = v / E (1)

avec : µ en cm2.s-1.volt-1,
v en cm.s-1
E en volt.cm-1

Le champs électrique (E) crée entre 2 électrodes, exerce une force, F, sur une
protéine que l'on suppose sphérique et de charge q; F=qE
E
F

Protéine
 Les forces de frottement, F', dues à la viscosité (ᶯ : eta) vont s'opposer à la
migration de la protéine et la freiner;
E

F’ F

Protéine
F’ = 6 π η v r Avec v : vitesse de la protéine;
r: rayon de la protéine et
ᶯ : coefficient de viscosité
Lorsque les deux forces s’équilibrent (déplacement avec une vitesse constante)
F=F’ soit : qE=6πηvr V = q E / 6 π η r (2)
(2) Dans (1) µ=q/6πηr

Donc, la mobilité d'une particule migrant dans un champs uniforme dépend

de 3 facteurs : (q), (η) et ®.

- Elle est proportionnelle à sa charge (q).

- Elle est inversement proportionnelle au coefficient de viscosité du milieu (η),
- Elle est inversement proportionnelle à son rayon (r).

- cette équation indique que les protéines à leur point isoélectrique (où q=0)
possèdent une mobilité électrophorétique nulle
Principe
Étape 1 : Préparation de l’échantillon
Étape 2 : Préparation du gel d’électrophorèse
+

SO4-
Étape 3 : Séparation des protéines en conditions dénaturantes