ChapIII Bioch 2020

Chapitre III : Appareils et méthodes utilisés au laboratoire de Biochimie
Chapitre III
Appareils et méthodes
utilisés au laboratoire de Biochimie
Le laboratoire de biochimie joue un rôle particulièrement important dans le domaine des

analyses biomédicales. Cette importance lui a permis de bénéficier, ces dernières décennies,
d’appareils et d’équipements de plus en plus automatisés, informatisés et performants.
Comme nous l’avons défini au chapitre I, la mission du laboratoire de biochimie est
d’effectuer des analyses et dosages, principalement sur le sérum, le liquide céphalorachidien
(LCR) et les urines. L’activité analytique a pour but de mettre en évidence des substances
(molécules ou agrégats) ou de mesurer la concentration de certains composants (atomes, ions ou
molécules) dans les échantillons analysés. Pour effectuer ces analyses, il faut procéder à la
séparation de la substance, à sa mise en réaction et enfin à effectuer la mesure (ces différentes
étapes ont été déjà décrites au chapitre I). Dans ce chapitre, nous allons tout d’abord donner
quelques notions utiles de biochimie, puis nous allons traiter quelques appareils et méthodes de
séparation et présenter la procédure d’analyse automatique en biochimie (la majorité des méthodes
de mesure utilisées, ont été déjà présentées au chapitre II).
I- Notions utiles en biochimie
I- 1- Les glucides
Les glucides, sous forme de sucre et d’amidon, représentent la principale partie de l’apport
calorique chez l’homme, ainsi que chez les animaux et de nombreux microorganismes.
Les glucides (appelés aussi hydrates de carbone) sont des composés polyhydroxylés ayant
une fonction aldéhyde ou cétone. On distingue donc :
• les aldoses, formule générale : CHO-(CHOH) n-CH2OH (fonction aldéhyde) ;
• les cétoses, formule générale : CH2OH-CO-(CHOH) n-CH2OH (fonction cétone).
I- 1- 1- Classification
Deux classifications principales sont affectées aux glucides. Nous distinguons les oses et
les osides.
a) Les oses : leur formule brute est (CH2O)n. Ils possèdent n-1 fonctions alcool et une fonction
carboxylique. Leur nomenclature est définie selon le nombre de carbones et la fonction
carboxylique :
• nombre de carbones : on distingue les trioses (trois carbones) ; les tétroses (quatre
carbones) ; les pentoses (cinq carbones) ; les hexoses (six carbones) ;
• fonction carboxylique : * cas d’une fonction aldéhyde (au carbone n° 1), les aldoses ;
exemple : aldotriose (O=CH-CHOH-CHOH) ; aldohexose ou
glucose (O=CH-(CHOH)4-CH2OH) ;
* cas d’une fonction cétone (au carbone n°2), les cétoses ;
exemple : cetotriose (CH2OH-CO-CH2OH) ; cétohexose ou
fructose (CH2OH-CO-(CHOH)3-CH2OH).
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b) Les osides : c’est l’association de plusieurs molécules d’oses avec éventuellement des
substances non glucidiques.
On peut aussi classer les sucres en :

• monosaccharides : qui sont des sucres simples tel que le glucose ;
• polysaccharides qui sont des sucres complexes (formés de longues chaînes possédant
plusieurs unités monosaccharidiques. Exemple : la cellulose, le glycogène, … . Lorsque les
chaînes de sucre sont courtes, il s’agit d’oligosaccharides. Exemple, le saccharose
(1glucose + 1 fructose), le lactose (1 glucose + 1 galactose) … .
I- 1- 2- Propriétés physico-chimiques des glucides
Les glucides sont des composés solubles dans l’eau (présence de la fonction alcool). Ils
peuvent être oxydés ou réduits pour donner d’autres composés. Par exemple : le glucose peut être
oxydé pour donner l’acide gluconique, ou réduit pour donner le sorbitol ou le manitol (alcools
présents dans les fruits). Le glucose peut aussi être fermenté en acide lactique. (acide cumulé dans
les muscles à la suite des efforts intenses).
I- 1- 3- Métabolisme des glucides
a) Dégradation : La dégradation des glucides est nécessaire pour la production de l’énergie. Cette
opération est dite glycolyse. Elle met en jeu un ensemble de réactions assurant la conversion du
glucose en acide pyruvique (ou pyruvate). Ces réactions sont catalysées par des enzymes et des
coenzymes. L’énergie produite est sous forme de molécules d’ATP (adénosine triphosphate). Dans
l’organisme, les réactions de dégradation du glucose se font à l’intérieur de la cellule. Elles
débutent en anérobie (absence d’air) dans le cytoplasme et se poursuivent à l’intérieur de la
mitochondrie ou elles suivent un cycle dit « cycle de Krebs », au cours duquel le pyruvate est
dégradé. La dégradation d’une molécule de glucose produit 36 molécules d’ATP.
b) Synthèse : Pour synthétiser les glucides, l’homme, les animaux et les plantes utilisent soit les
lipides, soit les acides aminés, où l’acide pyruvique (voie inverse de la glycolyse). Cette synthèse
est appelée la gluconéogenèse. Exemple : les graines oléagineuses (arachides, soja, …)
synthétisent les glucides à partir des lipides de réserve. Chez l’homme, les hépatocytes (cellules du
foie) synthétisent le glucose à partir d’acides aminés. Après formation du glucose, des enzymes
tels que la glycogène synthétase et l’amidon synthétase interviennent dans la synthèse du
glycogène et l’amidon qui sont stockés sous forme de réserves.
I- 2- Les lipides
Les lipides sont des substances insolubles dans l’eau et solubles dans les solvants
organiques (benzène, chloroforme, …). Ils peuvent avoir des fonctions diverses : ils présentent des
réserves en énergie ; ils interviennent dans la structure de la membrane cellulaire ; etc … .
I- 2- 1- Classification des lipides
Il existe deux classes de lipides : les lipides simples et les lipides complexes :
a) Les lipides simples : Les lipides simples sont constitués de glycérides ou graisses neutres. Ces
dernières sont composées d’acides gras (AG) de formule : R-C 00H (R : CH3-CH2-CH2-
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…….CH2-) et de glycérol qui est un alcool de formule : CH2OH-CHOH-CH2OH. Lorsqu’il y’a un

seul AG lié au glycérol, le glycéride formé est dit « mono glycéride », de formule :
R-COO-CH2-CHOH-CH2OH.
Si deux AG sont liés au glycérol, le glycéride formé est dit « diglycéride », de formule :
R-COO-CH2-CHOH-CH2OO-R’.
Si trois AG sont liés au glycérol, le glycéride formé est dit « triglycéride ».
Les glycérides représentent des réserves énergétiques. Ils sont stockés sous forme de
gouttelettes graisseuses dans le tissu adipeux.
On définit aussi les stérides qui sont également des lipides simples, formés d’AG et de
stérol dont nous distinguons par exemple le cholestérol, qui est un alcool cyclique complexe.
Exemple de stérides : palmitate de cholestérol, de formule : CH3-(CH2)14-COO- A. A est un
composé cyclique.
b) Les lipides complexes : leur rôle principal est la structure (constitution de la membrane
cellulaire). Parmi ces lipides, nous distinguons les phospholipides (présence d’acide
phosphorique : H3PO4 ) tels que l’acide phosphatidique, les lécithines (dans le foie, dans le
cerveau, …), etc ... .
I- 2- 2- Métabolisme des lipides
Les triglycérides représentent la majeure partie des graisses alimentaires. Leur dégradation
est l’un des processus importants de la digestion. Cette dégradation a lieu au niveau de l’intestin
grêle, elle fait intervenir un ensemble d’enzymes dites « les lipases ». Au cours de la dégradation,
il y’a libération d’acides gras et de glycérol. Les acides gras libres à courte chaîne et le glycérol
sont absorbés par la muqueuse intestinale puis sont transportés dans le foie. Les acides gras à
longue chaîne et les mono et diglycérides sont utilisés au niveau des cellules de la muqueuse
intestinale pour la synthèse des triglycérides. Ces triglycérides néoformés regagnent le foie et le
tissu adipeux par la circulation générale sous la forme de particules dites chylomicrons.
Au niveau du tissu musculaire, une dégradation des lipides à des fins énergétiques est
effectuée. En effet, l’oxydation des acides gras au niveau des mitochondries produit des molécules
d’ATP (source d’énergie). Exemple : la dégradation complète d’un acide gras tel que l’acide
palmitique (CH3-(CH2)14-COOH) donne 129 molécules d’ATP.
Le métabolisme des liquides complexes fait intervenir des enzymes dites phospholipases
présentes dans pratiquement tous les tissus des animaux, ainsi que dans les hématies, les
leucocytes et les plaquettes sanguines.
I- 2- 3- Dosages biochimiques relatifs aux lipides
Le cholestérol est un alcool cyclique qui peut être estérifié à des acides gras et entre dans la
structure des lipoprotéines transporteuses de lipides dans la circulation.
Le dosage du cholestérol sanguin représente un bon indicateur pour l’exploration des
fonctions hépatiques et cardio-vasculaires. Un taux élevé en cholestérol impose une réduction de
la consommation de la matière grasse, plus particulièrement d’origine animale, afin d’éviter les
accidents cardio-vasculaires.
Le dosage de l’enzyme phospholipase A est aussi un bon indicateur pour l’exploration des
fonctions pancréatiques. Au cours des pancréatites aiguës, un taux élevé de cette enzyme est
observé.
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I- 3- Les protéines
I- 3- 1- Structure des acides aminés et des protéines
Les protéines sont des substances organiques alimentaires, composées d’un assemblage
linéaire d’éléments de base qu’on appelle les acides aminés.
Les acides aminés sont caractérisés par la présence de la fonction acide (-COOH) et du
groupement amine (-NH2). Leur formule générale est donnée par : R-CHNH2-COOH. Il existe 20
types d’acides aminés naturels. Exemple : glycine (CH2NH2-COOH) Valine ((CH3)2-CH-CHNH2-
COOH). Il existe aussi des acides aminés qui portent une fonction alcool (-OH), exemple : sérine
(CH2OH-CHNH2-COOH), thréonine (CH3-CHOH-CHNH2-COOH) ; ou qui portent un atome de
soufre, exemple : cystéine (HS- CH2-CHNH2-COOH). D’autres acides aminés sont aromatiques
(présentent un cycle benzène), exemple : phénylalanine. etc., … .
IL existe des protéines formées seulement d’acides aminés, dites holoprotéines ; et des
protéines formées en plus d’un groupement non protéique, exemple : les lipoprotéines
(groupements lipidiques). La structure des protéines peut être tridimensionnelle tels que
l’hémoglobine ou les enzymes.
I- 3- 2- Métabolisme des protéines
Au niveau de la lumière intestinale, les protéines sont dégradées en petits peptides par des
enzymes appelés protéases, telle que la trypsine et la chymotrypsine. Les acides aminés ou les
peptides sont assimilés puis dégradés par une suite de réactions enzymatiques dites désamination
qui libère de l’ammoniac (NH3). L’ammoniac est toxique, il est transformé dans le sang sous
forme de glutamine et de l’urée (O=C(NH2)2) qui provient de la dégradation des acides aminés.
Les acides aminés (ainsi que les lipides) peuvent aussi se transformer en acide pyruvique
puis en glucose pour fournir de l’énergie (en particulier dans le cas d’une hypoglycémie.
I- 4- Les enzymes
Les enzymes sont des composés protéiques qui catalysent toutes les réactions
biochimiques. L’enzyme catalyse une réaction faisant intervenir le substrat qui est transformé en
produit de la réaction.
Les réactions enzymatiques font également intervenir des coenzymes qui sont des
molécules organiques de petites tailles non protéiques réagissant avec le substrat.
La déficience ou l’excès d’enzymes et de coenzymes peuvent provoquer certaines maladies
métaboliques, d’où l’intérêt d’effectuer leur dosage pour le diagnostic.
II- Méthodes électrophorétiques
L’électrophorèse est une technique biochimique de base, indispensable pour l’analyse et la

caractérisation des protéines et des acides nucléiques (ADN). De même, elle permet aussi de
séparer les lipides et les résidus glucidiques des protéines.
Le développement de cette technique a permis de mettre en évidence la grande diversité et
la complexité des protéines. Elle a aussi contribué à la grande évolution, au cours des années 80,
de la génétique moléculaire basée sur l’analyse des acides nucléiques et dont les applications sont
considérables en industrie pharmaceutique, en agroalimentaire, … .
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II- 1- Principe
Comme nous l’avons déjà expliqué au chapitre II, l’électrophorèse est une méthode
physique de fractionnement des molécules ionisées dans un champ électrique continu. Les
molécules chargées négativement vont migrer vers le pôle positif, et celles chargées positivement
vers le pôle négatif. Le déplacement des molécules dépend de plusieurs facteurs :
• Temps de migration : il est relatif à l’état de charge et au poids de la molécule. Pour une
particule donnée, ce temps est limité par divers facteurs (diffusion des substances sur le
support, dégradation du produit, …) ;
• Force ionique du tampon (voir chapitre II) : la force ionique est inversement
proportionnelle à la conductivité. Par conséquent, le déplacement d’une particule
augmente lorsque la force ionique du tampon de migration diminue;
• Température : lors de la réalisation d’une électrophorèse, une élévation de la température
se produit par effet Joule, ce qui provoque une variation de la résistance du support (la
résistance diminue avec la température). Pour maintenir constante cette résistance, il est
donc nécessaire de limiter les variations de la température ;
• Champ électrique : à une charge constante, le déplacement de la particule dépend
seulement de l’intensité du champ électrique appliqué (F = qE). Celle ci est donnée par le
rapport de la différence de potentiel entre les électrodes sur la distance qui les séparent.
Pour assurer une migration homogène à vitesse constante, il est nécessaire de maintenir un
champ constant, d’où une tension continue ;
• Forces de freinage : lors du déroulement de l’électrophorèse, un courant de sens opposé au
courant appliqué est produit au niveau des bords du support solide. Ce phénomène est
désigné par le terme d’électro-endosmose. Ce courant est à l’origine de la migration des
substances non chargées (glucose, urée, …). Il freine ainsi le flux électrophorétique. La
viscosité du milieu est aussi un facteur de freinage sérieux, en particulier pour les
macromolécules.
• pH du tampon : ce facteur joue un rôle particulièrement important dans le cas ou les
substances à séparer par électrophorèse sont amphotères (substances qui peuvent présenter
un caractère acide ou basique selon la nature du solvant). En effet, ces substances
présentent une valeur de pH égale à pHi (pH isoélectrique pour lequel la substance
présente une charge nulle) ; si le pH du tampon est inférieur à pHi, la substance
amphotère s’ionise positivement (gain d’un proton H+) et donc migre vers la cathode. En
revanche, si le pH du tampon est supérieur à pHi, la substance s’ionise négativement
(libère un proton H+) et migre donc vers l’anode. Ses propriétés sont largement exploitées
pour séparer les acides aminés et les protéines.
II- 2- Exemple d’application de l’électrophorèse
L’une des applications médicales les plus répandues de l’électrophorèse est celle qui
correspond à la séparation des protéines du sérum humain. Ces dernières sont principalement
constituées d’une fraction importante d’albumine et de quatre groupes de globulines 1, 2,  et
, de fonctions différentes. Les mesures quantitatives de ces différentes protéines apportent des
informations importantes dans l’exploration des différents organes qui les synthétisent (foie, tissu
lymphoïde). Pour définir les proportions des différentes protéines du sérum, l’électrophorèse doit
être complétée par le dosage quantitatif global de ces différentes protéines.
La procédure de séparation de ces protéines est la suivante : on utilise une électrophorèse
sur papier ou sur esters de cellulose à basse tension (100 à 200V ; voir paragraphe 3).
L’identification des fractions de protéines séparées est obtenue grâce à l’application des colorants.
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Ces derniers se fixent sur les protéines et persistent même après lavage de la bande de papier.
Parmi les colorants les plus appropriés, nous distinguons : noir amidé, rouge Ponceau ou
nigrosine. A la fin de la séparation, l’intensité de la coloration des différentes fractions protéiques
obtenues est analysée à l’aide d’un spectrophotomètre (densitomètre) approprié. Le principe de la
mesure est basé sur le phénomène d’absorption de la lumière par les fractions colorées (voir
chapitre II). La longueur d’onde sélectionnée du spectrophotomètre dépend du colorant choisi. La
figure (IV–1) présente un exemple d’électrophorèse et de protéinogramme obtenus sur un plasma
humain normal après séparation des protéines par électrophorèse.
Figure (IV–1) : Exemple d’appareil d’électrophorèse et de protéinogramme obtenu sur un plasma

humain normal après séparation des protéines par électrophorèse.
II- 3- Différents types d’électrophorèse

Selon la nature et le poids des différentes substances à séparer, il existe plusieurs types
d’électrophorèse dont nous distinguons :
II- 3- 1- Electrophorèse sur papier
Le schéma de ce type d’électrophorèse est donné par la figure (IV–2), le support utilisé
pour la migration des substances chargées est en papier ou en cellulose, imbibés d’une substance
tampon. Cette technique peut être utilisée à deux niveaux de tension donnés :
• à basse tension (100 à 200 V): elle est utilisée pour séparer les protéines.
• à haute tension (1000 à 3000V) : elle est utilisée pour la séparation des petites molécules
(acides aminés, peptides, …). A ces valeurs de tension, un refroidissement efficace est
nécessaire pour absorber l’énergie calorifique dégagée par effet Joule.
Les colorants utilisés pour l’identification des fractions séparées dépendent des substances
analysées. Par exemple pour les protéines, les colorants usuels sont : le noir amidé, le rouge
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Ponceau et la nigrosine ; pour les lipides, on utilise le noir soudan et pour les acides aminés on
utilise la ninhydrine.
Figure (IV-2) : Exemple d’appareillage simple pour électrophorèse su papier
II- 3- 2- Electrophorèse sur esters de cellulose

Cette technique est réservée aux protéines, elle utilise le même principe que
l’électrophorèse sur papier. Le support en esters de cellulose permet des séparations plus rapides
(30 à 120 min), grâce à la possibilité d’application des voltages élevés (30 V/cm). La limitation de
cette technique est dans le volume de l’échantillon qui ne peut dépasser quelques microlitres.
Les colorants utilisés pour l’identification des protéines séparées sont les mêmes que ceux
utilisés dans le cas de l’électrophorèse sur papier.
II- 3- 3- Electrophorèse sur gel d’agarose
Des gels de très grande porosité peuvent être constitués (figure IV-3), en utilisant des
concentrations faibles d’agarose. Cette grande porosité permet la migration des molécules de poids
moléculaire élevé et même des complexes (virus, acides nucléiques, …).
Gel d'agarose avant et

après éclairage sous
ultraviolets
Figure (IV-3) : Electrophorèse sur gel d’agarose (analyse d’ADN)
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II- 3- 4- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

Ce type d’électrophorèse permet de séparer les molécules selon leurs charges ainsi que
leurs poids. En effet, la réticulation du gel peut influencer la migration de la molécule chargée
selon son poids, il est même possible de choisir cette réticulation selon le poids de la molécule à
séparer. Les migrations peuvent être réalisées avec des tampons acides ou basiques. Elles peuvent
être horizontales ou verticales (figure IV-4). Cette technique s’avère beaucoup plus sensible que
les précédentes. Les molécules peuvent être définies à l’aide de différentes méthodes. Par
exemple, par coloration ou les protéines sont identifiées à l’aide de colorants tels que le bleue de
coomassie.
Figure (IV-4) : Appareils pour électrophorèse en gel de polyacrylamide (migration verticale)
II- 3- 5- Electrophorèse en champ pulsé
Cette méthode de séparation est réservée aux macromolécules telles que l’ADN, ou la
séparation est impossible avec les systèmes d’électrophorèse conventionnels, où au-delà d’un
certain poids la séparation devient indépendante de ce paramètre. Le déplacement des particules
chargées s’effectue dans un champ électrique dont le sens ou l’orientation varient de façon
alternative. Le support est constitué d’agarose, le voltage imposé est de l’ordre de 10 V/cm et la
fréquence d’inversion du champ électrique est de 10 à 0.01 hertz (figure IV-5). Au cours de la
mise en marche de l’électrophorèse, les grosses molécules d’ADN adoptent une conformation
favorable à leur déplacement dans le sens imposé par le champ électrique, puis migrent à une
vitesse qui ne dépend pas de leur taille. En revanche, le temps nécessaire pour qu’elles adoptent la
conformation optimale est lié à leur taille. Ainsi, à chaque changement d’orientation du champ
électrique, le temps mis pour qu’elles repartent dans la nouvelle direction imposée est variable et
dépend de leur poids moléculaire. En jouant sur la fréquence des changements d’orientation du
champ électrique, il devient donc possible de séparer ces molécules.
Figure (IV- 5) : Dispositif d’électrophorèse en champ pulsé 8

Animations :
Electrophorese non denaturante sur gel de polyacrylamide

http://www.youtube.com/watch?v=eAd9e2pi-rI&feature=related
Electrophorèse sur gel -Vidéo

http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=Jru-HXR3Y48
Electrophorèse de zone - Vidéo

http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=R5enyBOEwCI#t=0s
III- Méthodes chromatographiques

III- 1- Définition et principe de la chromatographie
III-1-1- Définition
La chromatographie désigne un ensemble de méthodes d’analyse immédiates qui

permettent la séparation, la purification et parfois l’identification des composés d’un mélange. Ces
méthodes sont basées sur les principes physiques et ont en commun d’utiliser un support fixe qui
est « la phase stationnaire » faite de matière poreuse (poudre) solide percée de fins canalicules; et
une phase mobile liquide ou gazeuse.
III-1-2- Principe et différents mécanismes de chromatographie :
En chromatographie, les molécules à séparer sont dissoutes dans un solvant et la solution

obtenue circule entre les particules du support. Des interactions physiques (forces de Van der
Waals, liaisons polaires, forces ioniques) s’établissent entre le support (généralement sous forme
de colonne) ayant une grande surface de contact et les molécules à séparer. Des réactions de
fixation rapides et réversibles se produisent. Leurs forces dépendent de la nature chimique des
molécules à séparer. Les molécules sont  retenues en faisant passer dans le support une solution
convenable qui va entraîner certaines molécules plus vite que d’autres, ce qui permet ainsi leur
séparation (élution). La figure (IV-6) donne un système de séparation par chromatographie sur
colonne de fractions en mélange dans une solution.
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I
Figure (IV-6) : Séparation par chromatographie sur colonne des fractions en mélange dans une
solution.
Selon le type d’interaction existant entre les molécules à séparer et le support, nous
distinguons cinq types de mécanismes de chromatographie :
• chromatographie d’adsorption : elle utilise un support appelé adsorbant qui fixe les molécules à
séparer par des liaisons hydrophobes ou des forces de Van der Waals . La grande surface
d’échange fait que ces liaisons s’établissent facilement et que les molécules fixées peuvent
aussi être libérées (Figure IV-7). Les adsorbants utilisés sont : le gel de silice, l’oxyde de
silicium (SiO2), l’alumine Al2O3 ,… . Certains de ces adsorbants sont activés par chauffage afin
d’éliminer l’humidité. Les solvants utilisés pour l’élution sont de nature organique : pétrole
léger, cyclohexane, benzène, …. , (apolaires). propanol, éthanol,… (polaires forts).
Figure (IV-7) : Chromatographie

d’adsorption
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• Chromatographie d’échange ionique : elle est basée sur la formation de liaisons ioniques, le
support (échangeur d’ions) est constitué de volumineuses molécules insolubles, chargées de
même signe (Figure IV-8). Quand le support est chargé (+) il capte les ions (-) alors que quand
il est chargé (-) il capte les ions (+). Les ions fixés sont appelés : ions échangeables. Selon leurs
nombre de charges et leurs natures chimiques, ils sont retenus avec  de force. Les supports
utilisés pour l’échange ionique sont des polymères organiques (résines), exemple : styrène,
divinyl benzène, … . Ces gels solidifiés sont par la suite broyés et sélectionnés en grain de
tailles bien fixées. La séparation des ions fixés s’effectue grâce à une variation de pH de la
solution dans laquelle baigne la résine d’échange. Cette technique chromatographique est
utilisée pour la séparation des petites molécules chargées et des ions des minéraux (acides
aminés, peptides,….) (l’eau est désionisée par passage sur résine échangeuse d’ions :
distillation).
Figure (IV-7) : Supports échangeurs d’ions (Phase fixe)
• Chromatographie par gel-filtration : le support utilisé est constitué d’un support fait de grains
d’une matière poreuse qui laisse pénétrer les petites molécules, alors que les grosses restent à
l’extérieur des pores (fig IV-8). Les supports utilisés sont les plus souvent des polymères de
glucose, des polyacrylamides, de l’agarose, … . Ces supports en poudre suspendus dans une
solution tampon sont transformés en gel. L’échantillon est déposé à la surface du gel. L’élution
est par la suite effectuée en se servant de tampons volatils avec un débit approprié afin d’éviter
les problèmes d’adsorption. La chromatographie par gel – filtration est appliquée pour
l’élimination de sels ou la désionisation (exemple : élimination de sulfates d’ammonium).
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Figure (IV-8) : Chromatographie par gel-filtration

• Chromatographie de partage : cette technique utilise un support qui retient un premier solvant,
par exemple l’eau. Ce dernier est traversé par un second solvant non miscible (toluène par
exemple). Les substances à séparer vont se partager entre les deux solvants. Celles qui sont plus
solubles dans le second solvant (toluène) sont entraînées en premier. La matière poreuse
constituant le support n’intervient pas dans la chromatographie mais sert seulement de support
à l’un des deux solvants, (exemple : chromatographie sur papier ou sur couche mince).
• Chromatographie d’affinité : cette technique fait appel au principe de la reconnaissance
spécifique de deux molécules entre elles et de leur fixation l’une à l’autre avec haute affinité
exemple : la formation des complexes enzyme - substrat ou antigène - anticorps (la fixation
d’hormone sur son récepteur). L’un des deux membres du couple (anticorps par exemple) est
attaché à un support poreux, et adsorbe spécifiquement l’autre membre du couple (antigène
spécifique) (Figure IV-9).
Figure (IV-9) : Chromatographie d’affinité
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II-2 Exemple de techniques chromatographiques :
III-2-1- la chromatographie en phase gazeuse :
a) Principe : la chromatographie en phase gazeuse (CPG) est un type de chromatographie de

partage utilisable pour l’analyse de petites molécules volatiles ou devenant volatiles par traitement
chimique.
On opère dans des colonnes spéciales, portées à haute température pour maintenir les
molécules sous forme gazeuse. Les échantillons à chromatographier sont dissous dans un solvant
vaporisable. Ils sont transformés en vapeur dans une chambre d’injection préchauffée à
température élevée. Ils sont ensuite entraînés à travers la colonne par un gaz inerte dit gaz vecteur.
• Il y a la chromatographie gaz-solide : la séparation des molécules à analyser peut résulter
d’un partage entre le support solide lui même et le gaz.
• Il y a la chromatographie gaz-liquide : dans ce cas, la séparation est due à un partage des
molécules à analyser entre le gaz qui circule et une phase liquide qui imprègne le support
inerte.
Les molécules séparées sont détectées à leur sortie par un détecteur.
b) Appareillage : L’appareil comporte quatre parties essentielles : vaporisateur, colonne de

séparation, détecteur, enregistreur (figure IV-9).
Figure (IV-9) : Constituants d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse
 ) Vaporisateur ou chambre d’injection : Cette chambre est portée à température élevée

et qui peut être réglée indépendamment du reste de l’appareil (de 50 à 400°c). Le plus souvent
l’échantillon est liquide. Il est introduit à l’aide d’une micro seringue (il existe également des
dispositifs d’introduction automatique de l’échantillon) sous un volume inférieur à 100µl, avec
rapidité pour que la vaporisation soit brutale (Figure IV-10).
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Figure (IV-10) : Chromatographie en phase gazeuse : Chambre d’injection
β ) Colonne : Il existe deux types de colonnes utilisables :

les colonnes compactes et les colonnes capillaires. Elles sont vendues déjà remplies et prêtes à
l’emploi.
-Les colonnes compactes : ont 1 à 3 m de long et un diamètre de 2 à 8 mm ; elles sont faites
d’acier, de cuivre, d’aluminium, de verre ; et sont disposées en spirale dans l’appareil. Elles sont
remplies d’un support solide en poudre fine comme la terre de diatomées, la brique rouge pilée, la
brique blanche, le charbon actif, l’argile…
-Les colonnes capillaires : ont 20 à 100 m de long et un diamètre de 0.25 à 1 mm ; elles
sont faites d’acier, de cuivre, d’aluminium ou de verre (Figure IV-11). La différence avec les
colonnes compactes, c’est qu’il n’y a pas de support introduit dans la colonne : la phase
stationnaire forme une mince couche sur la paroi du capillaire. Ce type de colonne s’utilise dans
les chromatographies gaz-liquide et sont difficiles à manipuler. Pour cela d’autres types de
colonnes ont été proposées : Ce sont des colonnes intermédiaires dites : capillaires - compactes.
Figure (IV-11) Exemple de colonne capillaire
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γ) Détecteur et enregistreur : Les molécules séparées dans la colonne arrivent à la sortie

à l’état gazeux et sont détectées et évaluées selon des méthodes physiques.
Les principaux détecteurs utilisés sont : le détecteur à ionisation de flamme, le détecteur à capture
d’électrons, le détecteur de phosphore.
Le détecteur à ionisation de flamme est thermostaté, le plus souvent à température élevée pour
maintenir les molécules sous forme gazeuse (Figure IV-12). Il est le plus pratique car il est très
sensible et facile à utiliser. Le gaz vecteur à la sortie de la colonne est mélangé avec l’hydrogène
qui est brûlé entre deux électrodes. Tant que le gaz vecteur est pur, le courant de 175 à 200 volts
circulant entre deux électrodes est constant et son enregistrement sur l’enregistreur décrit la ligne
de base. Si les vapeurs organiques se joignent au gaz vecteur, leur combustion modifie l’intensité
du courant qui est amplifié et transmis à l’enregistreur où il se marque sous forme d’un pic dont la
déflexion est proportionnelle à la quantité de substance détectée (figure IV-13). Le détecteur de
phosphore est constitué de deux détecteurs d’ionisation de flamme superposés, séparés par une
grille en platine recouverte d’un sel alcalin. Le gaz brûlé au premier étage passe au second étage
ou il sera brûlé une seconde fois, le sel alcalin favorise son ionisation en, particulier, lorsqu’il
comporte des dérivés du phosphate. D’ou l’utilisation de ce détecteur pour l’analyse des
substances contenant le phosphate. La chromatographie en phase gazeuse permet le dosage des
composés séparés, soit par calcul de la surface des pics observés sur le diagramme
d’enregistrement soit, le plus souvent à l’heure actuelle, à l’aide d’une calculatrice branchée
directement sur l’enregistreur.
Figure (IV-12) : Schéma de principe d’un Figure (IV-13) : Exemple de chromatogramme

détecteur à ionisation de flamme. obtenu par CPG.
c) Application de la chromatographie en phase gazeuse : Elles sont très nombreuses. On peut

citer en particulier, les dosages d’acides gras libres, d’acides aminés, d’oses (sucres), de
stéroïdes (hormones, par exemple), de produits toxiques, de médicaments….
Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectrométrie de masse est
particulièrement intéressant pour l’identification de substances naturelles ou médicamenteuses. La
chromatographie en phase gazeuse peut être également couplées à d’autres dispositifs tels que : la
spectrophotométrie à infra rouge, la RMN, … .
15
IV-2-2 Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) :
a) Définition : C’est une méthode applicable à tous les types de chromatographie en colonne
avec élution en phase liquide. Elle utilise comme support des particules de faible diamètre. La
pression nécessaire à l’élution est très élevée ( > 30 bars). Elle nécessite l’emploi d’un
appareillage lourd contrôlé par ordinateur. C’est une méthode très sensible qui a un grand
pouvoir séparateur et une grande rapidité.
b) Appareillage :
La figure (IV-14) donne un schéma de principe d’un appareil d’HPLC. Ce dispositif comprend les
éléments suivants :
Figure (IV-14): Schéma synoptique d’un appareil de Chromatographie Liquide à Haute

Performance (d'après Perkin Elmer) et exemple de dispositif HPLC (Agilent série 1100).
α) Module de commande (ordinateur): Ce module de commande est indispensable pour

une bonne gestion de l’ensemble de l’appareillage. Ainsi, l’ordinateur gouverne l’élution, les
changements de température pendant les séparations, de tampons éventuellement, la durée des
élutions, commande les pompes, la pression dans l’ensemble du dispositif. Dans certains cas, il
calcule les paramètres servant au repérage des pics et leurs surfaces, réalise le contrôle statique
des pics, les compare avec les valeurs de référence et fournit les résultats en même temps qu’un
diagramme d’élution au fur et à mesure que les séparations se produisent.
β) Pompes : L’alimentation de la colonne en phase mobile liquide (tampons, solvants…)
nécessite un système de pompes. Les pompes peuvent être pneumatiques ou le plus souvent
électriques, sous forme de seringues ou à piston. Les pompes entraînent le solvant contenu dans
un réservoir, afin d’alimenter la colonne. Les pompes peuvent se dérégler à la longue : il est bon
de les vérifier tous les mois. Il faut également les protéger contre la corrosion, pour cela il faut
filtrer les solvants (très purs) et éviter ceux contenant l’ion Cl- (car il risque d’oxyder l’acier du
cylindre des pompes). La figure (IV-15) présente un exemple de modules de pompes pour HPLC.
16
Figure (IV-15) : Modules de pompe d’un appareil HPLC
γ) Injection d’échantillon : L’introduction de l’échantillon est réalisée par l’injecteur. Celui ci

peut être simplement une seringue de précision ; ou pour les appareils les plus sophistiqués,
l’injecteur comporte un (ou plusieurs) boucles capillaires comportant une vanne et un système de
contrôle (cas de pressions hautes = 600 bars) (Figure IV-16).
Figure (IV-16) : Système d’injection à boucle capillaire (100 µl de volume injecté)
) Colonnes : Les colonnes sont courtes : de 5 à 25 cm de long et 4 à 5 mm de diamètre.

Elles sont constituées d’acier inoxydable. Parfois, un tube en verre est inséré dans le tube d’acier.
La paroi interne du tube est lisse de telle sorte que les fins granules du support puissent se
disposer avec une régularité parfaite. La colonne est disposée dans une enceinte thermostatée à ±
0.1°C. Les réactifs doivent être préchauffés afin qu’ils parviennent à la colonne à la même
température (Figure IV-17).
17
(B)
(A)
Figure (IV-17) : (A) : Colonnes et seringues d’injection pour un appareil HPLC ; (B) :
Image microscopique (MEB) d’une coupe d’une colonne tubulaire sur laquelle est fixé un
polymère organique: PSDVB
ε) Détecteur : De la sensibilité du détecteur dépend la sensibilité des dosages et des

détections. Il n’y a pas de détecteur universel : on est obligé de choisir le détecteur en fonction de
la nature des substances à chromatographier. Il en résulte que l’HPLC se prête mieux à des
dosages de grande série avec un type défini de substances qu’à des utilisations de recherche
destinées à mettre en évidence des composés inconnus. On peut utiliser un dispositif
spectrophotométrique qui mesure la densité optique dans le visible, l’U.V ou l’infrarouge, ou
bien la spectrométrie de masse. Si les échantillons sont marqués par un isotope comme le 14C ou
3
H, on peut pratiquer une détection par scintillation liquide.
c) Applications de l’HPLC : Les différentes méthodes de séparation en chromatographie en

basse pression sont utilisables en HPLC. Par exemple, les colonnes séparant selon le principe
d’adsorption ou d’échange d’ions … séparent les mêmes types chimiques de composés en basse
et haute pression.
IV- L’analyse automatique en biochimie
La demande croissante des analyses biochimiques par les médecins, a exigé aux
laboratoires d’analyses de se doter d’appareils et équipements de haute performance, qui
permettent de suivre la cadence imposée par la demande. A cet effet, aux cours des dernières
décennies, de nombreux appareils ont été conçus pour mesurer automatiquement les paramètres
courants demandés en analyses biochimiques. Ces automates sont pratiquement tous pilotés par
ordinateur ou par un calculateur, ce qui facilite à la fois à l’opérateur la mise en fonctionnement de
l’automate, ainsi que la gestion des résultats des analyses effectuées.
18
Un automate en biochimie peut être conçu pour doser un seul paramètre

(monoparamètrique) ou plusieurs paramètres (multiparamétriques). Il peut aussi effectuer, sur une
série d’échantillons, analyse par analyse (à la fois sur tous les échantillons), ou effectuer toutes les
analyses sur chaque échantillon séparément.
En général, les automates fonctionnent selon les deux principes suivants :
• l’invariance du système : tous les échantillons sont soumis à des procédures analytiques
identiques, la seule variable est la concentration ;
• l’analyse constamment relative : les échantillons sont traitée dans les mêmes conditions
que des étalons appelés calibreurs, la concentration des premiers est déduite de celle des
seconds.
Ainsi, nous distinguons trois types d’automates : les automates en flux continu, les automates à
transfert mécanique et les automates centrifuges.
IV- 1- Les différentes opérations d’une analyse automatique
IV- 1- 1- Opération de prise d’essai d’échantillon
L’échantillon (en général, un sérum du patient) est prélevé puis déposé dans un godet à
réaction ou injecté dans une veine liquide en flux continu.
Le passeur d’échantillons comporte un dispositif contenant les échantillons et un
mécanisme de pipetage (figure IV-18). Les échantillons disposés dans des godets, sont répartis sur
un plateau d’échantillonnage. Le plateau peut être animé d’un mouvement circulaire et ou les
échantillons viennent de se placer au dessous du système de prélèvement (figure IV-18) ; ou le
plateau est fixe et le système de pipetage se déplace vers le godet contenant l’échantillon à
prélever (figure IV-18), dans ce cas, le système de prélèvement est animé d’un mouvement selon
les trois coordonnées de l’espace (x,y,z). La reconnaissance de l’emplacement de l’échantillon est
assurée par le système de pilotage qui est un micro-ordinateur. Le mécanisme de prélèvement
comporte deux parties :
• un bras robot porteur d’une aiguille de prélèvement qui sert à pipeter des volumes
d’échantillons ;
• un dispositif d’aspiration constitué d’une pompe péristaltique ou d’une seringue.
Figure (IV- 18) : Exemples de passeurs automatiques d’échantillons (SA1100 (a) et SA1074 (b) –
Skalar)
19
La pompe péristaltique est schématisée sur la figure (IV-19) ; elle est constituée de rouleaux qui
sont en mouvement de rotation, au cours duquel ils exercent une pression sur les fluides. Cette
pression permet à ces fluides de circuler à une vitesse constante.
Figure (IV-19) : Principe de fonctionnement d’une pompe péristaltique et exemple de pompe
IV- 1- 2- Purification de l’échantillon
Cette opération est généralement utilisée uniquement sur les automates en flux continu.
Elle consiste à déprotéiniser l’échantillon par dialyse (Figure IV-20).
Flux vers
les déchets
Flux porteur
(Echantillon)
Flux receveur
(diluant, Membrane
réactifs) dialysante Flux vers
l’analyseur
Figure (IV-20) : Principe et exemple de dialyseur utilisé dans les automates en flux continu
(Skalar).
IV- 1- 3- Addition des réactifs
Sur les appareils en flux continu, l’addition des réactifs est faite au niveau des pièces de
raccordement (figure IV- 21). Alors que sur les appareils de transfert, deux types de mécanismes
peuvent assurer l’addition des réactifs :
• dans l’un, les godets sont fixes, un bras robot se dirige vers le flacon à réactif, prélève un
volume donné de réactif au moyen d’une aiguille d’aspiration et d’une seringue, puis se
dirige vers l’échantillon et diverse le réactif. Cette opération se termine par un rinçage du
dispositif,
• dans l’autre, le poste de distribution constitué d’un réservoir à réactif, d’une seringue et
d’une aiguille, est fixe et le godet se déplace pour venir sous le poste de distribution.
20
Figure (IV-21) : Pièces de raccordement utilisés pour l’addition des réactifs et la dilution
IV- 1- 4- Homogénéisation du mélange réactionnel

Cette opération est indispensable pour une meilleure qualité des résultats, elle peut être
assurée par différents procédés. Par exemple, dans le cas des automates en flux continu, le
mélange est obtenu par une bobine de mélange (figure IV-22) ; tout segment liquide qui parcourt
une spire est culbuté sur lui même, ce qui équivaut une agitation. D’autres types d’agitations
peuvent aussi être utilisés (mécanique, magnétique, …).
Figure (IV-22) : Bobines de mélange utilisées dans le cas des automates en flux continu
IV- 1- 5- Incubation
L’incubation est un procédé qui consiste à maintenir le mélange réactionnel à une
température constante et homogène, pendant une durée fixée. Il existe différents types
d’incubateurs : bains-Marie (Figure IV-23), four à air, … .
Figure (IV-23) : Bain Marie utilisé dans le cas des automates en flux continu (Skalar)
IV- 1- 6- Mesures
Les méthodes adoptées pour les mesures sont généralement des méthodes physiques
(potentiométriques ou optiques). Dans la majorité des cas, ce sont des mesures photométriques,
visible ou UV. Les différents systèmes optiques utilisés ont été déjà décrits dans le chapitre II. Les
mesures peuvent être prises directement dans les godets à réaction, qui doit présenter les qualités
optiques requises ; ou dans une cuve après transfert du milieu réactionnel. Dans le cas des
automates en flux continu, les mesures sont effectuées dans une cuve à circulation.
21
IV- 1- 7- Acquisition et traitement des mesures

Ces fonctions sont assurées par la partie informatique de l’appareil, qui a en charge
l’acquisition des résultats de la mesure après transformation du signal analogique en signal
numérique, puis les calculs nécessaires (calcul de concentration par exemple), enfin le secrétariat
et l’archivage des résultats.
IV- 2- Analyseur en flux continu

IV- 2- 1- Présentation
Cette technique a été mise au point par la société Technicom en 1950 (Premiers analyseurs
automatiques en biochimie. Les réactions s’effectuent dans un courant de liquide bullé et animé
d’un mouvement continu. La chaine de première génération des automates en flux continu a été
composée de modules reliés entre eux. Chaque module remplit une fonction bien définie. Les
échantillons (veine liquide) passent d’un module à un autre à travers un tube en plastique souple.
Dans le cas de ces automates, les différents échantillons sont injectés de manière continue et
séparément afin d’effectuer leur analyse. Des bulles d’air avec de l’eau distillée ou le diluant sont
utilisés pour séparer les échantillons. Les réactifs sont introduits dans l’automate à l’aide des
pièces de raccordement
L’air introduit avec les échantillons présente trois fonctions :
• il constitue une barrière entre les échantillons lors du prélèvement, afin d’éviter la
contamination de l’un par l’autre ;
• il nettoie continûment le système (le passage de chaque goutte liquide est suivi par une
bulle d’air), l’appareil est ainsi autonettoyant ;
• il limite la diffusion de l’échantillon dilué dans le diluant.
Les analyseurs de première génération sont des appareils mono paramétriques, modulaires,
pour lesquels il suffit de changer un module ou modifier le branchement des différents tuyaux
pour changer de dosage. Les analyseurs de la deuxième génération se caractérisent par le
regroupement de cassettes de certains modules sous forme miniaturisée (bobines, dialyseurs, …).
Chaque dosage nécessite une cassette analytique et une cassette de réactifs. Ensuite, sont apparus
les analyseurs multiparamétriques non sélectifs qui effectuent six dosages, puis 12 dosages à la
cadence de 60 échantillons par heure. Enfin, des analyseurs multiparamétriques sélectifs
informatisés sont apparus, tel que SMAC de la société Technicom qui effectue 1 à 20 analyses sur
un échantillon à la cadence de 150 échantillons par heure.
IV- 2- 2 Exemple d’automate en flux continu :

Dans ce qui suit, nous allons étudier un exemple d’automate en flux continu moderne c’est
l’automate San ++ Analyser de marque Skalar (figure IV-24).
Figure IV-24 : Automate en flux continu San ++ Analyser de marque Skalar
22
a- Les distributeurs d’échantillons et prélèvements :

Différents distributeurs d’échantillons sont proposés par la fabriquant, la figure (IV-18)
donne deux exemples de distributeurs. Le distributeur d’échantillons comporte un plateau pouvant
recevoir plusieurs dizaines de godets. Une aiguille aspire l’échantillon du godet. Le volume du
prélèvement dépend de sa durée, de la section du tube et de la vitesse de rotation de la pompe
péristaltique (ou du mouvement du piston de la seringue). Entre deux pipetages, une bulle d’air est
aspirée et l’aiguille plonge dans de l’eau de rinçage. Ainsi, un cycle de prélèvement comporte un
pipetage et un rinçage (ou liquide de dilution). Sur l’auto-analyseur, la fréquence d’admission des
échantillons et du liquide de rinçage peut être réglée selon des proportions choisies. Par exemple,
pour une admission de 60 échantillons par heure, les durées de prélèvement et de rinçage peuvent
être choisies selon les rapports suivants : 40 secondes pour le prélèvement de l’échantillon et 20
secondes pour le liquide de rinçage. Il faut noter que, le choix des durées d’aspiration et de rinçage
conditionne la cadence d’analyse et le tracé des enregistrements. La figure (IV-25) montre
clairement l’effet de ces paramètres sur les résultats des enregistrements des analyses.
a
b c
Figure (IV-25) : Tracé des résultats des analyses selon la prise d’essai d’échantillons et du
liquide rinçage : (a) prélèvement normal, (b) prélèvement excessif du liquide de rinçage, (c) faible
quantité de prélèvement du liquide rinçage impliquant un chevauchement entre les échantillons
b- Les bobines : ce sont des serpentins de verre comportant 5 à 30 tours. Ils ont un triple rôle :
• les bobines de mélange : chacune des spires culbute les segments liquides sur eux même
(figure IV-22) ;
• les bobines de délai : utilisées lorsque la réaction est longue, pour assurer un temps de
contact suffisant entre les réactifs et l’échantillon (bobines de bain-marie) ;
• les bobines de refroidissement : en sortie du bain-marie, les bulles d’air sont dilatées,
après le transit dans la bobine de refroidissement, elles reprennent leur dimension initiale.
c- Le dialyseur : Ce module assure la déprotéinisation de l’échantillon. Il est constitué de deux

plateaux creusés chacun d’un demi-sillon et séparés par une membrane dialysante semi-perméable
(figures IV-20). La veine liquide traverse le demi-sillon supérieur et passe sur la membrane (flux
porteur). A travers cette dernière, les petites particules diffusent (ions, urée, glucose, …). Dans
l’autre demi-sillon inférieur (de l’autre côté de la membrane), circule un liquide bullé, appelé
liquide de contre-dialyse (flux receveur ; les petites particules du flux porteur qui traversent la
membrane, sont recueillies par le flux receveur). Les deux liquides circulent dans le même sens et
au même débit.
La vitesse de dialyse dépend de la température, du diamètre des pores, du temps de contact
et de la différence de concentration entre les deux milieux.
e) Le colorimètre : à ce niveau de l’appareil, les mesures optiques permettant de déduire la

concentration de la substance à analyser sont effectuées. La veine liquide, constituée par des
segments liquides colorés correspondant aux échantillons séparés des segments liquides non
colorés et correspondant au blanc, est tout d’abord débullée avant de passer dans la cuve à flux
continu du photomètre (figure IV-26). Pour réguler la fluctuation du liquide due à l’élimination de
23
l’air, une pompe reliée à la sortie de la cuve aspire le liquide avec un débit de 60 à 70 % du flux
total de la veine avant l’arrivée au photomètre.
Le système de pilotage trace le graphe de l’absorbance en fonction du temps. Le zéro
optique est réglé sur les réactifs (équivaux au blanc), lorsqu’un échantillon traverse la cuve,
l’absorbance augmente, passe par un maximum et s’annule. On obtient ainsi un pic pour chaque
échantillon (Figure IV-27). Selon le type d’analyses à effectuer, d’autres systèmes d’analyses
peuvent être utilsés tels que les spectrophotomètres UV-Visible, les fluorimètres, les photomètres
à flamme, … .
Figure (IV-26) : Photomètre utilisé par l’automate San ++ - Skalar.
24
Figure (IV-27) : Exemples de résultats d’analyses effectuées par l’automate San ++

- Skalar sur une série d’échantillon. Le maximum du pic relatif à chaque échantillon
est comparé à une courbe de calibration et la concentration de l’espèce analysée est
déduite.
IV- 2- 4- Les applications des analyseurs en flux continu

Les applications des analyseurs en flux continu sont multiples, aussi bien en biochimie, en
hématologie ou en immunologie. En biochimie, nous citons comme exemples d’application :
• les dosages d’absorptiométrie moléculaire en visible et en UV (enzymologie) ;
• les dosages en émission de flamme : Na+, et K+ par photométrie de flamme ;
• les dosages fluorimétriques ;
• les dosages néphélométriques et opacimétriques,
• la chromatographie liquide.
Et bien d’autres applications.
IV- 3- les appareils de transfert

Ces automates d’analyse travaillent en mode discontinu : les transferts de l’échantillon et
du réactif s’effectuent de manière indépendante vers le milieu réactionnel, qui est lui même
transféré vers le dispositif de mesure.
La première génération de ces analyseurs était monoparamètrique, non informatisée et
réservée pour les analyses enzymatiques. Comparés aux analyseurs en flux continu, ces automates
présentaient l’avantage d’économiser les réactifs. En revanche, ils n’offraient pas de possibilités
d’adaptation, les traitements des échantillons et des mesures sont imposés une fois pour toutes par
le constructeur.
Les appareils de transfert de la deuxième génération sont informatisés (appareils pilotés par
ordinateur ou par calculateur incorporé). Le technicien peut programmer les procédures de
l’analyse : volume de l’échantillon et des réactifs, température et durée d’incubation, mesures et
leurs traitements.
La partie mécanique des appareils de transfert comporte : un passeur d’échantillons, un
dispositif d’addition des réactifs, un mécanisme agitateur, un incubateur et un dispositif de lecture.
Exemple : Automate de biochimie Olympus AU 600 IVD (Voir fichier PPT)
25
IV- 4 - Analyseurs automatiques en chimie sèche
IV- 4 - 1- Principe d’analyse
A l’inverse des analyseurs automatiques étudiés jusqu’à présent, les analyseurs

automatiques en chimie sèche n’utilisent ni liquides de dilution, ni réactifs, ni liquides de
nettoyage. En effet les opérations analytiques de réactions et de mesures se déroulent directement
sur des plaques sèches. Ces plaques sont constituées de plusieurs couches de réactifs déposées sur
un support en polyester incolore de petite taille (quelques cm2 de surface). Lorsqu’une goutte de
l’échantillon est déposée sur la plaque, elle réagit avec les réactifs, les résultats de ces réactions
peuvent être lus à l’aide des mesures colorimétriques (optiques) ou potentiometriques. Ainsi, il
existe deux types de plaques : les plaques enzymatiques et colorimétriques ; et les plaques
potentiometriques.
La figure (IV-28) donne le schéma d’une plaque colorimétrique, représentée avec ses
différentes couches, nous distinguons :
• Une couche d’étalement : c’est une couche poreuse qui permet d’étaler
l’échantillon et de le transférer vers la couche de réactif ;
• Une couche de réactif : c’est la couche de réaction, elle contient les réactifs, les
enzymes, les tampons et les catalyseurs nécessaires pour le développement des
réactions chimiques ;
• Une couche d’enregistrement : au niveau de cette couche, une coloration des
produits des réactions chimiques est effectuée et conduit à la formation de
complexes identifiables à l’aide des mesures colorimétriques, en choisissant la
longueur d’onde appropriée au complexe formé ;
• Une couche en plastique transparent, nécessaire pour maintenir les différentes
autres couches.
Figure (IV-28) : Schéma d’une plaque colorimétrique utilisée dans les automates en chimie sèche
Une fois la réaction est développée, des mesures optiques peuvent être entreprises pour
déterminer la concentration de l’espèce à analyser. La figure (IV-29) donne le schéma d’un
système optique pour la mesure (colorimètre de l’analyseur Vitos 500 de Kodak).
26
Figure (IV- 29) : Réflectomètre de l’analyseur Vitos 500 de Kodak
La figure (IV-30) représente un exemple de plaque potentiométrique utilsée en chimie sèche.

Nous distinguons un pont au papier sur lequel peuvent être placées une goutte du sérum du patient
à analyser et une goutte d’un liquide de référence. Ce pont est maintenu sur deux piliers identiques
formés d’une membrane sélective d’ions, d’une couche de référence interne, d’une couche de
chlorure d’argent et d’une couche d’argent. L’échantillon à analyser et le liquide de référence ont
des concentrations ioniques différentes, ce qui se traduit par deux demi-cellules de charges
opposées, dont la différence de potentiel peut être mesurée à l’aide d’un électromètre. En effet, la
figure (IV-31) représente un électromètre constitué par deux paires de points de contact qui
pénètrent dans les zones de contact des cellules. La différence de potentiel mesurée permet de
déterminer la concentration de l’espèce chimique analysée.
Figure (IV-30) : Exemple de plaque potentiometrique Figure (IV- 31) : Electromètre

utilisée en chimie sèche
27
IV- 4- 2- Exemple d’analyseurs automatique en chimie sèche
Comme exemple d’automates en chimie sèche disponibles sur le marché, nous distinguons
l’automate Vitros 250 de la marque Kodak. La figure (IV-31) donne un aperçu global de cet
automate : nous distinguons l’unité principale, l’unité de contrôle constituée d’un microordinateur
et une imprimante. Comme tous les autres automates d’analyses médicales modernes, cet appareil
est totalement automatisé à l’aide de systèmes mécaniques et électroniques auto programmables ;
et totalement informatisé à l’aide d’un microordinateur muni d’un logiciel qui permet le pilotage
de l’appareil et l’analyse et le traitement des résultats, ainsi que leur affichage. En plus, cet
automate est dépourvu de systèmes hydraulique et pneumatique, ce qui simplifie son entretien et
sa maintenance.
Figure (IV-31) : Aperçu global de l’automate Vitros 259 - Kodak
28
Electrophorèse sur gel -Vidéo

http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=Jru-HXR3Y48
Electrophorèse de zone - Vidéo

http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=R5enyBOEwCI#t=0s
Séparation par colonne de chromatographie
29
Principe du tamis moléculaire (gel filtration)
l'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2),
Figure 1: Disposition des électrodes de commun

utilisé pulsés unités sur le terrain gel electrophpresis.
30
31
32
Différents types de colonnes capillaires
33
Figure 4-4. Chromatogrammes de l'huile "d'iris des marais" obtenus (en haut) sur une
colonne capillaire de 50 m et (en bas) sur une colonne
34
Figure 4-5 Principe d'un injecteur "split-splitless"
L'injecteur standard (95% des appareil en sont équipés) d'un chromatographe avec colonne
capillaire est du type "split/splitless". C'est à dire que l'on peut ajuster la quantité de produit
passant dans la colonne par rapport à la quantité injectée dans le chromatographe. Cet ajustement
se fait à l'aide d'une vanne.
Si on injecte un microlitre de produit (1 ml) et que seulement 0,01 ml rentre dans la colonne, on a
un "split" de 100 et 0,99 ml de la solution a été évacué à l'extérieur via la vanne de "split".
En revanche, si l'on dispose d'un produit très minoritaire ou très dilué dans un solvant, on peut
choisir de l'injecter en mode "splitless", dans ce cas tout le produit injecté se retrouve dans la
colonne. Il faut dans ce cas baisser la température du four vers 20-30°C sous la température
d'ébullition du solvant et dans certain cas couper ou déconnecter le détecteur pendant l'élution du
solvant.
Figure 4-6: Principe du détecteur FID
Un des détecteurs le plus répandu est le détecteur par ionisation à flamme (en anglais: FID). Les
effluents à la sortie de la colonne sont brûlés dans une flamme alimentée par un mélange
35
hydrogène-air. La combustion des composés organiques produit des ions qui sont collectés par une
électrode entourant la flamme. Ce courant de flamme est amplifié par un électromètre
qui transforme le courant en tension puis cette tension est dirigée sur un enregistreur.
Ce détecteur est très sensible, car il donne un signal pour environ 2 pg de produit. Il est linéaire.
En revanche, il est discriminant, sa réponse varie suivant les produits injectés, ce qui impose un
étalonnage si on veut analyser un mélange.
Le détecteur à ionisation de flamme ne donne aucune réponse avec les gaz les composés
inorganiques et des corps très simples comme H2O, NH3, CO2, H2C=O....
Voici le schéma d’une vanne d’injection à six voies.
36
.1. Catharomètre
C’est un appareil simple et robuste, à réponse universelle, mais relativement peu

sensible. Il est fondé sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur
emporté par le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emporté par le gaz vecteur
chargé des molécules de soluté. Ces flux de chaleurs sont produits par des
thermistances, parcourues par un courant continu de tension fixe, dans une enceinte
thermostatée avec précision.
Les thermistances sont montées en pont de Wheastone et celui-ci permet de suivre

l’évolution du courant en fonction de la variation des résistances consécutive aux
variations de température autour des filaments. Un galvanomètre ou un
potentiomètre enregistreurs suivent le courant dans le pont.
37
5.2. Détecteur à ionisation de flamme.
C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le

catharomètre, mais moins universel, car il ne donne de réponse
qu’aux composés organiques.
Il a aussi l’inconvénient, contrairement au catharomètre, de

détruire le soluté qui le traverse, car son principe est de
brûler, dans une flamme d’hydrogène, l’effluent apporté par de
l’azote (gaz vecteur). Sous l’effet d’un champ électrostatique,
il se forme des ions carbone de charge positive qui sont
précipités sur une électrode où ils créent un courant
d’ionisation que l’on amplifie grâce à un électromètre
amplificateur. Sur un enregistreur, on obtient par conséquent
un signal proportionnel au débit - masse du soluté dans le
détecteur. En fait, il n’est pas exactement proportionnel au
nombre d’atomes de carbone du composé concerné, car il y a
une influence défavorable des autres atomes que C et H. Par
contre, il est inutile de placer ce détecteur dans une enceinte
thermostatée.
5.3. Détecteur à capture d’électrons.
Une source telle que le tritium ou le envoie des électrons libres dans le
détecteur. Quand ce détecteur est traversé par des substances ayant une affinité
pour les électrons libres, il se produit des ions qui, comme pour le détecteur à
ionisation de flamme, dans le champ électrostatique existant, sont recueillis par une
électrode et forment un courant d’ionisation à amplifier convenablement.
38
39
Vidéo
http://www.cerimes.fr/le-catalogue/la-chromatographie-en-phase-gazeuse.html
Injecteur diviseur
40
zéolithes
silice
mésostructurée
type hexagonal
mousse V2O5
41
HPLC Schéma de principe (From

Skoog, Holler and Nieman, “Principles
of Instrumental Methods, 5 th. Ed., p. 729.)
42
Fig. Image MEB de la paroi d'une
43
colonne tubulaire sur laquelle est fixee un polymere organique: PSDVB Une
fonctionalisation de ce polymere poreux est realisee avec un compose basique, le
N,Ndimethyldodecylamine pour ajouter des charges et generer un flux osmotique.
DI=20μm
ref. http://pastel.paristech.org/1628/ theseAugustin2005
CPL
8.5 Détecteurs
Il n'existe pas de detecteur universel comme en chromatographie en phase
gaz: detecteurs a ionisation de flamme et a conductivite thermique. En CLHP,
les detecteurs sont specifiques a chaque application.
Le volume de detecteur CLHP doit etre le plus faible possible afin de
diminuer l'elargissement des bandes.
Il existe des detecteurs de proprietes de la phase mobile qui dependent de la
presence d'un solute: indice de refraction, constante dielectrique, densite.
Et des detecteurs de proprietes du solute, que ne possedent pas la phase
mobile: absorbance dans l'ultraviolet, fluorescence ou courant de diffusion
Détecteurs d'absorption dans UV-Vis

Cette detection est basee sur l'absorption d'une lumiere monochromatique.
Elle suit la loi de BeerLambert:
A= .l.c
=longueur d'onde dans UVVis;
c = concentrat. molaire du solute en mol.L1
A = absorbance du solute; sans dimension
rem: La phase mobile doit etre transparente (ne pas absorber) a cette .
= coefficient d'absorption molaire du solute (L.mol1.
cm1)
a .
l = epaisseur (cm) de la solution traversee ou de la cellule.
La quantite minimale detectable est de l'ordre du nanogramme.
Il existe plusieurs types d'appareils:
● a longueur d'onde fixe : ex: =254 ou 313 ou 365 nm du Hg ( source a
vapeur de mercure dont la raie la plus intense est isolee avec des filtres).
● a longueur d'onde variable: 200 a 700 nm dans des spectrophotometres a
balayage utilisant une source continue et un monochromateur a reseau pour
selectionner la longueur d'onde.
● a barrettes de photodiodes, qui donnent la valeur simultanee des intensites
lumineuses sur tout le spectre.
Détecteurs réfractométriques
Ils mesurent la difference d'indice de refraction entre la phase mobile et la phase
mobile avec l'echantillon. Ils necessitent une temperature regulee a 0,01°C, car
les indices de refraction varient avec la temperature.
● Détecteurs électrochimiques
Leur fonctionnement est base sur l'amperometrie, la polarographie, la
coulometrie et la mesure de conductivite.
● Détecteurs par spectrométrie de masse
44
Le couplage CLHP / SM est plus difficile a realiser qu'avec la CPG car il faut
eliminer le solvant d'elution. On peut:
*realiser une vaporisation selective du solute
*utiliser des microcolonnes (L=10 cm, dint=1mm) a faible debit (qq L.min1)
et un volume d'injection de ~ 1 L qui permettent d'introduire la totalite de
l'effluent chromatographique dans le spectrometre de masse. On peut travailler
en nanochromatographie.
Communication Communication
directe entre Remplissage de la boucle en passant par
pompe et colonne la boucle
passant par la
Pompe
D'apres C.Poole p 442 et al http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC2.pdf.
45
Colonnes pour HPLC fabriquée par Restek, France
Agilent technologies
46
Pompe HPLC
Appareil HPLC (Agilent série 1100)
47
100µl
48
Passeur d’échantillons (Jusqu’à 55

échantillons)
PASSEUR AUTO RA104 (FLOWSYS)
Passeur automatique pour
accroître la productivité avec
éprouvettes 16 x 75 mm (15
ml);
• Nombre de positions: 52
(52+52 avec option double
capteur)
• Option double capteur:
disponible
• Type d’échantillonnage:
séquentiel (accès aléatoire
sur demande)
• Sélecteur échantillonnage
manuel : en standard
• Détecteur de position initiale
du portoir : en standard
POMPE
49
PERISTALTIQUE
Conception spéciale
accroissant la durée de vie
du tube.
12 tubes disponibles pour la
chimie complexe.
Nouveau système d’injection
d’air permettant une
injection précise et à bruit
réduit.
Vannes nettoyage/réactifs
permettant un
arrêt/démarrage rapides,
pas d’erreur de position des
réactifs. Des vannes peuvent
être utilisées également pour
la double gamme.
OPTOELECTRONIQUES
Le module optoélectronique
comprend:
n. 1 colorimètre haute
sensibilité avec détecteur
solide state
n. 1 cellule passante de petit
volume avec passage des
bulles
n. 1 roue filtre à 9 positions,
totalement contrôlée par un
sélecteur de longueur
d’onde en face avant
n. 1 jeu de cartes
électroniques pour le
traitement des signaux et le
débullage électronique.
50
MANIFOLD
Comprend tous les composants nécessaires pour la réaction spécifique:
bobines de mélange, bain chauffant, dialyseur, bain de distillation,
digesteur UV, extraction par solvant.
Méthodes multitest: plus de 800 méthodes disponibles. Certaines sont
spécifiquement développées pour fonctionner sur le même manifold.
Plusieurs types de manifold multitest sont proposés, seuls les réactifs sont
changés entre les différents tests.
SYSTEA C ANALYSEUR A FLUX CONTINU

Spécifications techniques
Passeur
Dimensions/ poids: 56x44x22 cm; 15 kg Positionnement: Prélèvement et
51
portoir pilotés
par moteur pas
à pas
Alimentation: 220 V 50 Hz Nombre
d’éprouvettes:
52+52
Option double
passeur:
Oui Opération: Séquentielle
Autozéro portoir
passeur:
Oui Echantillonnage
manuel:
Oui
Module analytique
Dimensions: 32x52x17
Poids: 15 kg
Alimentation: 12/24 Vcc intégrée en standard
Chaque module analytique comprend
Pompe péristaltique
Positions de tubes: 12
Plaque de pompage: Démontable et règlable; profil spécial pour une consommation
réduite en tube de pompage.
Fixations de la plaque: Deux grenouillères à ressort ajusté
Galets: 12 en acier inoxydable
Colorimètre
Cellule passante: Acier inoxydable, 1 cm (L), 1 mm (dia); fenètres quartz.
Nettoyage aisé
Débullage: Electronique, échantillon et blocage
Plage longueur d’onde: 340 - 880 nm
Roue filtre: 9 positions contrôlées par moteur, choix du filtre par
commutateur en face avant.
Détecteur: Détecteur silicium
Règlages: Ligne de base, Gain, échantillon et blocage
Affichage OD: LCD en face avant
Electroniques
Afficheur LCD: En face avant, sélecteur pour affichage multifonctions
L’écran LCD peut afficher:
Point de consigne de la température pour chaque bain de
chauffage
Température actuelle de chaque bain de chauffage
Lecture énergie du colorimètre
Bain de chauffage ou de
distillation:
Point de consigne de la température affiché en face avant
Température actuelle affichée en face avant
Voyant chauffage on/off
Choix nettoyage/réactif: Commutateur de sécurité en face avant
Echantillon et blocage: Règlage en face avant, état par LED
Interface Flowdata
Nombre de voies: Jusqu’à 6 pour chaque module
Signaux de sortie: Analogiques (standard), entrées série ou parallèle sur demande
pour liaison avec détecteur externe
Communication PC: Via un port série
Alimentation module
analytique:
Integrée
52
Etat de transmission (TX/RX): Voyant LED

Caractéristiques modifiables san préavis en fonction des améliorations apportées aux produits
http://fr.skalar.com/analyseurs/analyseurs-a-flux-continu-cfa
L’analyseur Automatisé pour la Chimie en solution San++ également connu sous la dénomination
Analyseur à Flux Continu a été conçu comme un système modulaire, de manière à pouvoir répondre
aussi bien aux besoins de laboratoires traitant quelques échantillons qu’à ceux en traitant un grand
nombre. Basé sur la technique de l’Analyse en Flux Continu (CFA), on peut réaliser jusqu’à 16
mesures simultanément sur un même échantillon. Grâce à l’ajout de vannes automatiques et au
contrôle par le logiciel, le système San++ permet d’automatiser le démarrage, l’arrêt, les dilutions, les
ré analyses, le rinçage du système et l’archivage des données brutes.
SKALAR
53
Animation Principe d’analyses en flux continu

http://www.skalar.com/assets/flash/Continuous.swf
Détecteurs
La gamme de détecteurs Skalar est la plus large disponible,

comprenant les détecteurs colorimétriques deux canaux, le détecteur original à correction de matrice
pour les échantillons à matrice difficile, et incluant aussi détecteur UV ou IR, fluorimètre,
potentiomètre pour électrodes spécifiques, photomètre de flamme, densimètre, etc. Elle couvre
toutes les techniques requises par les centaines d’applications Skalar disponibles aujourd’hui pour
l’Analyse en Flux Continu, et éprouvées sur le terrain.
Les caractéristiques particulières des détecteurs pour l’Analyseur en Flux Continu (CFA) San++ sont:
• Design compact
• Cadence accrue par la mesure sans débullage
• Accès aisé aux cellules de mesure
• Détecteurs numériques à stabilité et sensibilité accrues, avec réglage d’échelle automatique
• Correction automatique de matrice et de blanc
54
55
Le compartiment de réaction chimique
La conception originale du compartiment de réaction chimique a

démontré ses performances pour des centaines applications , avec le maximum de commodité pour
l’opérateur et le minimum de maintenance de routine. Les derniers développements dans l’Analyse en
Flux Continu (CFA) ont été intégrés aux modules analytiques.
56
La cadence de l’analyseur dépend de l’application, et peut varier de 25 à 120 analyses à l’heure. Elle
est conditionnée par la mise en oeuvre d’opérations plus ou moins complexes telles que distillation,
digestion UV en ligne, extraction, etc..
• Lits de pompe original à double rayon de courbure, pour le dosage précis avec 32 tuyaux de
pompe
• 2 lits de pompe séparés pour un schéma 2x2 canaux
• Injection d’air synchronisée 10 canaux, avec compresseur intégré, pour une stabilité du flux
accrue et un démarrage rapide.
• Accès facile aux modules analytique, avec des connexions flexibles à très faible contamination
entre dialyseurs, réacteurs, bobines de mélange, cellule de mesure et autres composants.
• Détection des fuites
• Tuyaux de pompe à 3 épaulements, de grande longévité.
• Vannes de rinçage manuelles ou automatiques, pour un démarrage facile automatisé et un
fonctionnement autonome.
Le compartiment de réaction chimique est compact et facile à manipuler. Équipé d’une robuste pompe
péristaltique et d’un système d’injection d’air intégrés, il peut recevoir jusqu’à 5 modules analytiques,
avec leurs détecteurs photométrique, et leurs lignes de rejets séparées
La quantité d’applications disponibles pour l’Analyse en Flux Continu (CFA) étant presque illimité, les
plus populaires sont listées ci dessous :
A.B.S. Créatine Nitrates

Acétaldéhyde Cyanures Nitrites
Acide Acétique Densité Azote
Acidité Diacétyle Carbone Organique
Alcalinité Digoxine Pénicilline
Aluminium Activité Enzymatique Perborates
Acides aminés Éthanol pH
Azote Aminé Fluorures Phénol
Ammonium Formaldéhyde Chlorhydrate de Phénylamine
Amylase Acide Formique Phosphates
Amylose Fructose Polyphénols
Agents de Surface Anioniques Galactose Potassium
Acide Ascorbique Glucose Predrisolone
57
Acide Benzoïque Acide L-Glutamique Protéines

Bicarbonates Glycérol Pyruvate
Amertume Dureté Raffinose
Bore Hydrazine Rapidose
Bromures Sulfure d’Hydrogène Sucres Réducteurs
Caféine Hydroxyméthylfurfural Riboflavine
Calcium Hydroxyproline Silicates
Pantothénate de Calcium Iode Sodium
Carbohydrates Fer Sorbitol
Carbone Acide L-D-Lactique Amidon
Acide Citrique Lactose Sucrose
Chlorures Magnésium Sulfates
Chlore Acide L-Malique Sulfites
Cholestérol Maltose Dioxyde de Soufre
Inhibition de la Cholinestérase Manganèse Acide Tartrique
Chrome Méthanol Thiamine
Cobalt Méthanamine Urée
Couleur Niacinamide AciditéVolatile
Cuivre Nickel Zinc
Créatine Acide Nicotinique Et bien d’autres...
Monsieur,
Je suis professeur à la faculté des sciences et techniques de l'université Hassan Premier
à Settat, MAROC. J'enseigne à mes étudiants le module : Techniques et Instrumentation
au sein des laboratoires d'analyses médicales.
Ainsi, je vous demande cher Monsieur le Directeur de bien vouloir me fournir une
documentation scientifique et technique sur votre analyseur en flux continu San++ (si
c'est possible en format électronique). Merci.
Bien cordialement.
M. MIKOU
58
Fig. Appareil de Chromatographie Liquide à

Haute Performad'après Perkin
Elmer et http://web.uconn.edu/rusling/StuartLC3.pdf
compléments:
http://www.rocler.qc.ca/pdubreui/chromatographie/HPL
C/chroma4.html
59
60

ChapIII Bioch 2020

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Chapitre III : Appareils et méthodes utilisés au laboratoire de Biochimie

Le laboratoire de biochimie joue un rôle particulièrement important dans le domaine des

I- Notions utiles en biochimie

On peut aussi classer les sucres en :

I- 1- 2- Propriétés physico-chimiques des glucides

I- 1- 3- Métabolisme des glucides

I- 2- 1- Classification des lipides

…….CH2-) et de glycérol qui est un alcool de formule : CH2OH-CHOH-CH2OH. Lorsqu’il y’a un

I- 2- 2- Métabolisme des lipides

I- 2- 3- Dosages biochimiques relatifs aux lipides

I- 3- 1- Structure des acides aminés et des protéines

I- 3- 2- Métabolisme des protéines

II- Méthodes électrophorétiques

L’électrophorèse est une technique biochimique de base, indispensable pour l’analyse et la

II- 2- Exemple d’application de l’électrophorèse

Figure (IV–1) : Exemple d’appareil d’électrophorèse et de protéinogramme obtenu sur un plasma

II- 3- Différents types d’électrophorèse

II- 3- 1- Electrophorèse sur papier

Figure (IV-2) : Exemple d’appareillage simple pour électrophorèse su papier

II- 3- 2- Electrophorèse sur esters de cellulose

Gel d'agarose avant et

Figure (IV-3) : Electrophorèse sur gel d’agarose (analyse d’ADN)

II- 3- 4- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

Figure (IV-4) : Appareils pour électrophorèse en gel de polyacrylamide (migration verticale)

II- 3- 5- Electrophorèse en champ pulsé

Figure (IV- 5) : Dispositif d’électrophorèse en champ pulsé 8

Electrophorese non denaturante sur gel de polyacrylamide

Electrophorèse sur gel -Vidéo

Electrophorèse de zone - Vidéo

III- Méthodes chromatographiques

La chromatographie désigne un ensemble de méthodes d’analyse immédiates qui

III-1-2- Principe et différents mécanismes de chromatographie :

En chromatographie, les molécules à séparer sont dissoutes dans un solvant et la solution

Figure (IV-7) : Chromatographie

Figure (IV-7) : Supports échangeurs d’ions (Phase fixe)

Figure (IV-8) : Chromatographie par gel-filtration

Figure (IV-9) : Chromatographie d’affinité

II-2 Exemple de techniques chromatographiques :

III-2-1- la chromatographie en phase gazeuse :

a) Principe : la chromatographie en phase gazeuse (CPG) est un type de chromatographie de

b) Appareillage : L’appareil comporte quatre parties essentielles : vaporisateur, colonne de

Figure (IV-9) : Constituants d’un dispositif de chromatographie en phase gazeuse

 ) Vaporisateur ou chambre d’injection : Cette chambre est portée à température élevée

Figure (IV-10) : Chromatographie en phase gazeuse : Chambre d’injection

β ) Colonne : Il existe deux types de colonnes utilisables :

Figure (IV-11) Exemple de colonne capillaire

γ) Détecteur et enregistreur : Les molécules séparées dans la colonne arrivent à la sortie

Figure (IV-12) : Schéma de principe d’un Figure (IV-13) : Exemple de chromatogramme

c) Application de la chromatographie en phase gazeuse : Elles sont très nombreuses. On peut

IV-2-2 Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) :

Figure (IV-14): Schéma synoptique d’un appareil de Chromatographie Liquide à Haute

α) Module de commande (ordinateur): Ce module de commande est indispensable pour

Figure (IV-15) : Modules de pompe d’un appareil HPLC

γ) Injection d’échantillon : L’introduction de l’échantillon est réalisée par l’injecteur. Celui ci

Figure (IV-16) : Système d’injection à boucle capillaire (100 µl de volume injecté)

) Colonnes : Les colonnes sont courtes : de 5 à 25 cm de long et 4 à 5 mm de diamètre.

ε) Détecteur : De la sensibilité du détecteur dépend la sensibilité des dosages et des

c) Applications de l’HPLC : Les différentes méthodes de séparation en chromatographie en

IV- L’analyse automatique en biochimie

Un automate en biochimie peut être conçu pour doser un seul paramètre

IV- 1- Les différentes opérations d’une analyse automatique

IV- 1- 1- Opération de prise d’essai d’échantillon

Figure (IV-19) : Principe de fonctionnement d’une pompe péristaltique et exemple de pompe