3e année de Médecine Immunologie

Immunologie : Introduction

 Le système immunitaire est l’ensemble de : molécules, de cellules et d’organes qui interagissent

entre eux afin de protéger notre organisme en éliminant les xéno-antigènes (non-soi).
 Le système immunitaire est régulé afin qu’il puisse distinguer entre le soi et le non-soi
‘’équilibre’’.
 Il subit les effets des facteurs : externes, hormonaux, psychiques, immunologiques,
médicamenteux…. Qui peuvent induire le déséquilibre de ce système.
 Le déséquilibre de ce dernier, se traduit par l’apparition de maladies (pathologies) qui peuvent
être :
 Intolérance : ne tolère plus le soi.
 Déficience : ne reconnait pas le non-soi.
 Le fond génétique (différence interindividuelle) va induire l’apparition de maladies dis-
immunologiques (maladies auto-immunes…).
 Ces maladies constituent la 3ème cause de morbidité à l’échelle mondiale.

Nous allons traiter les différentes techniques d’exploration en immunologie. La sensibilité de ces
techniques diffère par la quantité minimale de substance (antigène Ag ou anticorps AC) qu’on peut
doser, Ce tableau les classe selon la concentration minimale d’AC détectable :

Test AC µg/ml
Précipitation en milieu liquide 0,5-125
Précipitation en milieu gélifié (Diffusion double ‘’Ouchterlony’’) 3-20
Précipitation en milieu gélifié (Diffusion radiale ‘’Mancini’’) 3-10
Précipitation en milieu gélifié (immunoélectrophorèse) 50-200
Agglutination bactérienne 0,01-0,1
Hémagglutination directe 0,03-0,5
Hémagglutination passive 0,001-0,3
Hémolyse 1
Fixation du complément 0,1-1
Immunofluorescence 0,1
Dosages radio immunologiques ou immunoenzymatiques 0,00001-0,001

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Les techniques d’immunoprécipitation

I/-La liaison Ag-AC :

 Ces techniques d’immunoprécipitation reposent
sur des réactions Ag-AC. Cette liaison résulte de :
 La reconnaissance d’un épitope par un
paratope.
 La superposition de forces attractives et
répulsives non covalentes, de faible énergie.
Ces forces sont de 4 types :
 Liaisons électrostatiques.
 Liaisons hydrogènes.
 Liaisons hydrophobes.
 Forces de Van der Waals.

 La liaison Ag-AC possède deux caractéristiques essentielles : La complémentarité, et la

réversibilité.

 La liaison Ag-AC est une liaison dynamique, car elle est affectée par la température, PH, force
ionique.

 Bases physicochimiques de la
réaction Ag-AC ‘’Courbe de
Heidelberger’’ :
 Zones d’excès d’anticorps : AC ≥ Ag.
 Zone d’équivalence : Tous les Ag du
milieu sont fixés par des anticorps
(un anticorps fixe 2 antigènes) →
Formation de complexe Ag-AC qui
précipitent (descendent au fond du
tube, ce qui nous permet de faire le
dosage).
 Zone d’excès d’antigène : on aura
une compétition entre les antigènes
(Tous les Ag veulent se fixer sur les
AC) ce qui va induite une dissociation
des complexes.

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 L’interaction Ag-AC est non covalente : 34-65 KJ/mole

Ka  Ka : constante d’association
Ag + AC [Ag-AC]
 Kd Constante de dissociation
Kd

[𝑨𝒈−𝑨𝑪] 𝑲𝒂
Kd = 1/Ka → K= [𝑨𝒈][𝑨𝑪] =
𝑲𝒅

 K=Ka/Kd : constante d’association intrinsèque de la réaction, mesure l’affinité intrinsèque de l’AC

pour l’Ag (stabilité du complexe)

II/- Les techniques d’immunoprécipitation :

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1. Précipitation en milieu liquide :

 Historique : 1897, ancien test quantitatif

 Repose sur 2 propriétés :
 Diffusion avec gradient de
concentration.
Qualitatif : Ring Test (Test à l’anneau)

 Précipitation au niveau de la zone

d’équivalence.
 Etapes :
1. On introduit d’abord une solution
d’antigène, puis par-dessus et sans
mélanger une solution d’anticorps
(sérum du patient).
(On peut faire le contraire, solution d’anticorps et
par-dessus une solution d’antigène ‘’selon ce qu’on
recherche’’)
2. L’antigène, au contact de l’anticorps
descend lentement (quelques minutes)
pour former un complexe Ag-AC à la
zone d’équilibre ‘’précipitation’’.
 La position de l’anneau indique la présence
de l’Ag ou de l’AC que l’on recherche.
1) Dans une cupule, on introduit une solution
d’antigène, puis par-dessus une solution
d’anticorps (sérum du patient) (on peut faire
le contraire, selon ce qu’on recherche dans le
Néphélémétrie ou Turbidimétrie

sérum du patient)
2) Un rayon laser traverse le tube contenant
des complexes immuns.
 Si pas de précipités : Pas de diffraction
Quantitatif :

de la lumière (elle traverse facilement le

tube).
 Plus il y’a de précipités Ag-AC plus il
y’aura diffraction de la lumière selon un
angle α par les complexes immuns (La
quantité de complexe immuns est
mesurée selon l’angle α).
 Méthode sensible et reproductible.
 C’est une technique automatisée.
 Permet le traitement de plusieurs
échantillons en simultané.

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2. Précipitation en milieu gélifié :

 On utilise la gélose comme milieu solide, dans lequel soit l’Ag soit l’AC soit les deux,
diffusent.
 Les gels les plus utilisée sont ceux issus d’une algue rouge marine : l’agar ou sa forme
purifiée l’agarose.

a) Les techniques non pulsées : (nous allons comprendre le terme pulsée/non pulsée par la suite)

 On utilise de la gélose à 1% non tamponnée.

 Immunodiffusion double ‘’Ag et AC’’.
 Dans une boite pétrie contenant de la gélose (milieu
gélifié), on creuse 2 trous (ou puits), dans un trou, on
pose les Ag, et dans l’autre les AC (sérum du patient)
(ou le contraire, selon ce qu’on recherche dans le sérum
du patient). On les laisse diffuser → zone
Méthode d’Ouchterlony ou immunodiffusion double

d’équivalence, où ils formeront des complexes.

 Identification des Ag et étude de l’identité
antigénique (ou les AC).
 Ainsi, si l’on introduit au centre de la gélose un (ou
des) anticorps connu(s) et à la périphérie des
antigènes, l’aspect du précipité renseignera sur les
relations existantes entre les Ag :
Qualitatives

Relation Relation de non Relation d’identité

d’identité totale identité partielle
Les lignes de Les lignes de Il y’a formation
précipitation se précipitation se d’un éperon ‘’les
continuent ‘’les croisent ‘’les Ag A et B
épitopes antigènes sont possèdent des
reconnus par reconnus par épitopes communs
les AC sont des anticorps (ils se ressemblent)
identiques’’. différents’’. donc l’AC reconnait
les deux’’.

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1) On utilise un gel contenant l’AC (ou Ag). On creuse un

trou (ou puits) dans lequel on introduit la protéine
qu’on veut doser (Ag ou AC).
2) Diffusion simple selon un gradient de concentration
Technique de Mancini (Immunodiffusion radiale simple)

décroissant, formation de complexes → formation

d’un cercle de précipitation.
3) Calcule du diamètre du cercle de précipitation (plus
le diamètre est grand plus il y’a d’Ag).
4) On trace la courbe d’étalonnage : l’établissement
d’une courbe étalon à partir de solutions contenant
des concentrations connues et croissantes d’Ag
Quantitatives

permet de préciser la concentration d’une solution

inconnu du même Ag par la simple mesure du
diamètre du cercle de précipitation.
5) Extrapolation de la valeur des échantillons
(extrapolation = ‫)اسقاط‬

 Cette méthode est éventuellement applicable aux AC

(Ig), nous permet le dosage des Ig et des fractions du
complément.

b) Techniques pulsées : application d’une force de migration un champ électrique, rendant

l’obtention du résultat plus rapide ‘’quelques heures’’ (contrairement aux techniques non
pulsées ou l’obtention du résultat peut aller jusqu’à 24 heures).

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(= double diffusion, auquel on applique un champ

électrique → plus rapide)
Technique d’électro-synérèse ou contre-immunoélectrophorèse

 Rapide, peu sensible

1) On utilise un gel non incorporé, on creuse
deux trous (ou puits), dans l’un on introduit
les Ag, dans l’autre les AC.
2) Ag et AC migrent rapidement à la rencontre
l’un de l’autre (double diffusion).
3) Au niveau des zones d’équivalence la réaction
Ag-AC conduit à la formation d’un arc de
précipitation.
 La migration est accélérée grâce à un courant
électrique à PH neutre ou légèrement alcalin,(les
Ag et les AC sont des protéines, qui en PH alcalin
ou neutre peuvent se comporter comme des
acides (-) ou des bases (+)) : Les anticorps chargés
négativement sont donc attirés par la cathode
sous l’effet du courant électroendosmose
Qualitative

(passage d'un liquide au travers d'une paroi ou

d'une membrane sous l'effet d'un champ
électrique), les antigènes sont attirés plutôt par
l’anode sous l’effet du courant électrique.
 Les résultats se lisent en 3 à 4 heures par une
immunoprécipitation située entre les 2 puits.
 Cette technique se fait en 2 temps qualitatifs :
Technique d’immunoélectrophorèse

1. Electrophorèse des sérums (échantillon

‘’sérum du patient’’ et control ‘’sérum sein’’)
(IEP) de Grabar Williams

afin de séparer les protéines selon leurs

charge et leurs poids moléculaire.
2. On ajoute des AC, d’où l’immunoprécipitation
par diffusion (formation de complexes
immuns) → Formation d’arcs de
précipitation.
 Intérêt :
 Identification des composants monoclonaux.
 Détecter les déficits en immunoglobulines.
 Sérologie (parasitologie).
 Contrôle de qualité (industrie).

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 Cette méthode est plus rapide (délai de résultat

court ‘’2 heures’’) et d’interprétation plus aisée
(plus facile) que l’immunoélectrophorèse pour le
diagnostic des immunoglobulines monoclonales
(apparition d’une bande homogène).
 Elle s’effectue en 2 temps qualitatifs :
1. Electrophorèse de 6 dépôts du même sérum
échantillon est réalisée sur gel d’agarose (La
première étape est identique à celle de
Technique d’immunofixation

l’immunoélectrophorèse. Elle consiste à

déposer les immunoglobulines contenues
dans le sérum ou les urines sur un gel ‘’6
dépôts’’, puis à séparer ces immunoglobulines
en fonction de leur mobilité électrophorétique
en les faisant migrer sous l’effet d’un champ
électrique. Cette migration dépend de la
masse et de la charge de l'antigène. Une fois
les immunoglobulines séparées, on peut
passer à l'étape suivante)
2. Après la migration, les 5 dernières pistes sont
recouvertes d’un immunosérum spécifique
‘’anti igG, A, M, ƙ et λ respectivement’’, la 1ère
piste est recouverte d’une solution de fixation
des protéines → on a la formation de
complexes [Anti-Ig-Ig] →
Immunoprécipitation.
 Intérêt : Identique de l’IEP.

1) On utilise un gel incluant les AC. Dans lequel

Technique d’électro-immuno-quantification de

on creuse un trou (ou puits) contenant les

Ag.
2) Electrophorèse à PH alcalin.
3) On a la formation d’arcs de précipitation (ou
fusées, rockets).
4) On calcule la hauteur des rockets.
Quantitative

5) On trace la courbe d’étalonnage.

Laurell

6) Extrapolation.

 Cette technique permet d’accélérer le temps de

diffusion en obligeant l’Ag à migrer sous l’effet
d’un champ électrique, dans un gel contenant
l’AC.
 Le PH du gel est choisi de façon que les AC soient
immobiles « Pi des Ig » et que l’Ag chargé
négativement migre « blocage des NH2,
carbamylation, formylation ».